李揚(yáng)璐 阮祥燕 程姣姣 周 琦 杜 娟 金鳳羽 谷牧青

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌科,北京 100026)

隨著腫瘤診斷和治療學(xué)的發(fā)展，各類(lèi)惡性疾病的檢出率和患者的存活率極大提高，與此同時(shí)，腫瘤內(nèi)分泌科醫(yī)生對(duì)年輕育齡期女性的生育力保護(hù)也越來(lái)越關(guān)注。癌癥放射治療及化學(xué)藥物治療(以下簡(jiǎn)稱(chēng)放化療)所具有的性腺毒性能夠?qū)е律ν耆珕适?、早絕經(jīng)，相關(guān)慢性病的發(fā)生導(dǎo)致癌癥痊愈后生活質(zhì)量下降，是許多年輕女性患者病愈后不得不面對(duì)的嚴(yán)峻問(wèn)題。卵巢組織凍存為這類(lèi)女性患者保護(hù)、保存生育力提供了新的途徑，其最佳適應(yīng)證是青春期前患癌女童和放化療不宜延遲的育齡期女性，能夠在癌癥診斷后立即進(jìn)行卵巢組織凍存，同時(shí)不會(huì)延誤疾病的治療。

卵巢組織凍存近年來(lái)發(fā)展迅速，目前，全球已有超過(guò)200名嬰兒經(jīng)此技術(shù)誕生[1]。首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院于2012年建立中國(guó)首家人卵巢組織凍存庫(kù)，目前已成功凍存人卵巢組織300余例，成功移植10例，術(shù)后卵巢功能均已恢復(fù)至正常水平，其中1例獲得自然妊娠[2]。卵巢組織凍存技術(shù)已被包括美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)在內(nèi)的多家權(quán)威機(jī)構(gòu)證實(shí)為一項(xiàng)有效的生育力保護(hù)方法[3]。

盡管卵巢組織凍存技術(shù)漸趨成熟，但凍存過(guò)程中的冷凍損傷和復(fù)蘇過(guò)程中的缺血再灌注損傷似乎難以避免[4]，凍存、復(fù)蘇過(guò)程中由于細(xì)胞內(nèi)活性氧類(lèi)物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)的不斷產(chǎn)生，導(dǎo)致卵泡凋亡和基質(zhì)細(xì)胞損傷發(fā)生，表現(xiàn)為基質(zhì)細(xì)胞溶解、核固縮、核溶解、細(xì)胞質(zhì)空泡化和組織萎縮[5]。

全球許多生育力保護(hù)中心都致力于減少凍融過(guò)程冷凍損傷的相關(guān)研究，包括改進(jìn)冷凍裝置、調(diào)整凍存組織的體積、控制轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間和溫度、添加抗凍蛋白以及改良凍融方案等[5-6]。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)是一種氨基硫醇類(lèi)抗氧化劑，是細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸和還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)的前體物質(zhì)，它既可以直接擴(kuò)散到細(xì)胞中重新合成GSH，也可以通過(guò)肝臟的首過(guò)代謝轉(zhuǎn)化成能夠刺激谷胱甘肽合成的代謝物，促進(jìn)解毒，從而清除自由基。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[7]證實(shí)NAC對(duì)多器官組織包括睪丸、心肌、腎臟、肝臟和卵巢均具有保護(hù)作用。

牛磺酸(taurine, T)，即2-氨基乙磺酸，是女性生殖道分泌的重要氨基酸之一，參與性腺發(fā)育和生殖激素調(diào)節(jié)[8]。Sanfilippo等[9]發(fā)現(xiàn)，?；撬崮軌蚪档蛢龃孢^(guò)程誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平，能夠保存卵泡的活性和完整性。

本中心前期在現(xiàn)有凍存復(fù)蘇液基礎(chǔ)上加入不同濃度梯度的抗氧化劑NAC，初步篩選出5 mmol/L NAC為最佳濃度，能夠有效減少活性氧類(lèi)物質(zhì)的產(chǎn)生，增強(qiáng)組織抗氧化能力，并保持較好的卵泡活性，保持基質(zhì)細(xì)胞的抗凋亡特性[10]。

