林彭思遠(yuǎn)，楊 旭，周世豪，卜秀芬，劉激揚(yáng)，賀 駿

2019 年12 月始發(fā)的由新型冠狀病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Related Coronavirus 2,SARS-CoV-2）導(dǎo)致的新型冠狀病毒肺炎（Corona‐virus Disease 2019,COVID-19）已成為全球突發(fā)公共衛(wèi)生事件。SARS-CoV-2 隸屬于β-冠狀病毒屬，為有包膜的單股正鏈RNA 病毒，是迄今為止已發(fā)現(xiàn)的可以感染人類的第七種冠狀病毒，與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus,SARS-CoV）和中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus,MERS-CoV）一樣均可引起下呼吸道感染[1]。SARS-CoV 和MERS-CoV 感染的患者在過(guò)去20 年里全球累計(jì)報(bào)道已達(dá)1 萬(wàn)余例。相比SARSCoV 和MERS-CoV，SARS-CoV-2 具有更強(qiáng)的傳染性，迄今為止全球已報(bào)道確診患者超1 億，主要傳播途徑為經(jīng)呼吸道飛沫和密切接觸。孕產(chǎn)婦是冠狀病毒的易感人群，已有報(bào)道顯示孕婦感染SARSCoV 的病死率為25%（普通人群10%），而孕婦感染MERS-CoV的病死率高達(dá)37%[2]。

現(xiàn)階段COVID-19 診斷的首選方法是采集呼吸道標(biāo)本，采用基于反轉(zhuǎn)錄的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)對(duì)SARS-CoV-2 核酸進(jìn)行檢測(cè)，除呼吸道樣本外，糞便、尿液、血液等多種類型標(biāo)本中均可檢測(cè)到SARS-CoV-2 核酸，國(guó)內(nèi)外亦有多項(xiàng)針對(duì)血液樣本診斷COVID-19的研究報(bào)道[3-4]。本研究開(kāi)發(fā)了一種基于胎兒非整倍體無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)（Non-Invasive Prenatal Testing，NIPT）的SARS-CoV-2 核酸檢測(cè)技術(shù)（NIPT-SARS-CoV-2），以期在孕婦進(jìn)行常規(guī)NIPT 檢測(cè)的同時(shí)僅通過(guò)一管外周血實(shí)現(xiàn)孕婦這一易感人群的SARS-CoV-2篩查。

1 材料和方法

1.1 樣本來(lái)源 選取2020 年7 月1 日-2020 年9 月30日在長(zhǎng)沙市婦幼保健院就診行NIPT檢測(cè)的孕婦50 例，其中40 例NIPT 檢測(cè)正常，10 例NIPT 檢測(cè)為21、18或13三體。所有孕婦均已簽署知情同意書(shū)。采集孕婦外周血10 mL，進(jìn)行血漿分離，分離后的血漿編號(hào)立即放入-80 ℃冰箱中保存。將每份血漿平均分成兩份，其中一份用于抽提血漿中游離DNA（cell free DNA，cfDNA），另一份用于提取SARS-CoV-2 RNA。從長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院收集COV‐ID-19患者的SARS-CoV-2核酸標(biāo)本，并簽署知情同意書(shū)。所有標(biāo)本均在滅活后按三級(jí)生物防護(hù)要求進(jìn)行核酸抽提并逆轉(zhuǎn)錄儲(chǔ)存。

1.2 cfDNA 提取 采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（德國(guó)Qiagen 公司）提取血漿中的游離DNA，然后采用qubit 核酸定量?jī)x（美國(guó)Thermo 公司）進(jìn)行定量。提取完成的cfDNA 編號(hào)后保存于-20 ℃冰箱中。

