李 勇，沈 超，李海峰，阮狄克

椎間盤退變（Intervertebral Disc Degeneration,IDD）是一系列脊柱退行性疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)，包括腰腿痛、頸椎病、椎管狹窄、椎間盤突出癥等疾病[1-2]。臨床上高達(dá)40%的下腰痛被認(rèn)為主要是由IDD 引起的，盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)IDD 的治療進(jìn)行了廣泛而深入的研究[3-4]，但目前對(duì)于椎間盤源性背痛的治療仍然極具挑戰(zhàn)性[5]。1997 年日本Nishida 首先開展了IDD基因治療實(shí)驗(yàn)研究[6]。雖然在基因載體的安全性和表達(dá)調(diào)控方面仍有許多問題需要進(jìn)一步解決，但是基因治療為IDD的治療提供了一種新的思路和方法，并在近年取得顯著的進(jìn)步，表1。因此，依據(jù)近期發(fā)表的文獻(xiàn)，將IDD 的基因治療進(jìn)展綜述如下。

表1 IDD相關(guān)基因及其作用

1 病毒介導(dǎo)的基因治療

1.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因治療 逆轉(zhuǎn)錄病毒為單鏈RNA 病毒,可高效地感染多種類型細(xì)胞,將外源基因隨機(jī)插入并穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中持續(xù)表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體的缺點(diǎn)包括：①不能感染非分裂細(xì)胞；②轉(zhuǎn)錄終止能力相對(duì)較弱,從而有可能造成轉(zhuǎn)錄通讀；③可能產(chǎn)生有復(fù)制能力的病毒；④可能造成插入性突變。通常逆轉(zhuǎn)錄病毒的插入位點(diǎn)是隨機(jī)的,但更傾向于插入基因的第一個(gè)內(nèi)含子和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒可包裝的外源基因要求小于8 kb,因此只適用于體外的細(xì)胞感染[7-8]。Wehling 等[9]通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將兩種外源基因─細(xì)菌LacZ基因和人白細(xì)胞介素-1(IL-1)受體拮抗劑的互補(bǔ)DNA,從體外轉(zhuǎn)移到牛尾椎終板分離的軟骨細(xì)胞中，并在48 h內(nèi)成功產(chǎn)生了IL-1受體拮抗劑蛋白。Reinecke 等采用大鼠也得到了類似的結(jié)果，也是將LacZ基因和人IL-1ra的cDNA 通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)導(dǎo)入椎間盤細(xì)胞，并檢測(cè)到表達(dá)。這些研究顯示了局部基因治療IDD 的潛在應(yīng)用，將外源性的治療基因引入椎間盤細(xì)胞和其他脊柱組織，可能會(huì)為治療物質(zhì)輸送到脊柱開辟新的途徑。

1.2 慢病毒介導(dǎo)的基因治療 慢病毒作為載體用于基因治療，其特點(diǎn)是用于各種組織的靶細(xì)胞、能承載相對(duì)多的基因載荷,可攜帶較大基因組、并可將目的基因高效整合至目的基因組DNA 而穩(wěn)定表達(dá)[8]。慢病毒可以有效地傳遞大量的外源基因，在多基因表達(dá)系統(tǒng)中具有明顯優(yōu)勢(shì)，對(duì)于分裂期及非分裂期細(xì)胞均能夠高效感染。慢病毒載體另一大優(yōu)點(diǎn)是不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)。從安全角度來(lái)看,慢病毒是一種復(fù)制缺陷型病毒載體,因此不會(huì)對(duì)細(xì)胞或人體產(chǎn)生不良感染,屬于低毒性病毒載體。其生物安全性明顯優(yōu)于逆轉(zhuǎn)錄病毒,甚至優(yōu)于非病毒類基因載體。2015年，賽佳明等[10]研究慢病毒載體GVl 15 介導(dǎo)Caspase-3siRNA 轉(zhuǎn)染人椎間盤髓核細(xì)胞，轉(zhuǎn)染l周后即可表達(dá)綠色熒光素，Ⅱ型膠原和蛋白多糖含量較對(duì)照組顯著增高。Ma 等[11]采用慢病毒介導(dǎo)的凋亡抑制因子survivin轉(zhuǎn)染退變?nèi)俗甸g盤髓核細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：盡管慢病毒攜帶survivin可以成功地在髓核細(xì)胞中表達(dá)，細(xì)胞形態(tài)明顯改變，但細(xì)胞凋亡率未降低。因此，對(duì)survivin基因在椎間盤退變中的治療作用還需進(jìn)一步評(píng)估。2016 年，Liu 等[2]報(bào)道了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3(TGF-β3)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)和TIMP-1與慢病毒載體在新西蘭大白兔環(huán)形穿刺模型中的體內(nèi)共轉(zhuǎn)導(dǎo)，結(jié)果顯示具有上調(diào)蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的基因表達(dá)和蛋白合成的作用，并且椎間盤的磁共振成像(MRI)分級(jí)評(píng)分有顯著改善。這些結(jié)果既讓我們看到了慢病毒多基因轉(zhuǎn)移治療IDD的潛在價(jià)值和希望，也發(fā)現(xiàn)了存在的問題和不成熟的一面。