根據(jù)前期研究[10]的結(jié)果，本課題組擬進(jìn)一步進(jìn)行人卵巢組織凍存復(fù)蘇方案的優(yōu)化，從卵泡形態(tài)、結(jié)構(gòu)和活性等不同方面探索單一或多種抗氧化劑對(duì)卵巢組織的保護(hù)作用，探索改良人卵巢組織凍存復(fù)蘇方案對(duì)卵泡活性的影響，以期篩選出最有效的凍存復(fù)蘇方案。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年8月至2018年8月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院生育力保護(hù)中心要求卵巢組織取材并凍存的女性患者共16名。所有患者在卵巢組織取材及凍存前均充分知情同意，并告知患者取材的不超過(guò)10%卵巢組織用于研究。簽署知情同意書(shū)(2017-KY-020-01)后方可施行卵巢組織取材手術(shù)。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

①年齡在40歲以下，有生育力保護(hù)意愿，卵巢功能正常；②符合以下條件之一者：需行放/化療的惡性腫瘤女性患者(如乳腺癌、霍杰金淋巴瘤、卵巢交界性腫瘤等)；青春期前女孩需要接受放化療者；某些需化療的良性疾?。喝缦到y(tǒng)性紅斑狼瘡、Wegener’s肉芽腫病等；需骨髓移植的疾病，包括良性血液病(鐮狀細(xì)胞貧血、重癥地中海貧血、再生障礙性貧血)、對(duì)免疫抑制劑不應(yīng)答的自身免疫性疾?。环磸?fù)發(fā)作的卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫、卵巢成熟畸胎瘤需接受生殖風(fēng)險(xiǎn)手術(shù)者等；③有生育力保護(hù)意愿，要求卵巢組織凍存;④接受卵巢組織凍存前簽署知情同意書(shū)，同意將取材的卵巢組織(不超過(guò)總?cè)〔牧康?0%)用于研究。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

①年齡>40歲；②年齡<40歲但卵巢功能不全或減退；③惡病質(zhì)不能耐受卵巢組織取材手術(shù)的患者。

1.2 分組與處理

將每位患者的卵巢組織(不超過(guò)總?cè)〔牧康?0%)按照隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)分配入以下4組：①C組(對(duì)照組)，即卵巢組織凍存依照本中心現(xiàn)有凍存復(fù)蘇方案進(jìn)行；②N組(NAC組)，在現(xiàn)有凍存復(fù)蘇方案基礎(chǔ)上加入5 mmol/L NAC；③T組(?；撬峤M)，在現(xiàn)有凍存復(fù)蘇方案基礎(chǔ)上加入0.5 mmol/L T；④N+T組 (NAC+T組)，在本中心現(xiàn)有凍存復(fù)蘇方案基礎(chǔ)上同時(shí)加入5 mmol/L NAC和0.5 mmol/L T。

1.3 卵巢組織的取材、凍存和復(fù)蘇

采用本中心現(xiàn)有卵巢組織凍存方案(L-15/DMSO/HSA)和復(fù)蘇方案(DPBS/HSA/Sucrose)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化凍存復(fù)蘇。分配入各組的卵巢組織除凍存、復(fù)蘇液不同外，均按照本中心規(guī)范化凍存復(fù)蘇操作流程[11]執(zhí)行。每位患者用于研究的卵巢組織在-196 ℃液氮罐中凍存1個(gè)月以上后開(kāi)始復(fù)蘇。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1 卵巢組織的卵泡形態(tài)觀察

(1)蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)染色：將復(fù)蘇后的卵巢組織立即用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定24 h以上。經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋，最終制作石蠟切片，按照厚度4 μm連續(xù)切片。選擇每個(gè)石蠟組織塊的第2張和第8張進(jìn)行HE染色，并計(jì)數(shù)卵泡，卵泡形態(tài)學(xué)判定見(jiàn)下文，取兩張HE染色玻片的卵泡數(shù)平均值代表該卵巢活檢組織的卵泡計(jì)數(shù)水平。

(2)卵泡形態(tài)學(xué)分級(jí)：參考以往文獻(xiàn)[12-13]，根據(jù)圍繞卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞層數(shù)及形態(tài)將卵泡分為原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和竇狀卵泡。①原始卵泡：卵母細(xì)胞被單層扁平狀顆粒細(xì)胞環(huán)繞；②初級(jí)卵泡：環(huán)繞卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞中有一個(gè)或多個(gè)顆粒細(xì)胞由單層扁平轉(zhuǎn)變?yōu)閱螌恿⒎綘?；③次?jí)卵泡：卵母細(xì)胞被兩層及以上的立方狀顆粒細(xì)胞包圍，無(wú)竇腔形成；④竇狀卵泡：卵母細(xì)胞被多層立方顆粒細(xì)胞包圍，并形成竇腔。其中原始卵泡屬于靜止卵泡，初級(jí)、次級(jí)和竇狀卵泡屬于生長(zhǎng)卵泡。

