陳吉祥 張瑾 張順喜 王世雄 任靜 李國燕 陳俊輝

廣州市第一人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科 510180

卒中后認(rèn)知障礙（post-stroke cognitive impairment，PSCI）是指腦卒中后6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)達(dá)到認(rèn)知障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)的一系列綜合征［1］。國內(nèi)外相關(guān)研究顯示，腦卒中后47.30%～80.97%患者發(fā)生PSCI［2-3］。PSCI不僅影響腦卒中患者對(duì)外界環(huán)境的感知和適應(yīng)能力，同時(shí)嚴(yán)重阻礙患者運(yùn)動(dòng)、語言、吞咽等各方面功能的恢復(fù)，成為制約腦卒中患者全面康復(fù)的關(guān)鍵因素［4］。目前，PSCI常用治療方法主要包括藥物療法以及認(rèn)知康復(fù)訓(xùn)練，雖然這些方法具有一定療效，但總體而言療效較有限，且對(duì)于重癥患者療效不佳［5-6］。近年，神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）移植有望成為改善PSCI、治療腦卒中的新技術(shù)［7］。但是，NSCs移植存在細(xì)胞存活率低，向損傷部位遷移和分化不足的問題，如何調(diào)控NSCs并闡明其作用機(jī)制對(duì)NSCs移植改善PSCI、治療腦卒中具有重要科學(xué)意義［8］。前期研究表明，電針可促進(jìn)大腦中動(dòng)脈閉塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠海馬區(qū)內(nèi)源性NSCs的增殖和分化改善PSCI［9］，表明電針具有調(diào)節(jié)內(nèi)源性NSCs作用，那么，電針是否能通過調(diào)節(jié)外源性NSCs向認(rèn)知相關(guān)腦區(qū)遷移和分化治療PSCI？此外，微環(huán)境對(duì)NSCs的存活、遷移和分化至關(guān)重要［10］，而我們前期研究也表明，電針具有調(diào)節(jié)NSCs微環(huán)境中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）作用［11］，那么電針是否基于調(diào)節(jié)BDNF從而調(diào)控外源性NSCs的遷移和分化？本研究擬通過認(rèn)知評(píng)估和蛋白檢測(cè)技術(shù)等初步探討該科學(xué)問題，以期為改善PSCI、促進(jìn)腦卒中患者全面康復(fù)提供電針+NSCs移植這一新的治療技術(shù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器BDNF抗體（Abcam）；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）免疫組化試劑盒（福州邁新生物科技有限公司）；β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體以及辣根過氧化物酶二抗（Cell Signaling Technology，USA）；Morris水迷宮（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）；Image-lab圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組雄性健康成年無特殊病原體（SPF）級(jí)SD大鼠，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司提供，體質(zhì)量（230±20）g，6～8周齡，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。參照此前發(fā)表文章中所采用的改良Zea Longa方法［12］，制備左側(cè)MCAO：大鼠稱重后，用10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔麻醉，仰臥位固定、消毒、備皮，切開頸部正中皮膚，充分暴露并鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈。在頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈，在近心端結(jié)扎頸總動(dòng)脈。用動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，然后在頸總動(dòng)脈結(jié)扎處遠(yuǎn)端約3 mm處剪一小口，將備好的線栓經(jīng)切口導(dǎo)入18～22 mm，撤去頸內(nèi)動(dòng)脈血管夾，緩慢推動(dòng)栓線至大腦前動(dòng)脈近端。固定栓線，縫合傷口，待缺血2 h后回抽栓線至頸總動(dòng)脈分叉處，形成缺血再灌注模型。動(dòng)物蘇醒后觀察其體態(tài)及行為，按Zea Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)動(dòng)物的行為變化以判斷MCAO是否成功。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：無神經(jīng)功能缺失癥狀為0分；提尾倒懸時(shí)不能完全伸展右側(cè)前爪為1分；行走時(shí)向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈（向右側(cè)轉(zhuǎn)圈）為2分；行走時(shí)向右側(cè)傾倒為3分；不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失評(píng)分為4分。評(píng)分為1～3分納入實(shí)驗(yàn)，剔除0分、4分。共成功制備24只MCAO。將大鼠配對(duì)分為3組：模型組（8只）、NSCs移植組（8只）、電針+NSCs移植組（8只）；由于造模后部分大鼠死亡，最終各組取6只大鼠進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 干預(yù)措施模型組只給予同等條件下飼養(yǎng)以及抓取固定，不給予其他治療。NSCs移植組以及電針+NSCs移植組在造模術(shù)后第2天行NSCs移植治療，其中NSCs移植組在NSCs移植后予同等條件下飼養(yǎng)以及抓取固定，電針+NSCs移植組在NSCs移植組基礎(chǔ)上聯(lián)合行電針治療。電針參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［13］取大鼠百會(huì)穴，使用華佗牌30號(hào)0.5寸毫針，G6805電針儀，電壓峰值6 V，以針體輕輕抖動(dòng)為度，疏密波，頻率1～20 Hz，20 min/次，1次/d，共電針治療7 d。參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道方法行NSCs分離、培養(yǎng)和移植［14］：取新生3 d的SD大鼠用于提取NSCs，將其喂養(yǎng)14 d后，10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射進(jìn)行麻醉，無菌條件下處死后取鼠腦，解剖顯微鏡下剝除腦膜、腦血管后，得到大腦海馬組織，置于Hank’s液漂洗剪碎，機(jī)械吹打后形成細(xì)胞懸液。16 000 r/min，離心半徑7.2 cm，離心5 min棄上清液，選取沉淀物繼續(xù)吹打形成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×109/L后，將其接種于25 ml無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)。滴入含20 μg/L的表皮生長因子+20 μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子+2% B27 DMEM/F12培養(yǎng)基后，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2下培養(yǎng)，每3 d換液1次，至第10天細(xì)胞開始傳代。選取傳代后細(xì)胞接種于已涂5%多聚賴氨酸蓋玻片培養(yǎng)板上，待細(xì)胞貼壁置于磷酸鹽緩沖液洗5 min，免疫細(xì)胞化學(xué)法（ABC法）染色測(cè)定，將1：100濃度巢蛋白（nestin）抗體溶液測(cè)得陽性細(xì)胞作為NSCs。移植組大鼠造模成功后第2天進(jìn)行NSCs移植，常規(guī)麻醉仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，選擇腦立體定位儀對(duì)大鼠左側(cè)腦室進(jìn)行定位，坐標(biāo)零點(diǎn)為前囟（Bregma）點(diǎn)，AP＝0.0 mm，ML＝2.0 mm，DV＝4.5 mm。微量注射器0.15 μl/s注入10 μl的NSCs，細(xì)胞濃度為2×1010/L，注射結(jié)束后留針20 min后拔出，電針+NSCs移植組選擇相同方法移植。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)參照我們此前發(fā)表文章中所采用的方法［12］，各組大鼠在造模手術(shù)后4～8 d進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：其中術(shù)后4～7 d連續(xù)4 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，觀察其逃避潛伏期和游泳路徑，評(píng)估大鼠的學(xué)習(xí)能力，4次/d，術(shù)后第8天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，觀察規(guī)定時(shí)間內(nèi)大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)，評(píng)估大鼠的空間記憶能力。具體實(shí)驗(yàn)包括：（1）定位航行實(shí)驗(yàn)。將大鼠按順時(shí)針方向依次由第一象限、第二象限、第三象限、第四象限入水點(diǎn)順序面向池壁放入水中。記錄90 s內(nèi)尋找平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期）。如果大鼠在90 s內(nèi)找到平臺(tái)，并停留3 s以上，記錄90 s內(nèi)實(shí)際逃避潛伏期；如果在90 s內(nèi)未找到平臺(tái)，由實(shí)驗(yàn)者將其引上平臺(tái)并停留10 s，逃避潛伏期記錄為90 s。（2）空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束后，次日進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。撤去平臺(tái)，然后選第一象限與定位航行實(shí)驗(yàn)相同的入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，分別記錄90 s內(nèi)大鼠穿越原平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)。Morris水迷宮監(jiān)測(cè)全過程通過安裝在Morris水迷宮上方的攝像機(jī)傳入電腦并記錄和儲(chǔ)存，再運(yùn)用行為軌跡跟蹤系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析和數(shù)據(jù)處理。

