秦健輝，李金橋，趙旭，李克斌，曹雅忠，尹姣

銅綠麗金龜氣味結(jié)合蛋白AcorOBP11的表達(dá)純化及功能分析

秦健輝，李金橋，趙旭，李克斌，曹雅忠，尹姣

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

【】通過(guò)研究銅綠麗金龜（）氣味結(jié)合蛋白11（odorant binding protein 11，OBP11）與寄主植物揮發(fā)物的結(jié)合特性，探討AcorOBP11的功能，為闡明銅綠麗金龜識(shí)別寄主植物的嗅覺(jué)分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)RT-PCR克隆，分析其序列特征并與相似序列進(jìn)行對(duì)比；將目的基因連入原核表達(dá)載體pET28a后，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)。利用IPTG誘導(dǎo)AcorOBP11重組蛋白的表達(dá)，超聲破碎菌體，取上清液過(guò)鎳柱，利用重組腸激酶切除his標(biāo)簽后再次過(guò)鎳柱純化獲得目的蛋白；純化后的蛋白以1-NPN為熒光探針開(kāi)展熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，測(cè)定AcorOBP11蛋白與37種寄主植物揮發(fā)物的結(jié)合特性；利用Modeller對(duì)AcorOBP11進(jìn)行同源建模，以岡比亞按蚊氣味結(jié)合蛋白AgamOBP48（PDB ID：4ij7）作為模板，獲得其三維結(jié)構(gòu)；利用Autodock半柔性對(duì)接將蛋白與化合物對(duì)接，模擬AcorOBP11與6種候選寄主植物揮發(fā)物的結(jié)合情況。克隆獲得了全長(zhǎng)基因，開(kāi)放閱讀框共639 bp，N末端有17個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，具有8個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，屬于Plus-C OBP亞家族，進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明其與HparOBP9進(jìn)化關(guān)系最近。成功連入pET28a表達(dá)載體，在0.25 mmol·L-1IPTG、37℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)，并通過(guò)兩次鎳柱純化得到目的蛋白。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果表明，AcorOBP11結(jié)合譜較廣，對(duì)-紫羅蘭酮、異戊醛、丙烯酸-2-乙基己酯、乙酸龍腦酯、檸檬烯、反-2-己烯醛、2-乙基己醛、異戊酸等13種寄主植物揮發(fā)物有較好的結(jié)合能力。其中，與寄主植物揮發(fā)物-紫羅蘭酮結(jié)合能力最好，競(jìng)爭(zhēng)解離常數(shù)為22.78 μmol·L-1。構(gòu)建了AcorOBP11三維結(jié)構(gòu)圖并進(jìn)行蛋白構(gòu)象評(píng)估后，與6種化合物進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果表明AcorOBP11與-紫羅蘭酮結(jié)合自由能最低，為-24.74 kJ·mol-1，表明其與-紫羅蘭酮的結(jié)合能力最強(qiáng)，與熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合結(jié)果一致；從對(duì)接圖還可以看出，-紫羅蘭酮不僅與AcorOBP11在Cys163處形成氫鍵，而且其疏水端進(jìn)入了蛋白的疏水腔，兩個(gè)甲基與蛋白表面高度契合，因此，-紫羅蘭酮與蛋白間結(jié)合能力最強(qiáng)。AcorOBP11能夠識(shí)別多種寄主植物揮發(fā)物，推測(cè)其在銅綠麗金龜成蟲(chóng)定位寄主植物中發(fā)揮重要作用，此研究結(jié)果為生態(tài)防控銅綠麗金龜提供了新思路。

銅綠麗金龜；氣味結(jié)合蛋白11；原核表達(dá)；熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合；同源建模；分子對(duì)接