1.4.2 卵泡活性檢測(cè)

采用鈣黃綠素(Calcein-AM)染色進(jìn)行卵泡活性檢測(cè)。DPBS溶液預(yù)熱后加入濃度為0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) Calcein-AM和6 mg/mL的Ⅰ型膠原酶，混勻。將復(fù)蘇后的卵巢組織放入上述培養(yǎng)液，置于4孔培養(yǎng)板中，在37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2、濕度為95%條件下孵育2 h。取出后用加樣槍反復(fù)吹打卵巢組織30～50次，至塊狀組織消失，呈均勻分布狀態(tài)。靜止30 min后，置于熒光顯微鏡載物臺(tái)，調(diào)10倍物鏡，分別在普通光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡(激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)為495/515 nm)下進(jìn)行活性卵泡計(jì)數(shù)。

1.4.3 培養(yǎng)液激素水平的檢測(cè)

各組卵巢組織復(fù)蘇后立即放入提前一天配制好的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液為DMEM-GlutaMAX培養(yǎng)基和胎牛血清體積比為9∶1，混勻放入37 ℃、5% CO2(體積分?jǐn)?shù))培養(yǎng)箱中過(guò)夜。將各組卵巢組織培養(yǎng)96 h后，取培養(yǎng)液上清進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)培養(yǎng)液中17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)和抗苗勒管激素(anti-mullerian hormone，AMH)濃度。

1.4.4 活性氧類(lèi)物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)濃度

細(xì)胞內(nèi)ROS濃度采用活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。利用熒光探針2′, 7′-雙氯熒光黃乙酸乙酯(2′,7′-dihydrodichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA)進(jìn)行活性氧檢測(cè)。無(wú)熒光的DCFH-DA能夠穿過(guò)細(xì)胞膜，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成2′,7′-二氯二氫熒光素(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein，DCFH)，細(xì)胞內(nèi)的活性氧能夠快速氧化無(wú)熒光的DCFH生成強(qiáng)熒光產(chǎn)物的2′, 7′-二氯熒光素(2′,7′-dichlorofluorescein, DCF)，從而確定細(xì)胞內(nèi)的總活性氧水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 患者一般情況

16名患者平均年齡為(34.32±4.12)歲，新鮮卵巢組織活性檢測(cè)為7～52，19(12，32)個(gè)卵泡。卵泡發(fā)育情況為原始卵泡134個(gè),生長(zhǎng)卵泡45個(gè)。

2.2 卵泡形態(tài)學(xué)觀察

復(fù)蘇后對(duì)各組卵巢組織HE染色切片進(jìn)行卵泡計(jì)數(shù)。依據(jù)前述卵泡形態(tài)學(xué)分級(jí)方法，將卵泡分為靜止卵泡(原始卵泡)和生長(zhǎng)卵泡(初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和竇狀卵泡)。各組靜止卵泡和生長(zhǎng)卵泡計(jì)數(shù)和比例詳見(jiàn)表1，對(duì)每組靜止卵泡和生長(zhǎng)卵泡的比例進(jìn)行比較，盡管N組和N+T組靜止卵泡的比例較高，但總體比例分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.362,P=0.095)。各組典型HE染色圖片詳見(jiàn)圖1。

表1 各組靜止卵泡和生長(zhǎng)卵泡比例的比較Tab.1 Comparison between proportions of dormant follicles and developing follicles in each group n(%)

圖1 各組HE染色典型圖片F(xiàn)ig.1 Typical photos of HE staining in each groupC: control; N: 5 mmol/L N-acetyl-L-cysteine; T: 0.5 mmol/L taurine; HE: hematoxylin-eosin staining.

2.3 卵泡活性檢測(cè)

各組光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)的卵泡在熒光顯微鏡下全部表現(xiàn)為強(qiáng)綠色熒光，說(shuō)明卵泡活性良好。各組活卵泡計(jì)數(shù)為非正態(tài)分布，各組活卵泡計(jì)數(shù)詳見(jiàn)表2，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.738,P=0.267)。各組在光鏡下和熒光顯微鏡下的典型圖片詳見(jiàn)圖2。

表2 各組活卵泡計(jì)數(shù)水平Tab.2 Numbers of viable follicles in each group

圖2 各組卵泡活性(Calcein-AM染色)典型圖片F(xiàn)ig.2 Typical photos of follicle viability (Calcein-AM staining) in each group(100×)White arrow: viable follicles; black arrow: follicles; C: control; N: 5 mmol/L N-acetyl-L-cysteine; T: 0.5 mmol/L taurine.