1.5 實(shí)驗(yàn)取材及蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)取左側(cè)海馬組織置于液氮罐中速凍，再置于-80℃冰箱保存。1 ml裂解緩沖液和10 μl苯甲基磺酰氟（PMSF）儲(chǔ)存液裂解100 mg左側(cè)海馬組織，充分研磨后離心，吸取上清。二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定法測(cè)定蛋白濃度。樣品蛋白變性后，取50 μg樣品蛋白經(jīng)12%十二烷基硫磺胺-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜后，用封閉液封閉2 h，分別用BDNF、β-actin一抗（1∶1 000）孵育，4℃過夜，TBST洗膜后，用辣根過氧化物標(biāo)記的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h。將PVDF膜放圖像掃描儀上，避光配置顯色液并覆蓋PVDF膜，Image-lab圖像分析系統(tǒng)分析處理。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)均滿足方差齊性（P＞0.05），兩兩比較采用LSD法；以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估學(xué)習(xí)記憶功能的結(jié)果與模型組相比，NSCs移植組大鼠逃避潛伏期時(shí)間縮短，表明NSCs移植組大鼠的學(xué)習(xí)能力較模型組大鼠提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與NSCs移植組及模型組相比，電針+NSCs移植組大鼠逃避潛伏期時(shí)間縮短，表明電針+NSCs移植組大鼠較NSCs移植組大鼠學(xué)習(xí)能力更佳，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與模型組相比，NSCs移植組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)增加，表明NSCs移植組大鼠的記憶能力較模型組大鼠提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與NSCs移植組及模型組相比，電針+NSCs移植組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)增加，表明電針+NSCs移植組大鼠較NSCs移植組大鼠記憶能力更好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 大腦中動(dòng)脈閉塞模型大鼠逃避潛伏期及跨越平臺(tái)次數(shù)比較（）

