丁 楠，王婷婷，蘇 婷

結(jié)直腸癌（Colorectal Carcinoma，CRC）是全球致死率排名第三的惡性腫瘤。目前中國(guó)CRC 發(fā)病率成明顯上升趨勢(shì),已被認(rèn)為是對(duì)現(xiàn)代社會(huì)人類健康的長(zhǎng)期威脅[1]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，代謝改變與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[2]。來(lái)自多細(xì)胞生物的微生物和細(xì)胞在相似的環(huán)境條件下具有相似的代謝表型。胱氨酸作為亞?；撬岷铣傻脑牧希驯蛔C實(shí)在CRC和癌旁組織中的含量存在顯著性差異[3]。

大量文獻(xiàn)報(bào)道腸道微生物菌群與CRC 有關(guān)。有研究證實(shí)，具核梭桿菌僅在CRC 中刺激增殖，但在非腫瘤細(xì)胞中不刺激增殖[4-6]。本次研究對(duì)象Fn 2118 蛋白即是具核梭桿菌蛋白組中一段功能未知的蛋白片段，由245個(gè)氨基酸構(gòu)成，以前并沒(méi)有針對(duì)此蛋白片段的任何研究。Yoshida等[7]證明具核梭桿菌的幾種蛋白片段，會(huì)與環(huán)境中的胱氨酸產(chǎn)生反應(yīng)，生成相應(yīng)產(chǎn)物,所以研究蛋白Fn 2118 對(duì)CRC細(xì)胞胱氨酸代謝影響，可以為更深入研究CRC發(fā)生發(fā)展機(jī)制及日后提高CRC預(yù)后做好理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 人CRC 細(xì)胞（ATCC）HCT-116 和LoVo 細(xì)胞，均購(gòu)自上海子實(shí)生物科技有限公司。Fn 2118蛋白由大連民族大學(xué)許永斌課題組提取純化捐贈(zèng)。

1.2 主要儀器及試劑 三氣二氧化碳培養(yǎng)箱、超純水儀、臺(tái)式冷凍大容量離心機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司），倒置顯微鏡（日本尼康株式會(huì)社）,超凈工作臺(tái)(青島海爾股份有限公司)，PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），蛋白電泳槽、半干轉(zhuǎn)印槽（美國(guó)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司），酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司），微量蛋白核酸分析儀（澳大利亞生命動(dòng)力亞洲有限公司），PH儀、電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司）。DMEM 高糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶-EDTA（美國(guó)Gibco 公司），PBS 緩沖液、胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗（美國(guó)HyClone 公司），Cell Proliferation Reagent WST-1（瑞士Roche 公司），RNAiso Plus、PrimerScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex Taq（Tli RnaseH Plus）（日本TaKaRa BIO株式會(huì)社），氯仿、甘氨酸（上海國(guó)藥試劑公司）、異丙醇、無(wú)水乙醇、甲醇（中國(guó)天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）Tris、SDS（中國(guó)北京索萊寶科技有限公司），SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒（中國(guó)Biosharp 公司），BCA 蛋白定量試劑盒、蛋白電泳Marker、CDOPolyclonal Antibody（美國(guó)賽默飛世爾科技公司），PVDF膜（0.22 μm）（美國(guó)默克密理博公司），脫脂奶粉（中國(guó)內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司），xCT(SLC7A11) Rabbit Polyclonal Antibody、Anti-ADORabbit Polyclonal Antibody（美國(guó)OriGene Technologies 公司），HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)（中國(guó)武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司），Antibeta Actin antibody（美國(guó)艾博抗上海貿(mào)易有限公司），超敏ECL發(fā)光液（中國(guó)Tanon生物公司）。

1.3 引物 實(shí)驗(yàn)所需要的引物，由日本Takara 公司合成（表1）。

表1 PCR引物

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 所有培養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)過(guò)程全程要有無(wú)菌概念，避免細(xì)胞污染。25 cm2接種完細(xì)胞的培養(yǎng)瓶加入DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基，放置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞傳代 提前解凍胰酶，傳代前觀察待傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)。吸去舊培養(yǎng)基，用5 mL無(wú)菌PBS 清洗3 次，加入1 mL 0.25% EDTA 胰酶消化至貼壁細(xì)胞變圓脫壁，加入5 mL 含血清DMEM培養(yǎng)基終止消化。反復(fù)輕柔的吹打消化好的細(xì)胞至脫壁形成單細(xì)胞懸液打入15 mL 離心管中。3000 rpm 離心3 min，棄上清，用DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，根據(jù)需要將細(xì)胞打入新的培養(yǎng)容器中待用。