1.3 腺病毒介導(dǎo)的基因治療 腺病毒載體介導(dǎo)基因治療也頗受研究者重視，因?yàn)樗哂畜w外穩(wěn)定、易于純化的優(yōu)點(diǎn)，而且能夠感染終末分化細(xì)胞，并且不整合入宿主，避免了插入突變的可能。腺病毒載體也有缺點(diǎn)：①與細(xì)胞基因的重組，可能使腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)，從而引起機(jī)體免疫反應(yīng)；②在特定情況下少量的復(fù)制能力，會(huì)導(dǎo)致宿主發(fā)生腦炎的危險(xiǎn)。Nishida 等人[13]報(bào)道了體外培養(yǎng)成熟雌性新西蘭大白兔分離的椎間盤髓核細(xì)胞，通過(guò)編碼lacZ基因的腺病毒構(gòu)建體(Ad-lacZ)轉(zhuǎn)導(dǎo)成功的例子，證明了基因治療IDD 疾病的可行性。2016 年，Luo等[14]發(fā)現(xiàn)腺病毒不僅是一種有效的基因傳遞載體，而且可以延長(zhǎng)人生長(zhǎng)和分化因子5（GDF-5）的表達(dá)，從而促進(jìn)髓核細(xì)胞后粘多糖和羥脯氨酸含量增加，促進(jìn)了細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，這表明Ad-GDF-5組細(xì)胞在蛋白和mRNA水平分泌蛋白多糖，Ⅱ型膠原和聚糖蛋白表達(dá)上調(diào)。因此，利用腺病毒載體將病毒基因轉(zhuǎn)移到椎間盤髓核細(xì)胞的治療方法被證明是可行的，可以通過(guò)增強(qiáng)人髓核細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)生成來(lái)恢復(fù)退變椎間盤的功能等方式來(lái)實(shí)現(xiàn)，而且有報(bào)道使用腺病毒載體的單次注射，可實(shí)現(xiàn)載體基因表達(dá)長(zhǎng)達(dá)1年。腺病毒作為載體的免疫原性,并由此導(dǎo)致的臨床安全問題，這一點(diǎn)一定不能忽略。

1.4 腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的基因治療 腺相關(guān)病毒（AAV）屬于細(xì)小病毒科,Dependoparvovirus 屬。它的生命周期依賴于輔助病毒的存在,如腺病毒,目前的共識(shí)認(rèn)為AAV 不會(huì)引起任何人類疾病。AAV 作為基因治療最有希望的載體之一[15-16]，其重要特征是在人類中的低遺傳毒性。2012 年，Leckie SK 研究團(tuán)隊(duì)[17]在一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,以AAV為載體,將金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMPs-1）注射到兔退變椎間盤中，結(jié)果證實(shí)TIMPs-1能夠延緩椎間盤退行性變的發(fā)展。Lattermann 等[18]報(bào)道了AAV 載體成功地將熒光素酶的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到兔椎間盤髓核細(xì)胞，并與腺病毒的載體進(jìn)行比較。在處死動(dòng)物時(shí)，Lat‐termann 等發(fā)現(xiàn)除了注射部位有軟組織瘢痕形成外，沒有發(fā)現(xiàn)椎間盤任何宏觀變化[18]，目前研究發(fā)現(xiàn)，AAV 載體的免疫原性低于腺病毒載體，且與人類或哺乳動(dòng)物的任何已知疾病無(wú)關(guān)[19]。Ren 等[20]研究探討了AAV 介導(dǎo)的BMP-7和SOX9雙基因體外共轉(zhuǎn)染人退變性椎間盤髓核細(xì)胞的生物學(xué)功能，AAV 介導(dǎo)的BMP-7和SOX9體外共轉(zhuǎn)染可促進(jìn)人退變椎間盤髓核細(xì)胞中Ⅱ型膠原的合成。AAV 是實(shí)現(xiàn)椎間盤轉(zhuǎn)基因治療的一種有價(jià)值的新載體，尤其它的低遺傳毒性和低免疫原性的優(yōu)點(diǎn)，正受到越來(lái)越多人的青睞。但是，AAV 作為基因治療載體，與腺病毒載體相比，起效更慢，表達(dá)強(qiáng)度更低，因此，它的使用還需要進(jìn)一步評(píng)估。

