周 毅，王雪笠，康玉萊，張明杰，楊海梅，郭 露，張莉莉

動脈粥樣硬化病變中，巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)攝取大量脂質(zhì)成分，在細(xì)胞內(nèi)合成膽固醇酯，形成泡沫細(xì)胞，同時伴細(xì)胞因子和趨化因子等炎性介質(zhì)的增多。尤其是在動脈粥樣硬化中晚期，VSMC是泡沫細(xì)胞的主要來源[1]。但VSMC轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞的具體機(jī)制目前尚不清楚。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)是Sirtuins家族中的一員，廣泛分布于真核細(xì)胞中，可使組蛋白和很多下游靶蛋白去乙酰化并調(diào)節(jié)其活性，進(jìn)而調(diào)控能量、脂質(zhì)和葡萄糖代謝，并參與細(xì)胞分化、代謝、修復(fù)和炎癥反應(yīng)等過程[2]。激活SIRT1可以上調(diào)肝細(xì)胞低密度脂蛋白(LDL)受體的表達(dá)從而促進(jìn)LDL向肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和排出體外，最終降低血漿膽固醇水平[3]。在巨噬細(xì)胞中，激活SIRT1能夠抑制細(xì)胞對氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的攝取，進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成[4]。泡沫細(xì)胞的堆積是動脈粥樣斑塊形成的基礎(chǔ)，而脂質(zhì)代謝紊亂是泡沫細(xì)胞形成的關(guān)鍵，上述研究提示SIRT1能夠通過調(diào)控脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制動脈粥樣硬化病變進(jìn)程。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1(ABCA1)可將細(xì)胞內(nèi)的膽固醇和磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外的載脂蛋白，從而降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，是細(xì)胞內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)途徑的重要分子[5]。研究證實(shí)，ABCA1功能障礙導(dǎo)致高密度脂蛋白減少和細(xì)胞組織中脂質(zhì)沉積[6]。同時，ABCA1失活還能增加膽固醇在腸道的吸收，表達(dá)主要受肝X受體α(LXRα)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控[7]。LXRα是核激素受體蛋白質(zhì)超家族成員，與維A酸X受體形成異二聚體后，能分別與ABCA1啟動子區(qū)LXR反應(yīng)元件(LXRE)結(jié)合，從而刺激ABCA1轉(zhuǎn)錄[8]。研究表明，SIRT1在巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞中能夠通過去乙酰化和泛素化作用激活LXRα，進(jìn)而上調(diào)細(xì)胞中ABCA1的表達(dá)[9]。在單核細(xì)胞泡沫化過程中，SIRT1可能通過激活LXRα-ABCA1/ABCG1信號通路抑制細(xì)胞的泡沫樣變[10]。本研究旨在探討SIRT1是否能夠通過LXRα/ABCA1信號通路調(diào)控VSMC的脂質(zhì)代謝，進(jìn)而抑制ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞泡沫化。

1 材料與方法

1.1試劑 DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、PBS液購自美國Hyclone公司。SIRT1一抗購自美國Santa Cruz公司。ABCA1一抗、LXRα一抗購自中國碧云天公司。β-actin一抗及所有二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)一抗購自美國Abcam公司，所用熒光二抗購自江蘇碧云天公司。SRT1720購自美國Selleck Chemicals公司，Nicotinamide購自美國Supelco公司。ox-LDL購自廣州奕源生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 組織塊貼壁法培養(yǎng)VSMC。取小鼠胸主動脈，用含青、鏈霉素的無菌PBS液潤洗，仔細(xì)剝除纖維層和外膜。縱行剖開血管使內(nèi)膜面向上，用眼科彎剪輕刮2～3遍以去除血管內(nèi)皮細(xì)胞。更換培養(yǎng)皿，將血管中層組織剪切成1 mm3小塊，接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，組織塊間隙大約0.5 cm，瓶內(nèi)加入含20%胎牛血清的DMEM/高糖培養(yǎng)基，直立于37℃、5% CO2的無菌恒溫培養(yǎng)箱中2～4 h，待組織塊緊貼瓶底后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)基浸沒組織塊，3 d后第一次更換培養(yǎng)基。待組織塊有細(xì)胞爬出，且足夠傳代后進(jìn)行第一次傳代，此后待細(xì)胞生長至瓶底面積的80%～90%即可傳代培養(yǎng)。傳代至第三代時，應(yīng)用α-SMA對原代培養(yǎng)的VSMC進(jìn)行鑒定。

