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        溫和氣單胞菌高免血清制備初探

        2021-08-01 11:35:24成建江淑容程勇覃嘉豪廖長水李堂武
        中國畜禽種業(yè) 2021年7期
        關鍵詞:氫氧化鋁活苗菌液

        成建 江淑容 程勇 覃嘉豪 廖長水 李堂武

        (1,重慶市長壽區(qū)動物疫病預防控制中心 401220;2,重慶市長壽區(qū)畜禽品種改良站 401220;3,重慶市長壽區(qū)龍河鎮(zhèn)農業(yè)服務中心 401243;4,重慶市長壽區(qū)溫氏畜牧有限公司 401231;5,重慶市長水禽業(yè)發(fā)展有限責任公司 401243;6,重慶市長壽區(qū)瑞康寵物醫(yī)院 401220)

        溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria),又稱威隆氣單胞菌溫和生物型(A.veroniibv.sobria),是危害我國淡水養(yǎng)殖業(yè)的重要病原菌之一,能引起魚類、爬行類、兩棲類等冷血動物的出血性敗血癥[1]。80 年代以來,國外有些學者發(fā)現(xiàn),由此菌引起人胃腸炎和食物中毒,隨著對腸毒素研究的深入,腹瀉病人體內檢出此菌日益增多,以后又發(fā)現(xiàn)其可引起人的敗血癥、腹膜炎、中耳炎、角膜炎及其他化膿性疾病,是人獸共患病原菌[2]。目前,對溫和氣單胞菌疫苗研究已有不少報道,但對溫和氣單胞菌氫氧化鋁滅活苗研究甚少。本試驗在溫和氣單胞菌滅活加入氫氧化鋁佐劑制成氫氧化鋁滅活苗,免疫家兔,制備高免血清。用凝集試驗檢測抗體效價,為該菌的免疫學檢測及防治提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        溫和氣單胞菌菌株、普通肉湯培養(yǎng)基及馬丁瓊脂培養(yǎng)基、甲醛、氫氧化鋁、硫柳汞、12 只1.5~2kg 非免疫家兔。

        1.2 試驗器材

        SW-CJ-2FD 型雙人單面凈化工作臺、空氣浴振蕩器(HZQ-C 型)、冰箱(BCD—212 型)、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(PYX-DHS 型)、分光光度計(2100 型&UV-2100 型。

        1.3 方法

        (1)溫和氣單胞菌的培養(yǎng):將溫和氣單胞菌接種于馬丁瓊脂培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)24h,然后接種單個菌落于5ml 普通肉湯28℃振蕩培養(yǎng)24h,最后將普通肉湯菌液倒入100ml 錐形瓶普通肉湯中28℃振蕩培養(yǎng)24h。

        (2)溫和氣單胞菌液滅活:甲醛與菌液按0.4%的比例均勻混合在28℃振蕩培養(yǎng)24h,接種菌液于普通培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)24h 檢驗是否滅活,并用分光光度計檢驗此菌液OD 值。

        (3)氫氧化鋁滅活苗的制備:將氫氧化鋁佐劑和滅活菌液按1:4 的比例均勻混合制成滅活苗,分裝入無菌青霉素瓶子,4℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

        (4)免疫:取非免疫家兔12 只,隨機分成3 組,每組4只,按下列免疫程序進行免疫。

        試驗Ⅰ組:按照第1 天0.5ml、第14 天注射1.0ml、第28天注射1.5ml、第42 天注射2.0ml,分別采用頸部皮下注射氫氧化鋁滅活苗。

        試驗Ⅱ組:按照第1 天1.0ml、第14 天注射1.5ml、第28天注射2.0ml、第42 天注射2.5ml,分別采用頸部皮下注射氫氧化鋁滅活苗。

        對照組:同樣條件飼養(yǎng),不注射。

        (5)血清的分離與保存:試驗組和對照組分別在第一次、第二次、第三次免疫7d 后采取耳靜脈采血和第四次免疫14d后采取心臟采血,常溫下靜置,待血液完全凝固后置4℃冰箱過夜析出血清,按0.01%的比例加入硫柳汞防腐,充分混勻后按3ml 每瓶分裝到無菌青霉素瓶子,放置-20℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

