高明萱，雍遇樂，劉澤昆，陸蒙

肝癌在全球惡性腫瘤中發(fā)病率排名第七，死亡率排名第四，從全球來看，我國(guó)肝癌的發(fā)病率和致死率都居于世界首列[1]，其中肝細(xì)胞癌（Hepatocel‐lular Carcinoma,HCC）是最主要的肝癌類型，由于其高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移，患者接受治療的5 年生存率較低[2]，因此，研究肝癌轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制，對(duì)于預(yù)防HCC 患者轉(zhuǎn)移的發(fā)生、制定晚期HCC 患者的治療策略均具有重要意義。

Rab10 是小分子GTP 酶家族的成員，具有GDP和GTP 結(jié)合域，主要參與蛋白的囊泡運(yùn)輸[3-4]。Rab10的表達(dá)和活化均會(huì)影響蛋白和脂質(zhì)的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)。研究發(fā)現(xiàn)，活化的Rab10 破壞VSVG 到達(dá)細(xì)胞基底側(cè)膜的定位分選，使其部分位于頂端膜[5]。在上皮細(xì)胞早期極化過程中，Rab10 從高爾基體運(yùn)輸開始發(fā)揮作用，并與Rab8 合作參與蛋白質(zhì)向基底側(cè)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)[5]。此外，Rab10蛋白作為Ras家族成員，參與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展。例如，長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00152通過miR-107/Rab10調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[6]。MiR-329 通過下調(diào)Rab10抑制骨肉瘤的發(fā)展[7]。在HCC 中，Rab10 過表達(dá)通過多種致癌、細(xì)胞應(yīng)激和細(xì)胞凋亡途徑來調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和增殖，最終促進(jìn)腫瘤發(fā)生[8]。MicroRNA-519d/Rab10 可通過激活A(yù)MPK 通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬和凋亡[9]。盡管最近的研究表明Rab10 的表達(dá)與肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)，然而，關(guān)于Rab10在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用目前尚無報(bào)道。

本研究將探討Rab10 表達(dá)對(duì)肝癌遷移和侵襲的影響。首先，通過對(duì)美國(guó)癌癥基因組圖譜（Can‐cer Genome Atlas，TCGA）和基因表達(dá)匯編（Gene Expression Omnibus，GEO）兩個(gè)腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)的分析發(fā)現(xiàn)Rab10 mRNA 在HCC 患者中高表達(dá)，并且Rab10 的表達(dá)與肝癌病人生存密切相關(guān)。然后，利用特異靶向Rab10 的小RNA 干涉片段，明確干涉Rab10 可通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mes‐enchymal Transition，EMT）來降低HCC 細(xì)胞的遷移和侵襲。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞系HCC-LM3細(xì)胞購(gòu)于上中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心，E-cadherin、N-cadherin 和Snail 抗體購(gòu)于武漢三鷹生物有限公司，Rab10 多克隆抗體購(gòu)于Abcam 公司，α-tubulin單克隆抗體為空軍軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室制備，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming Growth Factorβ1,TGF-β1）購(gòu)于美國(guó)Peprotech 公司。DMEM 培養(yǎng)基、細(xì)胞消化液、谷氨酰胺、青鏈霉素均購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司，胎牛血清購(gòu)自于杭州四季青公司，Rab10 干涉與對(duì)照片段購(gòu)于上海吉瑪基因公司，LipofectamineTM 2000 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，細(xì)胞裂解液RIPA 與PMSF 購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司，二辛可寧酸（Bicinchoninic Acid，BCA）蛋白定量試劑盒購(gòu)于英國(guó)Pierce 公司，發(fā)光液EnlightTM 購(gòu)于北京英格恩生物科技有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-Time fluores‐cence Quantitative Polymerase Chain Reaction，RTqPCR）所用試劑盒為反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Pre‐mix Ex TaqTM 購(gòu)于大連寶生物工程公司，主要儀器Real-time PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Agilent 公司，電泳儀與電泳槽、發(fā)光儀、流式細(xì)胞儀均購(gòu)自美國(guó)BD 公司，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek 公司、倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon 公司，Image Station 4000 MM Pro和XLS180 光信號(hào)采集系統(tǒng)為美國(guó)Kodak公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人肝癌細(xì)胞系HCC-LM3用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)于溫度37 ℃，5% C02濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，隔天換液。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCC-LM3細(xì)胞懸液接種于6 孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞密度70%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟及劑量嚴(yán)格按照LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染說明書步驟，分別用設(shè)計(jì)的Rab10特異性小干擾RNA（Small Interfering RNA，SiRNA）片段和陰性對(duì)照片段（表1）來實(shí)現(xiàn)Rab10的下調(diào)表達(dá)。

