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        基于海馬區(qū)BDNF的變化研究電針調(diào)控外源性NSCs治療PSCI的作用及機(jī)制

        2021-07-31 05:57:10陳吉祥張瑾張順喜王世雄任靜李國燕陳俊輝
        關(guān)鍵詞:電針海馬分化

        陳吉祥 張瑾 張順喜 王世雄 任靜 李國燕 陳俊輝

        廣州市第一人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科 510180

        卒中后認(rèn)知障礙(post-stroke cognitive impairment,PSCI)是指腦卒中后6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)達(dá)到認(rèn)知障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)的一系列綜合征[1]。國內(nèi)外相關(guān)研究顯示,腦卒中后47.30%~80.97%患者發(fā)生PSCI[2-3]。PSCI不僅影響腦卒中患者對(duì)外界環(huán)境的感知和適應(yīng)能力,同時(shí)嚴(yán)重阻礙患者運(yùn)動(dòng)、語言、吞咽等各方面功能的恢復(fù),成為制約腦卒中患者全面康復(fù)的關(guān)鍵因素[4]。目前,PSCI常用治療方法主要包括藥物療法以及認(rèn)知康復(fù)訓(xùn)練,雖然這些方法具有一定療效,但總體而言療效較有限,且對(duì)于重癥患者療效不佳[5-6]。近年,神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)移植有望成為改善PSCI、治療腦卒中的新技術(shù)[7]。但是,NSCs移植存在細(xì)胞存活率低,向損傷部位遷移和分化不足的問題,如何調(diào)控NSCs并闡明其作用機(jī)制對(duì)NSCs移植改善PSCI、治療腦卒中具有重要科學(xué)意義[8]。前期研究表明,電針可促進(jìn)大腦中動(dòng)脈閉塞模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠海馬區(qū)內(nèi)源性NSCs的增殖和分化改善PSCI[9],表明電針具有調(diào)節(jié)內(nèi)源性NSCs作用,那么,電針是否能通過調(diào)節(jié)外源性NSCs向認(rèn)知相關(guān)腦區(qū)遷移和分化治療PSCI?此外,微環(huán)境對(duì)NSCs的存活、遷移和分化至關(guān)重要[10],而我們前期研究也表明,電針具有調(diào)節(jié)NSCs微環(huán)境中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)作用[11],那么電針是否基于調(diào)節(jié)BDNF從而調(diào)控外源性NSCs的遷移和分化?本研究擬通過認(rèn)知評(píng)估和蛋白檢測(cè)技術(shù)等初步探討該科學(xué)問題,以期為改善PSCI、促進(jìn)腦卒中患者全面康復(fù)提供電針+NSCs移植這一新的治療技術(shù)和理論支持。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑和儀器BDNF抗體(Abcam);二氨基聯(lián)苯胺(DAB)免疫組化試劑盒(福州邁新生物科技有限公司);β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體以及辣根過氧化物酶二抗(Cell Signaling Technology,USA);Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所);Image-lab圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組雄性健康成年無特殊病原體(SPF)級(jí)SD大鼠,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司提供,體質(zhì)量(230±20)g,6~8周齡,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。參照此前發(fā)表文章中所采用的改良Zea Longa方法[12],制備左側(cè)MCAO:大鼠稱重后,用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉,仰臥位固定、消毒、備皮,切開頸部正中皮膚,充分暴露并鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈。在頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈,在近心端結(jié)扎頸總動(dòng)脈。用動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈,然后在頸總動(dòng)脈結(jié)扎處遠(yuǎn)端約3 mm處剪一小口,將備好的線栓經(jīng)切口導(dǎo)入18~22 mm,撤去頸內(nèi)動(dòng)脈血管夾,緩慢推動(dòng)栓線至大腦前動(dòng)脈近端。固定栓線,縫合傷口,待缺血2 h后回抽栓線至頸總動(dòng)脈分叉處,形成缺血再灌注模型。動(dòng)物蘇醒后觀察其體態(tài)及行為,按Zea Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)動(dòng)物的行為變化以判斷MCAO是否成功。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:無神經(jīng)功能缺失癥狀為0分;提尾倒懸時(shí)不能完全伸展右側(cè)前爪為1分;行走時(shí)向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈(向右側(cè)轉(zhuǎn)圈)為2分;行走時(shí)向右側(cè)傾倒為3分;不能自發(fā)行走,意識(shí)喪失評(píng)分為4分。評(píng)分為1~3分納入實(shí)驗(yàn),剔除0分、4分。共成功制備24只MCAO。將大鼠配對(duì)分為3組:模型組(8只)、NSCs移植組(8只)、電針+NSCs移植組(8只);由于造模后部分大鼠死亡,最終各組取6只大鼠進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