1.3 SARS-CoV-2 RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄 采用QIAamp?Viral RNA Mini Kit（德國(guó)Qiagen 公司）提取血漿中的RNA，提取完成后采用Fapon RNA-seq cDNA Synthesis Kit（菲鵬生物股份有限公司）對(duì)提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.4 文庫(kù)制備 文庫(kù)制備的原始模板通過(guò)將孕婦血漿cfDNA 和RNA 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等比例混合而成。文庫(kù)分為三組，正常孕婦組、三體孕婦組和模擬SARS-CoV-2 孕婦組，其中正常孕婦組10 例，由正常孕婦血漿cfDNA 和RNA 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物混合；三體孕婦組10 例，由NIPT 檢測(cè)為21、18 或13 三體的孕婦血漿cfDNA 及其RNA 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物混合；模擬SARS-CoV-2 孕婦組30 例，由正常孕婦血漿cfDNA和COVID-19 患者RNA 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物混合，同時(shí)設(shè)置三個(gè)不同的病毒濃度梯度：1 400 拷貝/mL，14 000拷貝/mL，140 000拷貝/mL（分別將1 000拷貝病毒、10 000 拷貝病毒和100 000 拷貝病毒加入至700 uL正常孕婦血漿中，混勻后再進(jìn)行cfDNA 提取和SARS-CoV-2 逆轉(zhuǎn)錄），每個(gè)濃度梯度各10 例。隨后通過(guò)末端修復(fù)、加接頭、PCR擴(kuò)增、定量等步驟進(jìn)行各組文庫(kù)的構(gòu)建。

1.5 高通量測(cè)序與數(shù)據(jù)分析 所有文庫(kù)定量后采用DR8600 測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序，下機(jī)數(shù)據(jù)去除低質(zhì)量序列后獲得高質(zhì)量序列，將其與人類參考基因組（hg19）進(jìn)行比對(duì)，獲得的BAM文件進(jìn)行排序后去除PCR重復(fù)序列。使用自有NIPT分析軟件進(jìn)行分析，獲取21 號(hào)染色體、18 號(hào)染色體、13 號(hào)染色體的Z值，從而判斷是否存在21、18、13染色體三體。

與此同時(shí)，將下機(jī)后獲得的高質(zhì)量序列與新型冠狀病毒參考基因組（NC_045512.2）進(jìn)行比對(duì)，去除低比對(duì)質(zhì)量的序列（比對(duì)長(zhǎng)度不足60），統(tǒng)計(jì)新型冠狀病毒序列數(shù)，從而判斷待檢樣本中是否存在SARS-CoV-2。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 不同方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量比較使用配對(duì)t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)相關(guān)性采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)。配對(duì)t檢驗(yàn)、皮爾遜相關(guān)系數(shù)和離散系數(shù)均使用R 3.5.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎兒染色體非整倍體檢測(cè)評(píng)估 對(duì)正常孕婦組和三體孕婦組的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行NIPT分析，發(fā)現(xiàn)正常孕婦組10例均為陰性，三體孕婦組4例為21三體、4 例為18 三體、1 例為13 三體、1 例為21 三體合并13三體，表1。在長(zhǎng)沙市婦幼保健院臨床常規(guī)NIPT 檢測(cè)的樣本中隨機(jī)挑選20 例樣本，與本研究中的正常孕婦組和三體孕婦組的數(shù)據(jù)量進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)臨床常規(guī)NIPT樣本與本研究組中的樣本檢測(cè)數(shù)據(jù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1，P>0.05）。

圖1 臨床常規(guī)NIPT樣本與本研究組樣本數(shù)據(jù)量對(duì)比

表1 胎兒染色體非整倍分析

2.2 孕婦SARS-CoV-2核酸檢測(cè)評(píng)估 對(duì)正常孕婦組和模擬SARS-CoV-2 孕婦組同時(shí)進(jìn)行NIPT 分析和SARS-CoV-2 分析，結(jié)果顯示,模擬SARS-CoV-2孕婦組的三個(gè)濃度梯度均可檢測(cè)到SARS-CoV-2核酸序列，且該組所有樣本NIPT結(jié)果均為陰性，表2，正常孕婦組的NIPT 檢測(cè)和SARS-CoV-2 檢測(cè)均為陰性。