1.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（WST-1 法）于96 孔板種接種細(xì)胞（7000 個(gè)/孔），每種細(xì)胞每實(shí)驗(yàn)組接種3 個(gè)平行孔，接種細(xì)胞后應(yīng)于96 孔板外圍孔加蒸餾水，防止培養(yǎng)基蒸發(fā)。放置5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中24 h細(xì)胞穩(wěn)定后，棄去舊培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS 清洗3 次后，取其中一組，加入WST-1工作液（PBS和WST-1試劑按照100：10 配制）100 μL，37℃孵育1.5 h 后，放入酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，取平均值得到空白對(duì)照。其他實(shí)驗(yàn)組按照實(shí)驗(yàn)要求更換培養(yǎng)基，刺激48 h后進(jìn)行WST-1 實(shí)驗(yàn)。用DMEM 完全培養(yǎng)基將一定濃度的蛋白Fn 2118 稀釋成1000 μg/mL、200 μg/mL、40 μg/mL、8 μg/mL、1.6 μg/mL、0.32 μg/mL、0.064 μg/mL 組，加上無(wú)蛋白Fn 2118 的空白組，每孔加入100 μL，每組三個(gè)平行孔。為防止蛋白降解，含蛋白Fn 2118的培養(yǎng)基每24 h更換一次。

1.7 Rt-PCR 實(shí)驗(yàn) 根據(jù)細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果（結(jié)果2.1），選取實(shí)驗(yàn)組（1000 μg/mL）和對(duì)照組（0 μg/mL）。兩種細(xì)胞接種于六孔板中，每孔接種量為70000/孔，5% CO2、37℃培養(yǎng)24 h 后用PBS 清洗3次，按上述實(shí)驗(yàn)分組要求在培養(yǎng)基（1 mL/孔）中加入試劑，每組4 個(gè)平行對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 候進(jìn)行提取。倒出培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS 清洗3 次。提取步驟按照日本寶生物公司RNAiso Plus 試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，得到實(shí)驗(yàn)所需RNA產(chǎn)物。A260/A280可得到核酸的純度，查看mRNA 濃度及純度，符合要求方可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。cDNA 擴(kuò)增體系及擴(kuò)增條件，按照日本寶生物公司PrimerScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，引物用無(wú)菌超純水復(fù)溶即可。