1.5 桿狀病毒介導(dǎo)的基因治療 桿狀病毒也可以作為基因治療的載體。這種病毒能在體內(nèi)或體外釋放外源性基因至哺乳類動(dòng)物細(xì)胞,包括不含細(xì)胞毒素未分化細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)桿狀病毒介導(dǎo)的某些基因在宿主細(xì)胞長(zhǎng)期表達(dá)并無(wú)明顯毒性反應(yīng)。Liu 等[21]報(bào)道了桿狀病毒將綠色熒光蛋白(GFP)基因轉(zhuǎn)移到椎間盤上的實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果顯示均在兔椎間盤細(xì)胞中成功表達(dá)，且無(wú)任何癥狀。盡管相關(guān)研究數(shù)量特別少，但這些結(jié)果表明桿狀病毒也有潛力成為一個(gè)有效治療IDD的載體工具。

2 非病毒介導(dǎo)的基因治療

2.1 陽(yáng)離子多聚物載體 陽(yáng)離子多聚物可與富含陰離子的DNA 互相結(jié)合,其形成的復(fù)合物(polyplex)具有黏合到細(xì)胞膜表面的硫酸粘多糖上的功能,從而利用細(xì)胞膜內(nèi)吞功能將其吞入進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。報(bào)道的陽(yáng)離子多聚物種類眾多,其中研究較早的是多聚賴氨酸,后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)聚乙烯亞胺性能更佳,是目前研究的熱點(diǎn)[22-23]。2015 年，F(xiàn)eng 等[24]采用陽(yáng)離子嵌段共聚物用傳遞治療質(zhì)粒DNA(pDNA)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種混合膠束對(duì)核酸酶的高耐受性和對(duì)蛋白質(zhì)吸附的強(qiáng)抵抗力，在大鼠尾盤注射明顯降低了實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，增加了糖胺聚糖(GAG)含量，最終獲得了更好的治療效果。2018年，F(xiàn)eng等[25]又報(bào)道了一種持續(xù)的兩階段生物反應(yīng)的microRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，通過(guò)可注射的可降解水凝膠包裹基質(zhì)金屬蛋白酶-響應(yīng)性多聚膠團(tuán)進(jìn)入椎間盤髓核細(xì)胞。該研究中陽(yáng)離子嵌段共聚物被設(shè)計(jì)成復(fù)合miR-29a，第一階段，局部纖維化區(qū)域基質(zhì)金屬蛋白酶水平升高觸發(fā)水凝膠降解，從而定位病變椎間盤組織中多聚膠團(tuán)的持續(xù)釋放。第二階段，釋放的多聚膠團(tuán)對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶反應(yīng)，使PEG 殼脫落，隨后，在椎間盤髓核細(xì)胞中可實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)細(xì)胞攝取和內(nèi)小體逃逸。多聚膠束是重要的非病毒載體，也是有希望治療IVD 退變的基因治療載體之一。如何找到性能更優(yōu)的陽(yáng)離子多聚物并形成有效的載體系統(tǒng)是該方向研究的關(guān)鍵點(diǎn)。

2.2 納米顆粒載體 納米顆粒載體所介導(dǎo)的基因治療具有自身獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。首先，納米材料的大小在一定的數(shù)量范圍內(nèi),因此對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和活性幾乎不具備細(xì)胞毒性；其次，納米顆粒載體通常沒有免疫原性,不會(huì)激活細(xì)胞的免疫反應(yīng)；再次,納米顆粒載體對(duì)外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率通常要高于脂質(zhì)體,并且它的自身體積很小,從而可以隨血液循環(huán)到達(dá)各個(gè)組織中。目前實(shí)驗(yàn)研究較多的包括無(wú)機(jī)納米顆粒(如碳酸鈣、金納米顆粒、磁性氧化鐵)、有機(jī)硅納米顆粒、天然高分子納米顆粒等[22]。2010 年，Yang等[26]將BMPF 做成納米顆粒的水懸浮液，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些納米顆?？上抡{(diào)基質(zhì)蛋白aggrecan、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原的基因表達(dá)，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶3的基因表達(dá)。最近研究[27]證明miR-141是IDD 的關(guān)鍵調(diào)控因子，而納米顆粒轉(zhuǎn)染miR-141 可加重或減輕實(shí)驗(yàn)性IDD。該研究揭示了miR-141 通過(guò)與SIRT1/NF-KB 通路相互作用促進(jìn)IDD 進(jìn)展的一種新機(jī)制。因此，在體內(nèi)阻斷miR-141 可能是治療IDD 的一種潛在的治療方法。目前，納米材料研究的蓬勃發(fā)展，為下一步基因治療奠定了更加堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