表1 大腦中動(dòng)脈閉塞模型大鼠逃避潛伏期及跨越平臺(tái)次數(shù)比較（）

注：模型組大鼠給予基礎(chǔ)飼養(yǎng)以及同等條件抓取固定，NSCs移植組采用NSCs移植治療，電針+NSCs移植組在NSCs移植基礎(chǔ)上行電針百會(huì)穴治療；NSCs為神經(jīng)干細(xì)胞；與模型組相比，aP＜0.05，bP＜0.01；與NSCs移植組及模型組相比，cP＜0.05

逃避潛伏期（s）穿越平臺(tái)次數(shù)（次）0.98±0.32 1.76±0.46b 2.28±0.35c組別模型組NSCs移植組電針+NSCs移植組只數(shù)第4天80.26±6.57 69.89±9.18a 58.56±8.64c 6 6 6第5天72.43±9.30 53.67±8.54a 50.66±9.20c第6天66.85±8.79 44.53±7.45b 39.43±7.39c第7天58.54±7.21 36.67±8.43b 29.76±6.32c

2.2 Western blot檢測(cè)大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白表達(dá)的結(jié)果NSCs移植組大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白表達(dá)量為（0.92±0.22），與模型組（0.86±0.25）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；電針+NSCs移植組大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白表達(dá)量為（1.45±0.35），明顯高于NSCs移植組（0.92±0.22）、模型組（0.86±0.25），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；表明電針+NSCs移植可增加大鼠海馬區(qū)BDNF表達(dá)。見圖1。

圖1 大腦中動(dòng)脈閉塞模型大鼠大腦海馬區(qū)BDNF蛋白表達(dá)印記

3 討 論

NSCs是一種具有自我更新和分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞能力的細(xì)胞，主要發(fā)現(xiàn)于成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特定區(qū)域如海馬齒狀回室管膜下區(qū)（SGZ）和側(cè)腦室顆粒下區(qū)（SVZ）［15］。相關(guān)研究已明確NSCs對(duì)細(xì)胞分化、免疫調(diào)節(jié)、炎癥和內(nèi)源性修復(fù)過程（例如血管生成和神經(jīng)發(fā)生）的影響［16-18］。進(jìn)一步，研究人員利用NSCs移植改善卒中模型鼠的缺損功能，發(fā)現(xiàn)NSCs移植后大鼠的運(yùn)動(dòng)功能、學(xué)習(xí)記憶能力有一定的提高，并探索了不同移植方式、移植位點(diǎn)對(duì)移植效果影響的問題［19-20］。在這些前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，2016年《柳葉刀》發(fā)表了1篇首次應(yīng)用NSCs移植治療腦卒中的1期臨床研究文章，該研究采用手術(shù)方式將NSCs移植到11例腦梗死患者大腦病灶周邊區(qū)域，結(jié)果表明NSCs移植沒有誘發(fā)任何不良事件，且患者的神經(jīng)功能得到改善，研究結(jié)果支持進(jìn)一步應(yīng)用NSCs移植治療腦卒中［21］。我們?cè)谠搶?shí)驗(yàn)中亦證實(shí)，與模型組大鼠相比，NSCs移植組大鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期時(shí)間縮短，表明NSCs移植組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力有所提高。綜合相關(guān)研究結(jié)果表明，NSCs移植有望成為改善PSCI、治療腦卒中的新技術(shù)。

但是，NSCs移植存在細(xì)胞存活率低，向損傷部位遷移和分化不足的問題。如將NSCs移植至腦梗死中心區(qū)，2周后幾乎沒有NSCs存活，將NSCs移植至腦梗死區(qū)周邊區(qū)域時(shí)，其存活率僅為30%，且存在遷移和分化不足問題。這些因素限制了該技術(shù)的臨床應(yīng)用，因此，早期有研究指出如何促進(jìn)NSCs移植細(xì)胞的存活、增殖、遷移和定向分化成為NSCs移植的關(guān)鍵［7-8］。