1.8 Western Blot 實(shí)驗(yàn) 根據(jù)細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果（結(jié)果2.1），選取實(shí)驗(yàn)組（1000 μg/mL）和對(duì)照組（0 μg/mL）兩種細(xì)胞接種于10 cm2培養(yǎng)皿中，每孔接種量為3×105/孔，5%CO2、37℃培養(yǎng)24 h 后用PBS 清洗3次，按上述實(shí)驗(yàn)分組要求在培養(yǎng)基（4 mL/皿）中加入試劑，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行蛋白提取。每1mL RIPA 加入10 μL PMSF，，裂解液混勻備用，現(xiàn)用現(xiàn)加。用PBS 沖洗貼壁細(xì)胞3 次，加入1mL 裂解液，細(xì)胞用刮鏟，吸入EP 管，放置冰上裂解30 min。14000×g，4℃離心5 min，取上清。按照50 體積BCA 工作液+1 體積Cu2+配制工作液，在96 孔板中加入10 μL 按要求稀釋好梯度的標(biāo)準(zhǔn)品和提取的蛋白，加入200 μL 工作液，37℃放置30 min，酶標(biāo)儀562 nm 測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而根據(jù)吸光度值得蛋白濃度。用4×SDS PAGE Loading Buffer加入提取好的蛋白樣本后，震蕩混勻，99℃，5min，煮沸變性后，放置到冰上冷卻，即可電泳。配置12% SDS-PAGE 膠。每孔上樣量為20 μg，Marker上樣量5 μL，濃縮膠電泳用恒定電壓80V，30 min，分離膠電泳用恒定電壓150 V。轉(zhuǎn)印采用恒定電流50 mA，50 min。用5%脫脂奶粉（脫脂奶粉+TBST）封閉，室溫震蕩1 h。用封閉液以相應(yīng)濃度稀釋?duì)耡ctin（1:3000）、SLC7A11（1:500）、ADO（1:500）和CDO（1:250）抗體，4℃過(guò)夜孵育。隨后將膜5 min（震蕩）洗滌3 次。在封閉液稀釋好的羊抗兔二抗（1:5000）中，放入洗滌好的PVDF 膜室溫孵育1 h，隨后將膜5 min（震蕩）洗滌3 次。Working Solution(A 液B 液，等量混合），室溫靜置2 min，按照檢測(cè)儀器的使用方法操作，曝光條件根據(jù)每種條件每種抗體的曝光效果確定。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Minitab 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（）表示。組間比較采用單因素方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛋白Fn 2118 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116、LoVo增殖的影響 為了研究Fn2118 蛋白對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116、LoVo 增殖產(chǎn)生的影響，用WST-1 法對(duì)不同濃度Fn 2118 蛋白刺激48 h 后的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如下圖（圖1A、1B）所示。用單因素方差分析（one-way ANOVA），蛋白X 濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響間都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨后我們對(duì)1000 μg/mL和0 μg/mL 的吸光度值進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，說(shuō)明Fn 2118 蛋白會(huì)促進(jìn)三種細(xì)胞的增殖，繼而也確定了之后PCR 實(shí)驗(yàn)和Western Blot 實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組（1000 μg/mL）和對(duì)照組（0 μg/mL）濃度。

圖1 不同濃度蛋白Fn 2118對(duì)兩種細(xì)胞增殖的影響

2.2 蛋白Fn 2118 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116 和LoVo 4 種胱氨酸代謝相關(guān)基因的影響因?yàn)榈鞍譌n 2118 為功能未知的“hypothetical protein”，所以在前序?qū)嶒?yàn)證實(shí)蛋白Fn 2118可以促進(jìn)人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116、LoVo 增殖后，本研究選取了3 種與胱氨酸代謝通路相關(guān)基因，并對(duì)其表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，包括SLC7A11、ADO、CDO。內(nèi)參基因選擇βactin（ACTB）。結(jié)果顯示，蛋白Fn 2118刺激后降低了HCT-116 細(xì)胞CDO 基因的表達(dá)和LoVo 細(xì)胞SLC7A11、ADO、CDO基因的表達(dá)。

2.3 蛋白Fn 2118 對(duì)CRC 細(xì)胞HCT-116、LoVo 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響前序?qū)嶒?yàn)證實(shí)蛋白Fn 2118 可以對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116、LoVo 一些基因（如CDO）的表達(dá)產(chǎn)生影響，選取兩種細(xì)胞有共同差異的3 種基因（與胱氨酸代謝相關(guān)的SLC7A11、ADO、CDO）相對(duì)應(yīng)的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行Western Blot 檢測(cè)。內(nèi)參抗體選擇β-actin（ACTB）。結(jié)果如圖3 所示，與基因表達(dá)結(jié)果基本一致。降低了HCT-116細(xì)胞CDO蛋白的表達(dá)。降低了LoVo 細(xì)胞SLC7A11、ADO、CDO蛋白表達(dá)。

圖3 蛋白Fn 2118刺激兩種結(jié)直腸癌細(xì)胞后3種蛋白表達(dá)差異情況

3 討論

西方化的生活方式，特別是近幾十年來(lái)中國(guó)肥胖和缺乏運(yùn)動(dòng)人群的患病率增加，對(duì)大腸癌發(fā)病率的上升產(chǎn)生了影響[8-9]本研究中，選擇為ATCC 認(rèn)證的人CRC細(xì)胞HCT-116和LoVo作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。而Fn 2118 蛋白，作為具核梭桿菌中的一個(gè)含有245個(gè)氨基酸的蛋白片段，對(duì)其功能及相關(guān)機(jī)制的研究尚屬首次。