2.4 培養(yǎng)液中E2、AMH濃度

單因素方差分析顯示對(duì)照組和N+T組培養(yǎng)液E2濃度高于N組和T組， 組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.279,P=0.686)。

AMH濃度呈非正態(tài)性分布，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.997,P=0.009)，其中改良的3組培養(yǎng)液中AMH高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PN=0.03，PT=0.007，PN+T=0.000)。各組培養(yǎng)液中E2和AMH濃度詳見(jiàn)表3。

表3 各組復(fù)蘇后卵巢組織培養(yǎng)液中E2和AMH濃度

2.5 細(xì)胞內(nèi)活性氧類(lèi)物質(zhì)濃度的評(píng)估

單因素方差分析結(jié)果顯示,細(xì)胞內(nèi)ROS濃度組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.275,P=0.003)，兩兩比較結(jié)果顯示,N+T組和N組ROS濃度低于C組(P<0.05)，其中以N+T組ROS濃度降低最顯著。各組細(xì)胞內(nèi)ROS濃度詳見(jiàn)表4。

表4 各組卵巢組織細(xì)胞內(nèi)ROS水平的比較

3 討論

本研究設(shè)置一個(gè)對(duì)照組(原凍存復(fù)蘇方案)和3個(gè)研究組，即分別在對(duì)照組基礎(chǔ)上加入5 mmol/L NAC(N組)、0.5 mmol/L ?；撬?T組)，以及同時(shí)加入5 mmol/L NAC和0.5 mmol/L 牛磺酸(N+T組)。從卵泡形態(tài)和結(jié)構(gòu)、卵泡活性、E2和AMH產(chǎn)生濃度，細(xì)胞內(nèi)活性氧類(lèi)物質(zhì)水平等多個(gè)方面進(jìn)行比較，旨在明確單一或多種抗氧化劑對(duì)卵巢組織的保護(hù)作用。

結(jié)果顯示，采用4種凍存復(fù)蘇方案都能夠有效維持卵巢組織內(nèi)的卵泡結(jié)構(gòu)和卵泡活性，N組和N+T組在保存原始卵泡比例方面略?xún)?yōu)于對(duì)照組。經(jīng)體外培養(yǎng)4 d后檢測(cè)培養(yǎng)液，4組卵巢組織分泌E2濃度相當(dāng)，3個(gè)研究組卵巢組織中卵泡分泌AMH濃度顯著高于對(duì)照組；氧化應(yīng)激方面，N組和N+T組細(xì)胞內(nèi)ROS濃度顯著低于對(duì)照組。其中，N+T組在上述幾個(gè)方面效果最優(yōu)。

綜合以上結(jié)果，對(duì)照組、N組、T組和N+T組均能夠有效保護(hù)卵泡結(jié)構(gòu)和卵泡活性，但同時(shí)加入N-乙酰半胱氨酸和?；撬?N+T組)在保存卵泡形態(tài)和活性、增加復(fù)蘇后原始卵泡比例、保存原始卵泡減少活性氧產(chǎn)生等方面優(yōu)于原凍存方案組。

3.1 組織形態(tài)學(xué)觀察

本研究通過(guò)HE染色和鈣黃綠素(Calcein-AM)染色兩種方法進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)的觀察。

HE染色的優(yōu)點(diǎn)在于卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞相對(duì)位置固定，根據(jù)顆粒細(xì)胞形態(tài)和層數(shù)能夠更清晰地鑒別不同卵泡發(fā)育時(shí)期的卵泡，各種研究中分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)一致[12，14-15]，但在實(shí)際操作中，將卵巢組織連續(xù)切片、染色和觀察工作量較大，容易出現(xiàn)重復(fù)計(jì)數(shù)；常用的方法是間隔選取其中1～2張切片染色并計(jì)數(shù)[4,16]，但其局限性在于，卵巢組織中卵泡往往成簇分布，因此，僅選取一、兩張切片中的卵泡計(jì)數(shù)是非常有限的[17]，不能代表該卵巢組織的整體水平。Calcein-AM染色則很好地彌補(bǔ)了HE染色的不足：通過(guò)熒光顯微鏡和普通光鏡下對(duì)比觀察，不但能清楚地評(píng)估卵泡活性，還能夠觀察到基質(zhì)細(xì)胞活性、形態(tài)和密度。