表2 模擬SARS-CoV-2孕婦組SARS-CoV-2檢測(cè)及NIPT檢測(cè)

2.3 檢測(cè)序列數(shù)與新型冠狀病毒拷貝數(shù)相關(guān)性分析 為驗(yàn)證該檢測(cè)方法是否具有用于SARS-CoV-2定量分析的潛力，本研究進(jìn)一步分析了SARS-CoV-2序列數(shù)占比與SARS-CoV-2拷貝數(shù)的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，隨著SARS-CoV-2拷貝數(shù)的減少，病毒序列數(shù)的離散系數(shù)也隨之變大（100 000拷貝組：0.107，10 000拷貝組：0.177，1 000拷貝組：0.522）。隨后進(jìn)一步分析了SARS-CoV-2 序列占比與病毒拷貝數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.977，提示該方法有潛力用于新型冠狀病毒的定量或半定量分析，圖2。

圖2 新型冠狀病毒序列數(shù)與拷貝數(shù)的關(guān)系

3 討論

自COVID-19 爆發(fā)以來(lái)，陸續(xù)有無(wú)癥狀感染者報(bào)道出來(lái)，國(guó)家衛(wèi)健委首次針對(duì)這類人群公布的數(shù)據(jù)顯示，截至2020 年4 月14 日，全國(guó)累計(jì)發(fā)現(xiàn)無(wú)癥狀感染者6 764 例[5]。美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心估計(jì)，已感染SARS-CoV-2人群中，約35%將不出現(xiàn)癥狀，且病毒傳播往往發(fā)生于癥狀出現(xiàn)之前[6]。目前研究顯示，無(wú)癥狀感染者存在傳染性，且其病毒載量與COVID-19 患者相似，極有可能成為傳染源造成聚集性疫情發(fā)生[7-9]。孕產(chǎn)婦是SARS-CoV-2的易感人群，有資料顯示感染SARS-CoV-2 的孕婦更易出現(xiàn)并發(fā)癥[2,10]。美國(guó)紐約的一項(xiàng)針對(duì)入院待產(chǎn)孕產(chǎn)婦的研究中顯示，33 例SARS-CoV-2 檢測(cè)陽(yáng)性的孕婦中有高達(dá)29 例（87.9%）在入院時(shí)并未表現(xiàn)出COVID-19的任何癥狀[11]，另一項(xiàng)針對(duì)連續(xù)入院分娩的675 名孕產(chǎn)婦的研究顯示，10.4%的孕婦SARSCoV-2 核酸檢測(cè)為陽(yáng)性，其中78.6%的孕婦未表現(xiàn)出相應(yīng)癥狀[10]。因此，對(duì)孕產(chǎn)婦這一易感人群實(shí)施全面篩查，盡早發(fā)現(xiàn)無(wú)癥狀的孕產(chǎn)婦SARS-CoV-2感染者將有利于其得到最優(yōu)化的管理和救治。

NIPT 是一項(xiàng)用于準(zhǔn)確判斷孕期胎兒是否罹患染色體非整倍體綜合征的產(chǎn)前篩查技術(shù)，已在臨床廣泛推廣應(yīng)用。本研究通過(guò)對(duì)常規(guī)NIPT 方法進(jìn)行優(yōu)化改良后開(kāi)發(fā)的NIPT-SARS-CoV-2技術(shù)，僅采集一份外周血標(biāo)本即同時(shí)實(shí)現(xiàn)NIPT 檢測(cè)和孕婦SARS-CoV-2核酸檢測(cè)，達(dá)到不額外增加產(chǎn)檢項(xiàng)目即實(shí)現(xiàn)孕婦群體SARS-CoV-2無(wú)癥狀感染者篩查的目的，從而對(duì)SARS-CoV-2 陽(yáng)性孕婦提前采取干預(yù)措施，避免造成潛在的COVID-19 爆發(fā)流行。本方法在不增加常規(guī)NIPT測(cè)序數(shù)據(jù)量前提下，可以準(zhǔn)確的對(duì)胎兒染色體非整倍體進(jìn)行分析，并且可以實(shí)現(xiàn)病毒載量為1 400拷貝/mL的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)。