首先，本研究采用WST-1 法，對(duì)不同濃度具核梭桿菌功能未知蛋白片段Fn 2118 刺激下的細(xì)胞增殖情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，蛋白Fn 2118 會(huì)促進(jìn)兩種CRC 細(xì)胞的增殖，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）,選出合適的實(shí)驗(yàn)組（1000 μg/mL）和對(duì)照組（0 μg/mL）濃度，而Fn 2118 蛋白促進(jìn)細(xì)胞增殖的機(jī)制，則有待繼續(xù)研究。

在選定濃度的蛋白Fn 2118和胱氨酸的分別刺激下，本研究檢測(cè)了3 種與胱氨酸代謝通路相關(guān)基因（SLC7A11、ADO和CDO）。并隨后根據(jù)PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了后續(xù)Western Blot檢測(cè)的目的蛋白。蛋白Fn 2118 刺激后降低了HCT-116 細(xì)胞CDO 基因和CDO 蛋白的表達(dá)，同時(shí)降低了LoVo 細(xì)胞SLC7A11、ADO、CDO基因和SLC7A11、ADO、CDO蛋白的表達(dá)。

圖2.1 蛋白Fn 2118刺激HCT116細(xì)胞24 h后3種基因表達(dá)差異情況

圖2.2 蛋白Fn 2118刺激LoVo細(xì)胞24 h后3種基因表達(dá)差異情況

胱氨酸生物學(xué)最近在腫瘤生物學(xué)方面?zhèn)涫荜P(guān)注，因?yàn)樗婕盎钚匝酰≧OS）的產(chǎn)生并通過(guò)CD44-2118c-（腫瘤干細(xì)胞-標(biāo)記半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）軸影響癌細(xì)胞的化療敏感性[10-11]。SLC7A11（2118c-胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體）是細(xì)胞攝取胱氨酸以交換細(xì)胞內(nèi)谷氨酸的主要胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體。其主要功能之一，介導(dǎo)細(xì)胞攝取胱氨酸，特別是維持細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平，以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和外源性物質(zhì)的保護(hù)[12-14]。體內(nèi)現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)兩條亞?；撬岷铣赏緩絒15]:①胱氨酸分解成半胱氨酸后經(jīng)半胱氨酸加雙氧酶（CDO，EC1.13.11.20）轉(zhuǎn)化成半胱亞磺酸，再經(jīng)脫羧酶（CSAD）作用生成亞?；撬?；②半胱氨酸與輔酶A 結(jié)合，產(chǎn)生半胱胺，后者經(jīng)半胱胺加雙氧酶（ADO,EC1.13.11.19）催化生成亞牛磺酸，亞?；撬嶙罱K可氧化成牛磺酸。

尤其半胱氨酸雙加氧酶（CDO）是半胱氨酸分解代謝過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。半胱氨酸生物學(xué)最近在腫瘤生物學(xué)方面?zhèn)涫荜P(guān)注，因?yàn)樗婕盎钚匝酰≧OS）的產(chǎn)生并通過(guò)CD44-xc-（腫瘤干細(xì)胞-標(biāo)記半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）軸影響癌細(xì)胞的化療敏感性[16-17]。CDO影響胞嘧啶代謝，導(dǎo)致活性氧（ROS）的產(chǎn)生，降低細(xì)胞活力和生長(zhǎng)[18-19]。因此，CDO被認(rèn)為是一個(gè)重要的腫瘤抑制基因，可以作為腫瘤細(xì)胞化療耐藥的標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蛋白Fn 2118 蛋白在促進(jìn)兩種腫瘤細(xì)胞增殖的同時(shí)，均下調(diào)了CDO基因和蛋白的表達(dá)，與前面報(bào)道的CDO的抑癌作用方向一致。

由于國(guó)內(nèi)外還未有實(shí)驗(yàn)室研究過(guò)具核梭桿菌功能未知蛋白片段Fn 2118 和胱氨酸濃度對(duì)CRC的影響，所以此次本研究也是一種篩選性實(shí)驗(yàn)。蛋白Fn 2118 對(duì)SLC7A11、ADO、和CDO表達(dá)的影響使我們有充分的理由相信其在胱氨酸代謝中具有一定的調(diào)控作用，相關(guān)機(jī)制有待后續(xù)，日后將從分子水平進(jìn)行對(duì)整個(gè)通路相關(guān)的信息進(jìn)行更多實(shí)驗(yàn)及更為深入的研究。