本研究采用HE染色和鈣黃綠素染色同時(shí)觀察卵泡形態(tài)、發(fā)育分級(jí)和活性，4組間比較結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)各組靜止卵泡(即原始卵泡)和生長(zhǎng)卵泡(初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和竇狀卵泡)的比例進(jìn)行比較，各組原始卵泡比例占大多數(shù)，盡管差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，N組和N+T組保存原始卵泡比例方面優(yōu)于對(duì)照組，在增大樣本量后有可能取得有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果。說(shuō)明在本中心現(xiàn)有凍存復(fù)蘇方案，以及在此基礎(chǔ)上單獨(dú)或聯(lián)合加入N-乙酰半胱氨酸和?；撬?，均能夠有效保存卵泡形態(tài)，維持卵泡和基質(zhì)細(xì)胞活性。這與Sanfilippo等[9]和Mahmoodi等[18]的研究一致。

3.2 卵巢組織活性的評(píng)估

作為芳香化酶催化的產(chǎn)物，培養(yǎng)液中E2的濃度反映了復(fù)蘇后卵巢組織中的芳香化酶活性。芳香化酶主要存在于顆粒細(xì)胞中，E2主要由顆粒細(xì)胞分泌，基質(zhì)細(xì)胞對(duì)類(lèi)固醇激素的產(chǎn)生也具有促進(jìn)作用[19]。E2濃度增高能夠反映顆粒細(xì)胞的增殖和基質(zhì)細(xì)胞的功能，生長(zhǎng)卵泡比原始卵泡能夠產(chǎn)生更多的E2，因此可作為卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的標(biāo)志[17,20]。 AMH主要由生長(zhǎng)中的小竇前卵泡到早期竇前卵泡中的顆粒細(xì)胞產(chǎn)生，在成熟卵泡中分泌減少[21]。AMH在原始卵泡中不能檢測(cè)到，故培養(yǎng)液中的AMH濃度主要取決于竇卵泡大小和數(shù)量，因此AMH濃度可以反映卵巢組織中早期生長(zhǎng)卵泡的數(shù)量[22]。培養(yǎng)液中的E2和AMH濃度都可以作為復(fù)蘇后卵巢組織中卵泡發(fā)育潛能的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

本研究中，4組培養(yǎng)液中E2濃度高度相近，與Gerritse等[23]的觀點(diǎn)一致，即需要相當(dāng)大的樣本量檢測(cè)E2分泌水平才可獲得有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果；N+T組的AMH濃度輕微高于對(duì)照組，說(shuō)明N+T組卵泡發(fā)育能力優(yōu)于對(duì)照組；提示N-乙酰半胱氨酸和?；撬峁餐饔媚軌蛱岣邚?fù)蘇后卵泡發(fā)育潛能。

3.3 卵巢組織內(nèi)氧化應(yīng)激水平

正常生理狀態(tài)下，ROS生成和組織、細(xì)胞內(nèi)的清除系統(tǒng)之間存在平衡。當(dāng)ROS生成過(guò)多而不能被及時(shí)清除時(shí)，氧化應(yīng)激產(chǎn)生。凍存過(guò)程中細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激產(chǎn)生應(yīng)答，導(dǎo)致內(nèi)皮損傷，微血管通透性和組織腫脹，通過(guò)激活黏性分子和促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生啟動(dòng)炎性反應(yīng)，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)凋亡或壞死信號(hào)，通過(guò)缺氧和增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子濃度與細(xì)胞內(nèi)核受體結(jié)合，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)的釋放[24]。這些都可導(dǎo)致卵泡丟失和基質(zhì)細(xì)胞凋亡[25]。

本研究結(jié)果顯示，N+T組和N組卵巢組織在復(fù)蘇后細(xì)胞內(nèi)ROS濃度顯著低于對(duì)照組和T組，說(shuō)明NAC在減少細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積，減少細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激方面起主要作用,與前期預(yù)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果[10]一致。

總之，本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和卵泡活性、E2和AMH分泌水平、細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)的測(cè)定等方面的研究，發(fā)現(xiàn)抗氧化劑NAC和T在保存卵泡形態(tài)和結(jié)構(gòu)，保護(hù)卵泡活性，維持卵巢組織復(fù)蘇后卵泡發(fā)育潛能方面均有一定的保護(hù)作用；同時(shí)加入NAC和T可協(xié)同作用，可顯著提高卵巢組織整體活性，減少細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生，降低氧化應(yīng)激水平，起到最優(yōu)效果。下一步研究應(yīng)擴(kuò)大樣本量，采用動(dòng)物模型驗(yàn)證該優(yōu)化方案的有效性。