采集呼吸道標(biāo)本，尤其是肺泡灌洗液等下呼吸道標(biāo)本診斷COVID-19 的陽(yáng)性率最高，除呼吸道樣本外，糞便、尿液、血液等多種類型標(biāo)本中亦可檢測(cè)到SARS-CoV-2 核酸。有研究表明COVID-19 患者發(fā)病2～3 d 后即可在血液中檢測(cè)到SARS-CoV-2 核酸[12]，甚至有血液標(biāo)本SARS-CoV-2 核酸檢測(cè)陽(yáng)性，但咽拭子檢測(cè)陰性的病例報(bào)道[13]，提示通過(guò)血液標(biāo)本進(jìn)行SARS-CoV-2 核酸檢測(cè)是具有可行性的，且有其必要性。人體在病毒感染后，病毒入血形成病毒血癥需要一段時(shí)間，但病毒死亡和降解的核酸片段極易進(jìn)入外周血液，本研究結(jié)合NIPT具有高通量和高靈敏度的方法進(jìn)行外周血中SARS-CoV-2核酸的檢測(cè)，可以在感染早期發(fā)現(xiàn)病毒核酸片段，具有早期篩查出SARS-CoV-2攜帶者的優(yōu)勢(shì)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）是國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》中優(yōu)先推薦采用的用于COVID-19診斷的方法，該方法可高效、快速完成病毒核酸檢測(cè)，具有靈敏度高和特異性高的特點(diǎn)。現(xiàn)已注冊(cè)臨床使用的檢測(cè)試劑盒多以病毒基因組中3 段保守基因序列為檢測(cè)對(duì)象實(shí)現(xiàn)SARS-CoV-2 的核酸檢測(cè)，但不同試劑盒的檢測(cè)性能存在較大差異[14]，假陰性結(jié)果常常出現(xiàn)，從而需要待檢者反復(fù)多次檢測(cè)，但多次復(fù)檢仍不能解決病毒變異導(dǎo)致引物和探針不能有效結(jié)合而引起的假陰性。最近瑞典報(bào)道的宮內(nèi)感染病例中發(fā)現(xiàn)母親和新生兒感染了同一種病毒，但幾天后新生兒體內(nèi)病毒發(fā)生了變異，研究者認(rèn)為可能與其出生后接觸外部環(huán)境所引起的，病毒變異之快令人驚訝[15]，這也提示對(duì)病毒進(jìn)行基因測(cè)序的重要性，以避免由于病毒變異引起核酸檢測(cè)的假陰性，從而導(dǎo)致不合理的臨床處置。本研究開(kāi)發(fā)的NIPTSARS-CoV-2 技術(shù)是對(duì)病毒的全基因組進(jìn)行低深度測(cè)序，不光可以實(shí)現(xiàn)是否感染SARS-CoV-2的檢測(cè)，理論上還可以發(fā)現(xiàn)病毒變異，阻止變異病毒的流行，降低其造成爆發(fā)流行的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，本研究開(kāi)發(fā)的NIPT-SARS-CoV-2 技術(shù)可以在孕婦常規(guī)產(chǎn)檢過(guò)程中，采集一管外周血即達(dá)到NIPT 檢測(cè)和孕婦SARS-CoV-2 核酸檢測(cè)的目的，實(shí)現(xiàn)孕產(chǎn)婦這一易感人群的SARS-CoV-2 全面篩查，保證孕婦和新生兒得到最優(yōu)化的管理與救治。與此同時(shí)還有潛力用于病毒變異監(jiān)測(cè)，動(dòng)態(tài)跟蹤病毒的變異情況，最大限度阻止變異病毒的傳播。