1.3細(xì)胞分組 取5～10代細(xì)胞用于實(shí)驗，細(xì)胞鋪板培養(yǎng)，換無血清DMEM饑餓培養(yǎng)24 h。加入80 μg/ml ox-LDL誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的C57BL/6J小鼠VSMC泡沫化，VSMC作為空白對照，Western blot法檢測SIRT1的表達(dá)。應(yīng)用SIRT1激動劑SRT1720(SRT，1 μmol/L)、抑制劑Nicotinamide(Nic，100 μmol/L)，將培養(yǎng)細(xì)胞分為對照組(con組)、ox-LDL組、ox-LDL+SRT組、ox-LDL+Nic組，檢測各組細(xì)胞中SIRT1、ABCA1及LXRα表達(dá)及對細(xì)胞泡沫化的影響。應(yīng)用LXRα激動劑GW3965(10 μmol/L)和抑制劑GGPP(10 μmol/L)將細(xì)胞分為對照組(con組)、ox-LDL組、ox-LDL+GW3965組、ox-LDL+GGPP組，檢測各組細(xì)胞ABCA1表達(dá)及細(xì)胞泡沫化情況。

1.4油紅染色 用異丙醇配制0.5%油紅O儲存液備用。待染色組織或細(xì)胞用PBS液洗滌2次，4%多聚甲醛固定30 min。油紅O儲存液經(jīng)濾紙過濾后與去離子水按照3︰2比例稀釋成工作液，再次經(jīng)濾紙過濾后靜置10 min。PBS液清洗去除多聚甲醛，加入油紅O工作液，避光染色30～60 min。去離子水沖洗去除多余染液后鏡下觀察。

1.5Western blot法分析蛋白表達(dá) 采用Western blot法分析細(xì)胞中SIRT1、ABCA1及LXRα蛋白表達(dá)水平。從小鼠主動脈或培養(yǎng)的VSMC中提取蛋白質(zhì)樣品。蛋白質(zhì)樣品通過10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。PVDF膜與抗SIRT1(1︰600)、抗ABCA1(1︰500)、抗LXRα(1︰2000)及抗β-actin(1︰2000)一抗體在4℃共同孵育過夜。洗滌后，PVDF膜與辣根過氧化物共軛二抗體在室溫下孵育2 h?；瘜W(xué)發(fā)光法曝光，通過Labworks4.6(UVP，Upland，CA，美國)測定蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1ox-LDL誘導(dǎo)VSMC源性泡沫細(xì)胞中SIRT1的表達(dá) ox-LDL明顯誘導(dǎo)VSMC泡沫化，油紅染色可見細(xì)胞內(nèi)大量紅色脂滴形成，呈“戒環(huán)樣”聚集于細(xì)胞周邊。同時，ox-LDL組細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)與con組相比顯著下降(P<0.05)。見圖1、圖2。

圖1 Western blot法檢測氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞中SIRT1表達(dá)情況

圖2 油紅染色檢測氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞泡沫化的程度(×400)

2.2SIRT1對VSMC源性泡沫細(xì)胞形成的影響 SRT可使VSMC中SIRT1水平顯著升高(P<0.05)，同時細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴明顯減少，泡沫化程度被明顯抑制；應(yīng)用Nic后，細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)明顯下降(P<0.05)，細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴顯著增多。見圖3、圖4。

圖3 Western blot法檢測SIRT1對各組血管平滑肌細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)

圖4 油紅染色檢測SIRT1對各組血管平滑肌細(xì)胞泡沫化的影響(×400)