2.3 RNA 干擾 RNA 干擾（RNAi）是由長(zhǎng)度為20～30 nt 小雙鏈RNA 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象，用于特異性基因沉默，當(dāng)然也可以用作基因治療。經(jīng)典的siRNA 介導(dǎo)的RNAi 途徑通過(guò)與靶標(biāo)mRNA互補(bǔ)配對(duì)實(shí)現(xiàn)對(duì)同源序列表達(dá)水平的下調(diào)。siR‐NA 介導(dǎo)的RNAi 的優(yōu)勢(shì)之一是其有效性。即使是相對(duì)較小的siRNA 也能有效地下調(diào)特定基因表達(dá)的調(diào)控。因?yàn)閟iRNA 被納入RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC),它在細(xì)胞中是穩(wěn)定存在[28]，并反復(fù)劈開目標(biāo)mRNA。Kakutani 等[29]首次證明靶向外源性報(bào)告基因的siRNA 可以有效地在體外沉默人類和大鼠椎間盤髓核細(xì)胞中的基因表達(dá)。該研究siRNA介導(dǎo)的基因沉默在大鼠和人椎間盤細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)中是可行的，并且可以有效的下調(diào)特定基因的表達(dá)。2011 年，Sudo 等[30]發(fā)現(xiàn)采用SiRNA 技術(shù)，在兔椎間盤細(xì)胞中敲除caspase 3 可有效防止凋亡細(xì)胞死亡，從而調(diào)控IDD。韓敦富等[31]用陰性對(duì)照FassiRNA 轉(zhuǎn)染原代大鼠腰椎間盤細(xì)胞后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)siRNA 可降低大鼠椎間盤細(xì)胞對(duì)IL-β 預(yù)刺激導(dǎo)致的凋亡敏感性，說(shuō)明減輕或抑制炎癥反應(yīng)對(duì)減緩IDD 有重要作用。RNA 干擾能夠特異的沉默一些特定的基因表達(dá)，從而影響髓核細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路作用或細(xì)胞因子生成，因此，其在IDD 治療中的應(yīng)用正變得越來(lái)越廣泛。

3 基因編輯技術(shù)

基因編輯是指對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾的一項(xiàng)新技術(shù)[32]?；贒NA 核酸酶的基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速，從第一代DNA 核酸酶編輯系統(tǒng)ZFNs、第二代TALENs 到第三代CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，基因編輯效率不斷提高、成本逐漸降低，應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。CRISPR 技術(shù)在活的真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了精確高效的基因組編輯[32-33]。在IDD 的基因治療領(lǐng)域，F(xiàn)arhang等[34]報(bào)道了將慢病毒CRISPR 表觀基因組編輯系統(tǒng)引入人類退變椎間盤細(xì)胞，下調(diào)TNF 受體1(TN‐FR1)/IL-1受體1(IL-1R1)的表達(dá)。這些研究結(jié)果證明了CRISPR-Cas9 系統(tǒng)在病理椎間盤細(xì)胞中的有效性和可行性，同時(shí)也揭示了IL-1R1表觀基因組靶向性的局限性，這表明可能需要一種定制的方法來(lái)成功調(diào)控每個(gè)基因。Bowles 和Farhang 團(tuán)隊(duì)[35]最近又報(bào)道了一種通過(guò)dCas9-VPP CRISPR 基因激活系統(tǒng)直接上調(diào)主要軟骨組織蛋白aggrecan(ACAN)和Ⅱ型膠原(COL2A1)來(lái)增強(qiáng)再生表型的新方法，這種方法表明dCas9-VPR 系統(tǒng)可以在不需要生長(zhǎng)因子的情況下穩(wěn)定地上調(diào)COL2A1和ACAN沉積，為IDD 進(jìn)行基因治療提供了一種新的、精確的控制干細(xì)胞表型的方法?；蚓庉嬍且豁?xiàng)新的熱門技術(shù)，尤其是最新的CRISPR技術(shù)在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了精確高效的基因組編輯，其定點(diǎn)修飾功能必定在IDD的基因治療中開拓出一片新的空間。

4 IDD的基因治療的展望與挑戰(zhàn)

椎間盤是一個(gè)低氧并營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)有限的組織，其獨(dú)特的解剖和生理特性是我們進(jìn)行退變椎間盤基因治療最主要的挑戰(zhàn)之一[36]。盡管現(xiàn)階段一些基因治療應(yīng)用已初見成效,而且新的基因治療技術(shù)的興起讓IDD 的治療再一次步入了全新的起點(diǎn)，但是目前仍然還有許多障礙需要克服，如安全性、高成本和轉(zhuǎn)染效果等。因此，努力提高基因治療的安全性和有效性是科研工作者們的重要工作，而發(fā)展和尋求更高效的基因治療方法,是促進(jìn)基因治療發(fā)展的助推器。