        1.3 干預(yù)措施模型組只給予同等條件下飼養(yǎng)以及抓取固定,不給予其他治療。NSCs移植組以及電針+NSCs移植組在造模術(shù)后第2天行NSCs移植治療,其中NSCs移植組在NSCs移植后予同等條件下飼養(yǎng)以及抓取固定,電針+NSCs移植組在NSCs移植組基礎(chǔ)上聯(lián)合行電針治療。電針參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[13]取大鼠百會(huì)穴,使用華佗牌30號(hào)0.5寸毫針,G6805電針儀,電壓峰值6 V,以針體輕輕抖動(dòng)為度,疏密波,頻率1~20 Hz,20 min/次,1次/d,共電針治療7 d。參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道方法行NSCs分離、培養(yǎng)和移植[14]:取新生3 d的SD大鼠用于提取NSCs,將其喂養(yǎng)14 d后,10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉,無菌條件下處死后取鼠腦,解剖顯微鏡下剝除腦膜、腦血管后,得到大腦海馬組織,置于Hank’s液漂洗剪碎,機(jī)械吹打后形成細(xì)胞懸液。16 000 r/min,離心半徑7.2 cm,離心5 min棄上清液,選取沉淀物繼續(xù)吹打形成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×109/L后,將其接種于25 ml無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)。滴入含20 μg/L的表皮生長因子+20 μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子+2% B27 DMEM/F12培養(yǎng)基后,置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2下培養(yǎng),每3 d換液1次,至第10天細(xì)胞開始傳代。選取傳代后細(xì)胞接種于已涂5%多聚賴氨酸蓋玻片培養(yǎng)板上,待細(xì)胞貼壁置于磷酸鹽緩沖液洗5 min,免疫細(xì)胞化學(xué)法(ABC法)染色測(cè)定,將1:100濃度巢蛋白(nestin)抗體溶液測(cè)得陽性細(xì)胞作為NSCs。移植組大鼠造模成功后第2天進(jìn)行NSCs移植,常規(guī)麻醉仰臥固定于手術(shù)臺(tái),選擇腦立體定位儀對(duì)大鼠左側(cè)腦室進(jìn)行定位,坐標(biāo)零點(diǎn)為前囟(Bregma)點(diǎn),AP=0.0 mm,ML=2.0 mm,DV=4.5 mm。微量注射器0.15 μl/s注入10 μl的NSCs,細(xì)胞濃度為2×1010/L,注射結(jié)束后留針20 min后拔出,電針+NSCs移植組選擇相同方法移植。