2.3SIRT1對VSMC源性泡沫細(xì)胞中ABCA1表達(dá)的影響 ox-LDL刺激培養(yǎng)VSMC 24 h后，細(xì)胞中ABCA1表達(dá)較con組顯著降低(P<0.05)。應(yīng)用SRT后VSMC中ABCA1表達(dá)較ox-LDL組顯著升高(P<0.05)；應(yīng)用Nic則使VSMC中ABCA1表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖5。

圖5 SIRT1對血管平滑肌細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中ABCA1表達(dá)的影響

2.4LXRα介導(dǎo)VSMC中SIRT1對ABCA1表達(dá)的促進(jìn)作用 進(jìn)一步檢測ox-LDL誘導(dǎo)VSMC源性泡沫細(xì)胞中LXRα的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ox-LDL組LXRα表達(dá)較con組顯著降低(P<0.05)；SRT可顯著上調(diào)VSMC中LXRα的表達(dá)(P<0.05)；應(yīng)用Nic則使細(xì)胞中LXRα的表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.05)。見圖6。GW3965可顯著上調(diào)ABCA1的表達(dá)(P<0.05)，同時細(xì)胞中紅色脂滴顯著減少；而GGPP則使細(xì)胞中ABCA1表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.05)，油紅染色陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多。見圖7、圖8。

圖6 Western blot法檢測LXRα介導(dǎo)各組血管平滑肌細(xì)胞中LXRα的表達(dá)

圖8 油紅染色檢測LXRα介導(dǎo)各組血管平滑肌細(xì)胞泡沫化的程度(×400)

3 討論

動脈粥樣硬化是發(fā)生在動脈壁，以血管內(nèi)皮下泡沫細(xì)胞大量堆積為特征的慢性血管性疾病。泡沫細(xì)胞是由巨噬細(xì)胞或VSMC攝取脂質(zhì)成分，在細(xì)胞內(nèi)大量合成膽固醇酯并形成脂質(zhì)小體。泡沫細(xì)胞沉積是動脈粥樣硬化的重要標(biāo)志，也是構(gòu)成粥樣斑塊的主要成分，抑制泡沫細(xì)胞的形成已成為動脈粥樣硬化防治的重要內(nèi)容。既往認(rèn)為泡沫細(xì)胞主要為巨噬細(xì)胞源性，后來研究認(rèn)為VSMC也具有在細(xì)胞內(nèi)聚積膽固醇酯并泡沫樣變的能力。在動脈粥樣硬化中晚期,僅有30%的泡沫細(xì)胞為巨噬細(xì)胞源性，而45%為VSMC源性[11]。因此，深入研究VSMC源性泡沫細(xì)胞的形成機(jī)制，確定調(diào)節(jié)這一過程的關(guān)鍵因子，是延緩動脈粥樣硬化進(jìn)程的重要環(huán)節(jié)。

SIRT1是高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白去乙?；傅募易宄蓡T之一[12-14]。研究證實(shí)，SIRT1通過乙?；瘍?nèi)皮型一氧化氮合酶和增加一氧化氮生物利用度，起到調(diào)節(jié)內(nèi)皮依賴性血管舒縮張力的作用[15]，SIRT1過表達(dá)能夠抑制ox-LDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[16]，表明SIRT1對血管健康發(fā)揮有益作用。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL能顯著誘導(dǎo)VSMC泡沫化；活化SIRT1能夠顯著減輕ox-LDL的作用，油紅染色陽性細(xì)胞明顯減少，而應(yīng)用Nic抑制細(xì)胞中SIRT1表達(dá)后VSMC中脂質(zhì)沉積明顯增多。提示SIRT1可能為防治動脈粥樣硬化的潛在靶點(diǎn)。