0 引言

【研究意義】銅綠麗金龜（）屬于鞘翅目，麗金龜科，是我國(guó)重要的地下害蟲(chóng)，其成蟲(chóng)主要危害榆樹(shù)、柳樹(shù)、蘋(píng)果樹(shù)、桃樹(shù)、苘麻等植物葉片，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。長(zhǎng)期以來(lái)，化學(xué)農(nóng)藥是防治銅綠麗金龜成蟲(chóng)的主要手段，但長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥不僅會(huì)殺傷天敵、增強(qiáng)害蟲(chóng)抗藥性，還會(huì)造成一定的環(huán)境問(wèn)題。研究銅綠麗金龜嗅覺(jué)蛋白對(duì)寄主植物揮發(fā)物的識(shí)別機(jī)制可明確銅綠麗金龜對(duì)寄主植物的選擇機(jī)理，為銅綠麗金龜?shù)纳鷳B(tài)防控提供新思路。【前人研究進(jìn)展】目前，開(kāi)發(fā)成蟲(chóng)引誘劑是地下害蟲(chóng)綠色防控的研究熱點(diǎn)，其中植物揮發(fā)性信息物質(zhì)是常見(jiàn)的引誘劑之一。一些寄主植物揮發(fā)性成分已被證明對(duì)金龜子有顯著的誘集作用[1]。如丁酸苯乙酯、丁香酚、香葉醇以3﹕7﹕3比例混合時(shí)對(duì)日本麗金龜（）有很好的引誘效果，引誘劑現(xiàn)已商品化[2]；由苯乙醛、苯甲醛和苯甲醇混配而成的引誘劑能強(qiáng)烈吸引扁綠麗金龜（）成蟲(chóng)[3]；鄰苯二甲酸二丁酯、肉桂醛、順-3-己烯基乙酸酯三者混配對(duì)華北大黑鰓金龜（）成蟲(chóng)有較好的引誘活性[4]。同樣地，銅綠麗金龜對(duì)甲基庚烯酮、順-3-己烯乙酸酯等植物揮發(fā)物也產(chǎn)生明顯的趨性行為反應(yīng)[5]。昆蟲(chóng)主要通過(guò)高度靈敏的嗅覺(jué)系統(tǒng)來(lái)識(shí)別環(huán)境中的寄主植物揮發(fā)物，進(jìn)而產(chǎn)生定位寄主、取食等一系列的行為反應(yīng)，其中嗅覺(jué)蛋白是其發(fā)揮嗅覺(jué)功能的基礎(chǔ)[6]。嗅覺(jué)蛋白主要在成蟲(chóng)觸角中表達(dá)，主要包括氣味結(jié)合蛋白（odorant binding protein，OBP）、化學(xué)感受蛋白（chemosensory protein，CSP）、氣味受體（odorant receptor，OR）、離子型受體（ionotropic receptor，IR）、味覺(jué)受體（gustatory receptor，GR）、感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白（sensory neuron membrane protein，SNMP）和氣味降解酶（odorant-degrading enzyme，ODE）[7]。其中OBP是昆蟲(chóng)專(zhuān)一性識(shí)別外界氣味物質(zhì)的第一步生化反應(yīng)[8]。研究表明，暗黑鰓金龜（）HparOBP1和HparOBP2主要識(shí)別寄主植物揮發(fā)物[9]，HparOBP15a可結(jié)合多種寄主植物揮發(fā)物與兩種性信息素[10]；華北大黑鰓金龜HoblOBP1、2、3、4、13識(shí)別寄主植物揮發(fā)物，HoblOBP5、8、9和24可以識(shí)別產(chǎn)卵信息素[11-14]。另外，通過(guò)分子模擬和蛋白突變解析了華北大黑鰓金龜HoblOBP1和HoblOBP1/OBP2異源二聚體對(duì)寄主植物揮發(fā)物識(shí)別的分子機(jī)制[15]，為闡明鰓金龜?shù)男嵊X(jué)識(shí)別機(jī)制打下了基礎(chǔ)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】作為田間優(yōu)勢(shì)種群且成蟲(chóng)危害嚴(yán)重的銅綠麗金龜?shù)男嵊X(jué)蛋白研究較少，僅探討了AcorOBP1識(shí)別寄主植物小葉女貞揮發(fā)物的功能[16]。因此，本研究通過(guò)克隆銅綠麗金龜OBP11的全長(zhǎng)基因（），原核表達(dá)并純化獲得重組蛋白，利用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)明確其與37種寄主植物揮發(fā)物的結(jié)合特征，結(jié)合同源建模和分子對(duì)接探討蛋白與不同化合物的結(jié)合機(jī)理。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究AcorOBP11與寄主植物揮發(fā)物的結(jié)合特性，為闡明銅綠麗金龜在定位寄主植物過(guò)程中的嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 供試材料

銅綠麗金龜采集于河北省石家莊市，成蟲(chóng)飼養(yǎng)于養(yǎng)蟲(chóng)盒中（60 cm×50 cm×40 cm），室溫（25±1）℃，光周期為16L﹕8D。將羽化5—7日齡成蟲(chóng)的觸角用鑷子取下后迅速置于液氮中速凍，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Trizol試劑購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司，F(xiàn)astKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑、膠回收試劑盒購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司，限制性?xún)?nèi)切酶HⅠ、d Ⅲ購(gòu)于日本Takara公司，1×Taq PCR Master Mix、DNA Marker、感受態(tài)細(xì)胞DH5、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于北京博邁德基因技術(shù)有限公司，PEASY-T載體、Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞、重組腸激酶購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司，T4 DNA Ligase購(gòu)于Promega公司，Kan、Amp、X-gal、IPTG購(gòu)于Sigma公司，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 RNA提取及cDNA第一鏈的合成