1.2.2 分組 按照Rab10 干涉情況可分為Si-Rab-1,Si-Rab-2,Si-Rab-3 組和陰性對(duì)照組（Negative Control,NC）。按照處理因素可分為4 組，空白對(duì)照組（不加TGF-β1），TGF-β1 刺激組（加入5 ng/ml TGF-β1 刺激24h），TGFβ1+NC組（在陽性對(duì)照組加入5 ng/ml TGF-β1）和TGF-β1+Si-Rab10-3 組（在干涉Rab10組加入5 ng/ml TGF-β1）。

1.2.3 蛋白提取與Western Blot HCC-LM3細(xì)胞于轉(zhuǎn)染48 h 后，加入TGF-β1（5 ng/mL），24 h 收集細(xì)胞，用RIPA 裂解緩沖液裂解細(xì)胞，4 ℃裂解30 min,13000 rcf 離心30 min,提取細(xì)胞總蛋白，用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，用10%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育一抗Rab10（1：300）、E-cadherin（1：1500）、N-cadherin（1：1500）、Snail（1：500）和αtubulin（1：50）,4 ℃過夜孵育，用TBST 緩沖液洗去一抗，滴加同種屬二抗室溫孵育1 h，再用TBST 緩沖液洗去二抗，用化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行發(fā)光。

1.2.4 RNA 提取和RT-qPCR 依照RNA 提取試劑盒說明書提取HCC-LM3 的RNA，并將其反轉(zhuǎn)合成為cDNA。使用Primer Blast 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，序列如下，Rab10：上游引物5’-CTGCTCCTGATC‐GGGGATTC-3’，下游引物5’-TGATGGTGT‐GAAATCGCTCCT -3’;GAPDH:上游引物5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC -3’，下游引物5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA -3’。使用SYBR Premix Ex TaqTM，配制20 μL反應(yīng)體系：SYBR 10 μL；Primer Forward 0.8 μL；Primer Reverse 0.8 μL；cDNA 2 μL；DEPC H2O 6.4 μL，將反應(yīng)體系加入八連管中，混勻后離心，放入實(shí)時(shí)定量PCR儀中。