VSMC中脂質(zhì)的聚集涉及細(xì)胞對脂質(zhì)的攝取、膽固醇酯的胞內(nèi)合成及RCT等過程。RCT是指外周細(xì)胞(包括動脈壁細(xì)胞)在各級脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體作用下，將細(xì)胞中過剩的膽固醇經(jīng)膽汁酸代謝排出體外。機(jī)體通過這一過程清除細(xì)胞內(nèi)過量的膽固醇，抑制泡沫細(xì)胞的形成。RCT的關(guān)鍵步驟是由細(xì)胞膜上的ABCA1以ATP為能源進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，可將細(xì)胞內(nèi)的膽固醇、磷脂等脂類物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜外的載脂蛋白A-I(ApoA-I)，從而清除細(xì)胞中的多余脂質(zhì)。ABCA1在泡沫細(xì)胞形成和動脈粥樣硬化病變發(fā)病過程中的重要作用已被各種臨床和基礎(chǔ)研究證實(shí)，血小板衍生生長因子可顯著降低VSMC中ABCA1的表達(dá)，同時使ApoA-I介導(dǎo)的膽固醇外流顯著減少[17]。Choi等[18]研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化病變內(nèi)膜VSMC中的ABCA1表達(dá)較中膜明顯下降,伴有ApoA-I結(jié)合異常、高密度脂蛋白形成障礙及細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量顯著增多。因此，ABCA1異常是引起VSMC中RCT障礙和膽固醇聚集的重要原因。為探究ABCA1在VSMC泡沫化中的作用，我們檢測激活或抑制細(xì)胞中SIRT1時的ABCA1表達(dá)情況，結(jié)果表明在原代培養(yǎng)的VSMC中激活SIRT1能夠上調(diào)細(xì)胞中ABCA1的表達(dá)，應(yīng)用抑制劑抑制細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)后VSMC中ABCA1的表達(dá)也明顯下調(diào)。提示在VSMC源性泡沫細(xì)胞形成過程中，SIRT1是通過上調(diào)ABAC1的表達(dá)來抑制VSMC的泡沫化。

肝X受體(LXRs)是核受體超家族成員，是受配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，包括LXRα和LXRβ[19]。LXRs主要參與脂質(zhì)和膽固醇代謝的調(diào)節(jié)[20]，近年研究表明，LXRs通過與配體結(jié)合還參與炎癥[21]和免疫功能[22]的調(diào)節(jié)。其中，LXRα廣泛分布于肝臟、脂肪、腸道等組織，在體內(nèi)膽固醇代謝中起調(diào)節(jié)作用[23]。LXRα活化后與上游靶基因LXRE結(jié)合，調(diào)節(jié)包括ABCA1在內(nèi)的多種基因表達(dá)，參與細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積[24]。研究顯示，SIRT1可使組蛋白和很多下游靶蛋白去乙?；⒄{(diào)節(jié)其活性，其中包括LXRs。抑制SIRT1的表達(dá)能夠減弱LXRs在心肌損傷中的保護(hù)作用[25]。巨噬細(xì)胞源性SIRT1能夠在K432位點(diǎn)通過去乙?；饔眉せ頛XRα，進(jìn)而上調(diào)LXRα靶蛋白ABCA1等的表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流[9]。為探討LXRα在激活SIRT1時是否減輕ox-LDL誘導(dǎo)VSMC泡沫化的作用，我們分別檢測予SRT及Nic時細(xì)胞中LXRα的表達(dá)情況。結(jié)果表明，激活SIRT1后LXRα的表達(dá)隨之升高，抑制SIRT1后LXRα的表達(dá)隨之降低。之后，我們在細(xì)胞中分別加入LXRα激動劑GW3965及抑制劑GGPP后檢測ABCA1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示激活LXRα后ABCA1的表達(dá)上調(diào)，油紅染色陽性細(xì)胞較ox-LDL組明顯減少；抑制LXRα后ABCA1表達(dá)明顯下降，細(xì)胞中脂質(zhì)沉積情況又明顯增強(qiáng)。

綜上，激活VSMC中SIRT1能夠抑制ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞泡沫化，這一過程是通過SIRT1激活下游靶蛋白LXRα，進(jìn)而上調(diào)細(xì)胞中ABCA1的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。本研究為抑制VSMC源性泡沫細(xì)胞形成、改善動脈粥樣硬化程度提供了新的理論依據(jù)。