        1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)參照我們此前發(fā)表文章中所采用的方法[12],各組大鼠在造模手術(shù)后4~8 d進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn):其中術(shù)后4~7 d連續(xù)4 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn),觀察其逃避潛伏期和游泳路徑,評(píng)估大鼠的學(xué)習(xí)能力,4次/d,術(shù)后第8天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn),觀察規(guī)定時(shí)間內(nèi)大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù),評(píng)估大鼠的空間記憶能力。具體實(shí)驗(yàn)包括:(1)定位航行實(shí)驗(yàn)。將大鼠按順時(shí)針方向依次由第一象限、第二象限、第三象限、第四象限入水點(diǎn)順序面向池壁放入水中。記錄90 s內(nèi)尋找平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)。如果大鼠在90 s內(nèi)找到平臺(tái),并停留3 s以上,記錄90 s內(nèi)實(shí)際逃避潛伏期;如果在90 s內(nèi)未找到平臺(tái),由實(shí)驗(yàn)者將其引上平臺(tái)并停留10 s,逃避潛伏期記錄為90 s。(2)空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束后,次日進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。撤去平臺(tái),然后選第一象限與定位航行實(shí)驗(yàn)相同的入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中,分別記錄90 s內(nèi)大鼠穿越原平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)。Morris水迷宮監(jiān)測(cè)全過程通過安裝在Morris水迷宮上方的攝像機(jī)傳入電腦并記錄和儲(chǔ)存,再運(yùn)用行為軌跡跟蹤系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析和數(shù)據(jù)處理。

        1.5 實(shí)驗(yàn)取材及蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)取左側(cè)海馬組織置于液氮罐中速凍,再置于-80℃冰箱保存。1 ml裂解緩沖液和10 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)儲(chǔ)存液裂解100 mg左側(cè)海馬組織,充分研磨后離心,吸取上清。二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定法測(cè)定蛋白濃度。樣品蛋白變性后,取50 μg樣品蛋白經(jīng)12%十二烷基硫磺胺-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜后,用封閉液封閉2 h,分別用BDNF、β-actin一抗(1∶1 000)孵育,4℃過夜,TBST洗膜后,用辣根過氧化物標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。將PVDF膜放圖像掃描儀上,避光配置顯色液并覆蓋PVDF膜,Image-lab圖像分析系統(tǒng)分析處理。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用單因素方差分析,所有數(shù)據(jù)均滿足方差齊性(P>0.05),兩兩比較采用LSD法;以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估學(xué)習(xí)記憶功能的結(jié)果與模型組相比,NSCs移植組大鼠逃避潛伏期時(shí)間縮短,表明NSCs移植組大鼠的學(xué)習(xí)能力較模型組大鼠提高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);與NSCs移植組及模型組相比,電針+NSCs移植組大鼠逃避潛伏期時(shí)間縮短,表明電針+NSCs移植組大鼠較NSCs移植組大鼠學(xué)習(xí)能力更佳,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與模型組相比,NSCs移植組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)增加,表明NSCs移植組大鼠的記憶能力較模型組大鼠提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與NSCs移植組及模型組相比,電針+NSCs移植組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)增加,表明電針+NSCs移植組大鼠較NSCs移植組大鼠記憶能力更好,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

        表1 大腦中動(dòng)脈閉塞模型大鼠逃避潛伏期及跨越平臺(tái)次數(shù)比較()

        表1 大腦中動(dòng)脈閉塞模型大鼠逃避潛伏期及跨越平臺(tái)次數(shù)比較()

        注:模型組大鼠給予基礎(chǔ)飼養(yǎng)以及同等條件抓取固定,NSCs移植組采用NSCs移植治療,電針+NSCs移植組在NSCs移植基礎(chǔ)上行電針百會(huì)穴治療;NSCs為神經(jīng)干細(xì)胞;與模型組相比,aP<0.05,bP<0.01;與NSCs移植組及模型組相比,cP<0.05

        逃避潛伏期(s)穿越平臺(tái)次數(shù)(次)0.98±0.32 1.76±0.46b 2.28±0.35c組別模型組NSCs移植組電針+NSCs移植組只數(shù)第4天80.26±6.57 69.89±9.18a 58.56±8.64c 6 6 6第5天72.43±9.30 53.67±8.54a 50.66±9.20c第6天66.85±8.79 44.53±7.45b 39.43±7.39c第7天58.54±7.21 36.67±8.43b 29.76±6.32c