1.2.5 基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)與遷移實(shí)驗(yàn) 在24 孔板中預(yù)先鋪設(shè)Transwell 小室，對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，提前加入用培養(yǎng)基稀釋好的Matrigel稀釋液（1:5）100 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱3 h,使Matrigel 膠凝固，遷移實(shí)驗(yàn)直接鋪設(shè)Transwell小室。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染48 h的HCC-LM3細(xì)胞，TGF-β1（5 ng/mL）刺激24 h 后，消化、離心用無血清培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)約1×105個(gè)/mL。取細(xì)胞懸液加入小室，上室每孔加200 μL 的細(xì)胞懸液，下室加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基500 μL，繼續(xù)培養(yǎng)。再培養(yǎng)18 h 后，取出Transwell 小室，用0.2%結(jié)晶紫/95%乙醇固定染色，清水中涮洗，再用干凈的棉簽去除上層的細(xì)胞，風(fēng)干過夜后進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 通過SPSS16.0 分析軟件，采用Kaplan-meier 法進(jìn)行總生存時(shí)間分析。計(jì)量資料采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）”表示，統(tǒng)計(jì)分析用Graphpad prism 軟件，組間比較采取t檢驗(yàn)，P<0.05為存在顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 臨床HCC組織中，Rab10表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性分析 為了明確Rab10 在HCC 患者組織中的表達(dá)，我們通過TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)庫(kù)和GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（GSE22058），首先分析了Rab10 的mRNA 表達(dá)，其中，TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)庫(kù)包括371 例原發(fā)性肝癌腫瘤和50 例非腫瘤癌旁組織，GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)包括96 例原發(fā)性肝癌腫瘤和相對(duì)應(yīng)的癌旁組織。TCGALIHC 和GEO 數(shù)據(jù)分析顯示，癌旁組織中Rab10 的mRNA水平顯著低于HCC組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1A）。接著，對(duì)TCGA-LIHC 的肝癌病人進(jìn)行總體生存分析，結(jié)果表明Rab10高表達(dá)的HCC患者生存率低（P<0.0001，圖1B）。

圖1 Rab10對(duì)臨床預(yù)后的影響

2.2 Rab10 對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Western Blot 和RT-qPCR 結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組（Negative Control，NC）比較，siRab10-3 組中Rab10蛋白和mRNA 水平顯著降低（圖2A，圖2B）。接下來，利用此干涉片段和NC組進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，遷移實(shí)驗(yàn)顯示，穿過小室的NC 組細(xì)胞數(shù)為194.30±5.78，與對(duì)照組比較，干涉Rab10 組細(xì)胞穿過數(shù)目為68.67±12.81，干涉Rab10降低了HCC-LM3細(xì)胞的遷移能力（P=0.0009，圖2C）。同時(shí)，細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，干涉Rab10 降低了HCC-LM3 細(xì)胞的侵襲能力（P=0.0139），其中NC 組和Si-Rab10-3 組穿過小室的細(xì)胞數(shù)分別為139.3±16.59 和64.00±7.02（圖2D）。

圖2 兩組細(xì)胞遷移和侵襲能力的比較

2.3 Rab10 對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT 的影響 Western Blot結(jié)果顯示，在HCC-LM3細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，干涉Rab10 后E-cadherin 表達(dá)上調(diào)，同時(shí)N-cadherin 和Snail 表達(dá)下調(diào)(圖3A)。TGF-β 1 刺激后，E-cadherin 表達(dá)下調(diào)，N-cadherin 和Snail表達(dá)上調(diào)，而相比于NC 組，干涉Rab10 則升高Ecadherin 的表達(dá)，降低N-cadherin 和Snail 的表達(dá)，即干涉Rab10 抑制了由TGF-β1 引起的E-cadherin下降和N-cadherin、Snail 表達(dá)的升高（圖3B）。TGF-β1 誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT 的過程中，肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)，Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)也證實(shí)此結(jié)論，與空白對(duì)照組（細(xì)胞遷移數(shù)為216.30±5.55；細(xì)胞侵襲數(shù)為211.00±17.78）比較，TGF-β1 組可明顯增強(qiáng)HCC-LM3 細(xì)胞的遷移（細(xì)胞遷移數(shù)為531.00±3.79，P<0.0001）和侵襲能力（細(xì)胞侵襲數(shù)為448.70±24.22，P=0.0014）。然而，TGF-β1 刺激下，與NC 組相比（細(xì)胞遷移數(shù)為533.30±4.37；細(xì)胞侵襲數(shù)為480.70±4.06），干涉Rab10 后肝癌細(xì)胞的遷移（細(xì)胞遷移數(shù)為166.30±8.01，P<0.0001）和侵襲能力降低（細(xì)胞侵襲數(shù)為125.70±12.13，P<0.0001，圖3C）。