目前，NSCs的調(diào)控主要有2種思路，一種是增加NSCs自身的存活及增殖分化能力，主要通過基因修飾及藥物預(yù)處理等，這樣可以促進(jìn)移植的NSCs在缺血、缺氧環(huán)境下的存活率［22］。另一種是改善腦缺血后的NSCs生存微環(huán)境（ME）［23］。所謂ME，在結(jié)構(gòu)上，包括微血管、血管周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、神經(jīng)前體細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等，在功能上，包含這些細(xì)胞或成分所分泌的各種因子及與神經(jīng)干/前體細(xì)胞之間的相互交融與作用［24］。腦缺血后，局部ME遭到破壞，如血腦屏障損害、微血管通透性改變、結(jié)構(gòu)紊亂、基底膜降解及多因子表達(dá)異常等，限制了NSCs存活、增殖、遷移和分化［7］。前一種思路類似于改善NSCs的“種子”思路，后一種思路類似于改善NSCs的“土壤”。目前對(duì)2種思路均進(jìn)行了大量有益的探索，但離突破性的進(jìn)展尚遠(yuǎn)。我們的這項(xiàng)研究表明，電針可能具備改善NSCs的“土壤”作用。

電針是一種結(jié)合我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中經(jīng)絡(luò)學(xué)說和現(xiàn)代生物電理論的臨床應(yīng)用技術(shù)，既可以調(diào)節(jié)經(jīng)氣，疏通氣血，又是一種脈沖電場，故具有針刺和電場的雙重作用，目前已廣泛應(yīng)用于臨床治療腦血管疾病和科學(xué)研究。此前，我們通過激光共聚焦技術(shù)發(fā)現(xiàn)，電針能夠促進(jìn)MCAO大鼠海馬區(qū)內(nèi)源性NSCs的增殖和分化［9］。海馬區(qū)與靈長類動(dòng)物和嚙齒類動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶功能密切相關(guān)，常被用來作為探究正常、病理情況模型研究，包括對(duì)學(xué)習(xí)記憶障礙的研究。腦缺血后會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)腦部萎縮、皮質(zhì)變薄、神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生病理性變化，當(dāng)這些情況發(fā)生在海馬等與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的腦區(qū)時(shí)，便會(huì)出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙［25］。因此，我們此前的這項(xiàng)研究表明，電針可作為一種干細(xì)胞調(diào)控技術(shù)，通過誘導(dǎo)海馬區(qū)內(nèi)源性NSCs的增殖和分化從而改善認(rèn)知功能。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，與NSCs移植組及模型組相比，電針+NSCs移植組大鼠逃避潛伏期時(shí)間縮短，表明電針可進(jìn)一步增強(qiáng)NSCs移植治療PSCI的效果。此外，我們?cè)谠撗芯恐邪l(fā)現(xiàn)，與NSCs移植組及模型組相比，電針+NSCs移植組大鼠海馬區(qū)BDNF蛋白表達(dá)顯著增多。由于BDNF是NSCs微環(huán)境中促進(jìn)NSCs增殖和分化的關(guān)鍵因子，它通過與NSCs的酪氨酸受體激酶B（TrkB）結(jié)合促進(jìn)NSCs增殖和分化。因此我們認(rèn)為，電針可能基于調(diào)節(jié)海馬區(qū)BDNF的表達(dá)調(diào)控外源性NSCs從而改善PSCI。

但是，限于本實(shí)驗(yàn)為初步實(shí)驗(yàn)，機(jī)制研究尚不深入，一方面并未對(duì)移植的NSCs進(jìn)行標(biāo)記示蹤及進(jìn)一步的增殖分化分析，尚不能回答電針調(diào)控移植的NSCs增殖分化程度以及遷移路徑；另一方面，如前所述，NSCs的移植成功依賴于良好的干細(xì)胞生存微環(huán)境，這些微環(huán)境包括各種細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的結(jié)構(gòu)以及相關(guān)細(xì)胞因子。本實(shí)驗(yàn)初步發(fā)現(xiàn)電針促進(jìn)大鼠海馬區(qū)微環(huán)境中BDNF表達(dá)，但是對(duì)于電針是否對(duì)NSCs微環(huán)境其他因子以及相關(guān)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響尚不清楚。

綜上，結(jié)合相關(guān)研究及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為電針可能調(diào)節(jié)海馬區(qū)BDNF的表達(dá)調(diào)控外源性NSCs從而改善PSCI。但限于初步探索，本實(shí)驗(yàn)的機(jī)制研究尚不深入。下一步，我們將采取NSCs示蹤技術(shù)以及免疫熒光技術(shù)深入探討電針如何調(diào)控移植的NSCs遷移以及增殖分化治療PSCI，并全面評(píng)估電針對(duì)NSCs微環(huán)境因子以及結(jié)構(gòu)的影響，并確定兩者的關(guān)系，從而為治療PSCI、促進(jìn)腦卒中患者全面康復(fù)提供新的治療技術(shù)和理論支持。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。