        2.2 Western blot檢測(cè)大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白表達(dá)的結(jié)果NSCs移植組大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白表達(dá)量為(0.92±0.22),與模型組(0.86±0.25)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);電針+NSCs移植組大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白表達(dá)量為(1.45±0.35),明顯高于NSCs移植組(0.92±0.22)、模型組(0.86±0.25),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);表明電針+NSCs移植可增加大鼠海馬區(qū)BDNF表達(dá)。見圖1。

        圖1 大腦中動(dòng)脈閉塞模型大鼠大腦海馬區(qū)BDNF蛋白表達(dá)印記

        3 討 論

        NSCs是一種具有自我更新和分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞能力的細(xì)胞,主要發(fā)現(xiàn)于成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特定區(qū)域如海馬齒狀回室管膜下區(qū)(SGZ)和側(cè)腦室顆粒下區(qū)(SVZ)[15]。相關(guān)研究已明確NSCs對(duì)細(xì)胞分化、免疫調(diào)節(jié)、炎癥和內(nèi)源性修復(fù)過程(例如血管生成和神經(jīng)發(fā)生)的影響[16-18]。進(jìn)一步,研究人員利用NSCs移植改善卒中模型鼠的缺損功能,發(fā)現(xiàn)NSCs移植后大鼠的運(yùn)動(dòng)功能、學(xué)習(xí)記憶能力有一定的提高,并探索了不同移植方式、移植位點(diǎn)對(duì)移植效果影響的問題[19-20]。在這些前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,2016年《柳葉刀》發(fā)表了1篇首次應(yīng)用NSCs移植治療腦卒中的1期臨床研究文章,該研究采用手術(shù)方式將NSCs移植到11例腦梗死患者大腦病灶周邊區(qū)域,結(jié)果表明NSCs移植沒有誘發(fā)任何不良事件,且患者的神經(jīng)功能得到改善,研究結(jié)果支持進(jìn)一步應(yīng)用NSCs移植治療腦卒中[21]。我們?cè)谠搶?shí)驗(yàn)中亦證實(shí),與模型組大鼠相比,NSCs移植組大鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期時(shí)間縮短,表明NSCs移植組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力有所提高。綜合相關(guān)研究結(jié)果表明,NSCs移植有望成為改善PSCI、治療腦卒中的新技術(shù)。

        但是,NSCs移植存在細(xì)胞存活率低,向損傷部位遷移和分化不足的問題。如將NSCs移植至腦梗死中心區(qū),2周后幾乎沒有NSCs存活,將NSCs移植至腦梗死區(qū)周邊區(qū)域時(shí),其存活率僅為30%,且存在遷移和分化不足問題。這些因素限制了該技術(shù)的臨床應(yīng)用,因此,早期有研究指出如何促進(jìn)NSCs移植細(xì)胞的存活、增殖、遷移和定向分化成為NSCs移植的關(guān)鍵[7-8]。

        目前,NSCs的調(diào)控主要有2種思路,一種是增加NSCs自身的存活及增殖分化能力,主要通過基因修飾及藥物預(yù)處理等,這樣可以促進(jìn)移植的NSCs在缺血、缺氧環(huán)境下的存活率[22]。另一種是改善腦缺血后的NSCs生存微環(huán)境(ME)[23]。所謂ME,在結(jié)構(gòu)上,包括微血管、血管周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、神經(jīng)前體細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等,在功能上,包含這些細(xì)胞或成分所分泌的各種因子及與神經(jīng)干/前體細(xì)胞之間的相互交融與作用[24]。腦缺血后,局部ME遭到破壞,如血腦屏障損害、微血管通透性改變、結(jié)構(gòu)紊亂、基底膜降解及多因子表達(dá)異常等,限制了NSCs存活、增殖、遷移和分化[7]。前一種思路類似于改善NSCs的“種子”思路,后一種思路類似于改善NSCs的“土壤”。目前對(duì)2種思路均進(jìn)行了大量有益的探索,但離突破性的進(jìn)展尚遠(yuǎn)。我們的這項(xiàng)研究表明,電針可能具備改善NSCs的“土壤”作用。