收集銅綠麗金龜雌、雄成蟲(chóng)的觸角各60對(duì)，平均分裝到3個(gè)1.5 ml離心管中，將收集到的樣品立即置于預(yù)冷的無(wú)RNA酶研缽中研磨，根據(jù)TRIzol試劑提供的說(shuō)明書(shū)提取觸角總RNA，加入適量DEPC水溶解沉淀。利用核酸蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度及質(zhì)量，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。按照FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，作為RT-PCR的擴(kuò)增模板。

1.3 AcorOBP11克隆及序列分析

根據(jù)GenBank登錄的（KM251651）基因全長(zhǎng)序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，引物加上H Ⅰ和d Ⅲ酶切位點(diǎn)（下劃線表示）及保護(hù)堿基，上下游引物分別為AcorOBP11F：5′-CGTTCGAGGATCAGGCT TATAAT-3′；AcorOBP11R：5′-CCCTTAGCA CTTGACAGGTGGTG-3′。

以1.2反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中cDNA模板2 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各2 μL，其余用1×Taq PCR Master Mix補(bǔ)齊。擴(kuò)增程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，45℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，按照普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收符合預(yù)期大小的DNA片段。將回收產(chǎn)物與PEASY-T載體連接，轉(zhuǎn)化到Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞中，在含有IPTG、X-gal和AMP的LB固體培養(yǎng)基中進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選5個(gè)陽(yáng)性菌落至10 μl ddH2O中，進(jìn)行菌落PCR，利用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證目的基因是否成功插入。將正確的陽(yáng)性菌落置于LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12—16 h（37℃，220 r/min），送至生工生物工程公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)進(jìn)一步驗(yàn)證。

利用ClustaX2.1進(jìn)行AcorOBP11與其他昆蟲(chóng)OBP的多序列比對(duì)，通過(guò)MEGA7軟件中的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4 AcorOBP11基因重組表達(dá)載體構(gòu)建及原核表達(dá)純化

利用限制性?xún)?nèi)切酶HⅠ和d Ⅲ將含有目的片段的重組克隆質(zhì)粒PEASY-T-AcorOBP11和表達(dá)載體pET28a進(jìn)行雙酶切，用普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別回收表達(dá)載體和目的片段。利用T4 DNA連接酶將目的片段連接到表達(dá)載體pET28a上，再轉(zhuǎn)化到DH5感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)，送至生工生物工程公司測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET28a/AcorOBP11轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，培養(yǎng)測(cè)序。將測(cè)序正確的菌液按1﹕100（v/v）的比例接種于新鮮的LB液體培養(yǎng)基（含終濃度50 μg·mL-1Kan）中，37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.8—1.0時(shí)，加入終濃度為0.25 mmol·L-1IPTG溶液進(jìn)行誘導(dǎo)，37℃，220 r/min搖床中誘導(dǎo)4 h。離心收集菌體，加入裂解液將菌體重新懸浮，超聲波破碎，12 000 r/min離心30 min，收集上清和沉淀，用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的表達(dá)。使用鎳柱親和層析方法純化蛋白，使用咪唑磷酸緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，純化后蛋白用重組腸激酶切除His標(biāo)簽，再次過(guò)柱純化，置于50 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.4）緩沖液中過(guò)夜透析，定量至2 μmol·L-1，置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)

分別選擇來(lái)源于榆樹(shù)、蘋(píng)果樹(shù)、桃樹(shù)等銅綠麗金龜寄主植物的37種植物揮發(fā)物（表1）作為候選配體化合物，以色譜級(jí)甲醇為溶劑將各氣味溶液配制成1 mmol·L-1的試樣。使用970 CRT熒光分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)公司）進(jìn)行熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)，供試容器為1 cm寬的石英比色皿，激發(fā)狹縫10 nm，靈敏度為1，設(shè)定激發(fā)光波長(zhǎng)為337 nm，掃描波長(zhǎng)的范圍設(shè)定為350—520 nm。

取2 mL濃度為2 μmol·L-1的AcorOBP11重組蛋白溶液加入石英比色皿中，逐次加入2 μmol·L-11-NPN直至熒光強(qiáng)度值達(dá)到飽和值。分別記錄每個(gè)濃度梯度產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度最大值，利用Scatchard方程計(jì)算重組蛋白與1-NPN的結(jié)合常數(shù)K1-NPN。