圖3 Rab10對(duì)肝癌細(xì)胞EMT的作用

3 討論

Rab GTP 酶可作為細(xì)胞膜系統(tǒng)的核心調(diào)控因子，在生理狀態(tài)下，維持胞內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，膜性結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞骨架的穩(wěn)定。當(dāng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙時(shí)，可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)從感染性疾病到癌癥不等的多種疾病狀態(tài)[10]。尤其值得注意的是，作為一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子，近些年越來越多的報(bào)道指出Rab10在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[11-12]。目前，Rab10在HCC 中研究仍處于初級(jí)階段，在肝癌發(fā)生階段的增殖和凋亡方面少有報(bào)道，而對(duì)于該蛋白在肝癌進(jìn)展中的作用未有研究。因此，我們將關(guān)注點(diǎn)放在了Rab10 在HCC 轉(zhuǎn)移中的作用。首先，通過TCGA-LIHC 和GEO 兩個(gè)癌癥相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)的分析發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，Rab10 在HCC 組織中mRNA顯著高表達(dá)。然后，通過與肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，干涉Rab10顯著降低HCC細(xì)胞的侵襲和遷移能力。綜上，Rab10 不僅在肝癌的形成和增殖方面發(fā)揮了重要作用，該蛋白在肝癌轉(zhuǎn)移方面的作用也不可忽視。

通常EMT 的發(fā)生被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移的啟動(dòng)子，是腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的重要步驟[13]，具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞，并獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力。經(jīng)歷EMT 的細(xì)胞，其形態(tài)和功能都會(huì)發(fā)生改變，喪失頂端-基底極性和細(xì)胞-細(xì)胞間的連接，既可以穿透基底膜和間質(zhì)組織，還可以穿過循環(huán)系統(tǒng)至遠(yuǎn)處組織[14-15]。那么，Rab10 對(duì)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲是否是通過EMT 呢？于是，我們檢測(cè)了干涉Rab10后對(duì)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadhein、Snail 表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，HCC-LM3 細(xì)胞中，下調(diào)Rab10 后，E-cadherin 表達(dá)上調(diào)，N-cadherin和Snail表達(dá)下調(diào)。

TGF-β1是公認(rèn)的EMT誘導(dǎo)因子，在HCC發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，其可以通過與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，激活Smad 通路（Smad2、Smad3 和Smad4），最終促進(jìn)EMT 的形成[16-18]。另外，TGF-β1可以破壞上皮細(xì)胞極性和細(xì)胞連接，誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，其中包括E-cadherin、Ncadherin、Snail、Twist 等分子表達(dá)的改變[19-21]。為了更加明確Rab10表達(dá)與EMT的相關(guān)性，我們建立了TGF-β1 誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT 模型，本研究通過Western Blot 發(fā)現(xiàn)，降低Rab10 的表達(dá)可以增加TGF-β1 下調(diào)的上皮標(biāo)志物E-cadherin 蛋白表達(dá)，降低TGF-β1上調(diào)的間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Snail蛋白表達(dá)。進(jìn)一步功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，干涉Rab10抑制了TGF-β1 引起的肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，總之，Rab10 的表達(dá)會(huì)影響肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT 進(jìn)而調(diào)控肝癌進(jìn)展。這些結(jié)果表明：干涉Rab10 可抑制由TGF-β1增強(qiáng)的HCC-LM3細(xì)胞的遷移和侵襲能力，即Rab10可通過EMT調(diào)控肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)癌基因Rab10 可通過介導(dǎo)EMT 影響HCC 的惡性進(jìn)展。這樣，Rab10可作為一個(gè)潛在的肝癌晚期標(biāo)志物，靶向Rab10可能成為一種新的針對(duì)晚期HCC 的治療策略，對(duì)今后肝癌的研究提供新理論和新思路。然而，我們只揭示了Rab10 在HCC 轉(zhuǎn)移中作用，我們認(rèn)為，在這一進(jìn)程中，一定有許多有趣的機(jī)制深埋在地下，值得我們進(jìn)一步探索。