        電針是一種結(jié)合我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中經(jīng)絡(luò)學(xué)說和現(xiàn)代生物電理論的臨床應(yīng)用技術(shù),既可以調(diào)節(jié)經(jīng)氣,疏通氣血,又是一種脈沖電場,故具有針刺和電場的雙重作用,目前已廣泛應(yīng)用于臨床治療腦血管疾病和科學(xué)研究。此前,我們通過激光共聚焦技術(shù)發(fā)現(xiàn),電針能夠促進(jìn)MCAO大鼠海馬區(qū)內(nèi)源性NSCs的增殖和分化[9]。海馬區(qū)與靈長類動(dòng)物和嚙齒類動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶功能密切相關(guān),常被用來作為探究正常、病理情況模型研究,包括對(duì)學(xué)習(xí)記憶障礙的研究。腦缺血后會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)腦部萎縮、皮質(zhì)變薄、神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生病理性變化,當(dāng)這些情況發(fā)生在海馬等與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的腦區(qū)時(shí),便會(huì)出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙[25]。因此,我們此前的這項(xiàng)研究表明,電針可作為一種干細(xì)胞調(diào)控技術(shù),通過誘導(dǎo)海馬區(qū)內(nèi)源性NSCs的增殖和分化從而改善認(rèn)知功能。在本實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn),與NSCs移植組及模型組相比,電針+NSCs移植組大鼠逃避潛伏期時(shí)間縮短,表明電針可進(jìn)一步增強(qiáng)NSCs移植治療PSCI的效果。此外,我們?cè)谠撗芯恐邪l(fā)現(xiàn),與NSCs移植組及模型組相比,電針+NSCs移植組大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白表達(dá)顯著增多。由于BDNF是NSCs微環(huán)境中促進(jìn)NSCs增殖和分化的關(guān)鍵因子,它通過與NSCs的酪氨酸受體激酶B(TrkB)結(jié)合促進(jìn)NSCs增殖和分化。因此我們認(rèn)為,電針可能基于調(diào)節(jié)海馬區(qū)BDNF的表達(dá)調(diào)控外源性NSCs從而改善PSCI。

        但是,限于本實(shí)驗(yàn)為初步實(shí)驗(yàn),機(jī)制研究尚不深入,一方面并未對(duì)移植的NSCs進(jìn)行標(biāo)記示蹤及進(jìn)一步的增殖分化分析,尚不能回答電針調(diào)控移植的NSCs增殖分化程度以及遷移路徑;另一方面,如前所述,NSCs的移植成功依賴于良好的干細(xì)胞生存微環(huán)境,這些微環(huán)境包括各種細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的結(jié)構(gòu)以及相關(guān)細(xì)胞因子。本實(shí)驗(yàn)初步發(fā)現(xiàn)電針促進(jìn)大鼠海馬區(qū)微環(huán)境中BDNF表達(dá),但是對(duì)于電針是否對(duì)NSCs微環(huán)境其他因子以及相關(guān)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響尚不清楚。

        綜上,結(jié)合相關(guān)研究及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們認(rèn)為電針可能調(diào)節(jié)海馬區(qū)BDNF的表達(dá)調(diào)控外源性NSCs從而改善PSCI。但限于初步探索,本實(shí)驗(yàn)的機(jī)制研究尚不深入。下一步,我們將采取NSCs示蹤技術(shù)以及免疫熒光技術(shù)深入探討電針如何調(diào)控移植的NSCs遷移以及增殖分化治療PSCI,并全面評(píng)估電針對(duì)NSCs微環(huán)境因子以及結(jié)構(gòu)的影響,并確定兩者的關(guān)系,從而為治療PSCI、促進(jìn)腦卒中患者全面康復(fù)提供新的治療技術(shù)和理論支持。

        利益沖突:作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。

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