        (6)檢測抗原的制備:將溫和氣單胞菌接種于5ml 普通肉湯,在28℃的條件下振蕩培養(yǎng)24h 后,將菌液轉入盛裝有50ml普通肉湯的三角燒瓶中,在28℃的條件下振蕩培養(yǎng)24h 取出。加入0.2ml 甲醛于50ml 菌液中振蕩培養(yǎng)24h,接種菌液于普通培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)24h 檢驗是否滅活,并用分光光度計檢驗此菌液濃度OD 值。分裝入無菌青霉素瓶子,放置4℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

        (7)高免血清效價的測定:采用凝集試驗檢測血清效價。

        待檢組:0.5%苯酚生理鹽水50ul 加被檢血清50ul 按照1:2,1:4,1:8.1:16……1:4096 的比例進行稀釋,最后一孔棄去50ul,再加上50ul 抗原。

        抗原對照組:分別加0.5%苯酚生理鹽水50ul 與抗原50ul。

        陰性對照組:分別加被檢血清50ul 與抗原50ul,3 組均在37℃下20min 觀察結果。

        2 試驗結果

        (1)本試驗所制備的疫苗和檢測抗原均無細菌生長,因此,本試驗制備的疫苗和檢測抗原已滅活。

        (2)本試驗制備的疫苗和檢測抗原OD 值在波長540nm 調整為1 (OD 值為1 細菌個數(shù)約為1×1010/ml)。

        (3)高免血清效價結果:各組分別在第一次、第二次、第三次免疫后7d 檢測抗體效價和第四次免疫后14d 檢測抗體效價。經4 次免疫后試驗Ⅰ組抗體效價為1:1024,試驗Ⅱ組抗體效價1:512,對照組沒有檢測到抗體效價。具體結果見表1、表2。

        表1 試驗Ⅰ組抗體效價結果

        表2 試驗Ⅱ組抗體效價結果

        結果判定:用“+”表示反應強度。

        #:液體完全透明,菌體完全被凝集呈傘狀沉于管底,振蕩時,沉淀物呈片狀、塊狀或顆粒狀。

        +++:液體略呈混濁,菌體大部分被凝集沉于管底,振蕩時情況如上。

        ++:液體不甚透明,管底有明顯的凝集沉淀,振蕩時有塊狀或小片絮狀物。

        +:液體透明度不明顯或不透明,有不甚顯著的沉淀或僅有沉淀的痕跡。

        -:液體不透明,管底無凝集,有時管底可見有一部分沉淀,但振蕩后立即散開呈均勻混勻。

        3 分析討論

        (1)本試驗用溫和氣單胞菌氫氧化鋁滅活苗免疫家兔制備高免血清,采用凝集試驗檢測溫和氣單胞菌抗體效價。采用兩種不同的免疫程序進行4 次免疫后,無菌分離血清,測得試驗Ⅰ組溫和氣單胞菌的效價為1∶1024。試驗Ⅱ組溫和氣單胞菌的效價為1∶512。對照組沒有檢測到溫和氣單胞菌抗體。從本試驗看,溫和氣單胞菌滅活苗能刺激家兔機體產生抗體,本試驗采用的免疫方法可以使這些物質刺激機體產生抗體。

        (2)從試驗結果可以看出,試驗Ⅰ組的效價比試驗Ⅱ組效價高,而試驗Ⅱ組的免疫劑量比試驗Ⅰ組免疫劑量大。按照常理是抗原劑量越大抗體滴度越高,存在這一結果的原因可能有家兔個體生理差異;試驗Ⅱ組的免疫劑量可能過大。

        (3)在實際生產中以往對溫和氣單胞菌的分離鑒定多采用生化實驗,操作技術煩瑣,項目多達幾十種,鑒定成本高昂,且觀察時間較長,常給實驗診斷帶來困難[3]。溫和氣單胞菌高免血清的制備為該菌的免疫學檢測及防治提供依據(jù)。

        (4)目前,檢測抗體的方法很多,如血凝及血凝抑制試驗、免疫熒光試驗、血清中和試驗等。但用96 孔“U”形微量反應板上進行凝集試驗所需設備簡單,操作方便、易行,凝集現(xiàn)象明顯,易于觀察。于是本次試驗在96 孔“U”形微量反應板上進行凝集試驗檢測血清抗體效價。

        4 結論

        從本試驗看,溫和氣單胞菌制備滅活苗后免疫家兔能產生抗體。試驗Ⅰ組的免疫劑量明顯小于試驗Ⅱ組,而試驗Ⅰ組的效價為1:1024,試驗Ⅱ組的效價為1:512,試驗Ⅱ組效價明顯小于試驗Ⅰ組效價,因此,我們認為試驗Ⅰ組的注射劑量更適合免疫。

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