在比色皿中加入2 mL濃度為2 μmol·L-1的AcorOBP11蛋白溶液，再加入1-NPN使其終濃度為2 μmol·L-1。將配制好的氣味標(biāo)樣逐次加入到比色皿中，使終濃度由2 μmol·L-1遞增至40 μmol·L-1，記錄熒光強(qiáng)度峰值的變化。假設(shè)AcorOBP11活性為100%，且在飽和狀態(tài)下配體與蛋白按照1﹕1的比例結(jié)合。根據(jù)公式Ki＝[IC50]/（1+[1-NPN]/K1?NPN）計(jì)算重組蛋白AcorOBP11與配體的結(jié)合常數(shù)Ki。[IC50]為AcorOBP11/1-NPN復(fù)合物的熒光強(qiáng)度下降50%的配體濃度。[1-NPN]為自由的1-NPN探針的濃度，K1?NPN為AcorOBP11/1-NPN的結(jié)合常數(shù)。

1.6 AcorOBP11同源建模及分子對(duì)接

根據(jù)AcorOBP11的氨基酸序列，利用Swiss-model（https://swissmodel.expasy.org/interactive）從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索模板，選取相似度較高且已解析三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)作為模板。利用Modeller9.24程序?qū)corOBP11氨基酸序列與模板分子序列進(jìn)行比對(duì)，使目標(biāo)序列與模板對(duì)齊，根據(jù)比對(duì)結(jié)果構(gòu)建5個(gè)可能的模型構(gòu)象，利用Modeller評(píng)分函數(shù)molecule PDF（molpdf）方法對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估，選擇DOPE score最小的結(jié)構(gòu)作為模板，并利用共軛梯度算法和分子動(dòng)力學(xué)對(duì)模板進(jìn)行優(yōu)化，產(chǎn)生5個(gè)優(yōu)化后的模板蛋白。利用Procheck（https://servicesn.mbi.ucla.edu/ PROCHECK/）對(duì)優(yōu)化后的模板蛋白主鏈鍵長(zhǎng)、鍵角及二面角的合理性、側(cè)鏈的立體化學(xué)穩(wěn)定性等特征進(jìn)行評(píng)估[17-18]，根據(jù)拉氏圖結(jié)果選擇最優(yōu)的蛋白構(gòu)象進(jìn)行后續(xù)的分子對(duì)接試驗(yàn)。

利用Autodock 4.2.6模擬AcorOBP11與寄主揮發(fā)物的結(jié)合情況。選取熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)中與AcorOBP11結(jié)合較好的-紫羅蘭酮、異戊醛、丙烯酸-2-乙基己酯、乙酸龍腦酯、檸檬烯、反-2-己烯醛6種化合物開(kāi)展分子對(duì)接。利用ChemDraw 18.0繪制配體的二維結(jié)構(gòu)，然后通過(guò)Chem3D 18.0軟件將其轉(zhuǎn)換為三維結(jié)構(gòu)，并使用MM2力場(chǎng)優(yōu)化配體的構(gòu)型以獲得最穩(wěn)定的構(gòu)象。利用Autodock 4.2.6為AcorOBP11添加極性氫原子和電荷，其中AutoGrid主要負(fù)責(zé)計(jì)算網(wǎng)格中的相關(guān)能量，而AutoDock負(fù)責(zé)構(gòu)象搜索和評(píng)估。設(shè)置GridBox大小為110×110×110，柵格間距設(shè)置為0.375 ?。采用半柔性對(duì)接，將蛋白質(zhì)設(shè)置為剛性大分子，將配體設(shè)置為柔性分子。使用Lamarckian遺傳算法尋找配體與受體最佳的結(jié)合位置狀態(tài)。利用半經(jīng)驗(yàn)的自由能計(jì)算方法計(jì)算配體與受體之間的結(jié)合能力。對(duì)接結(jié)果生成50個(gè)最佳構(gòu)象，選取結(jié)合能最小的構(gòu)象用Pymol 2.3.4和LigPlus進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 AcorOBP11序列分析

的開(kāi)放閱讀框（ORF）為639 bp，編碼212個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為23.8 kD，等電點(diǎn)為6.92，氨基酸序列的N末端有17個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽（圖1-A），將AcorOBP11與其他昆蟲(chóng)OBP的氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)（圖1-B），發(fā)現(xiàn)其在第6個(gè)保守的半胱氨酸后面含有2個(gè)保守的半胱氨酸殘基和1個(gè)脯氨酸殘基，屬于Plus-C OBP亞家族。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1-C），結(jié)果顯示AcorOBP11與HparOBP9進(jìn)化關(guān)系最近，自展值為100。

2.2 AcorOBP11蛋白表達(dá)純化

將含有pET28a/AcorOBP11質(zhì)粒的BL21（DE3）單克隆菌落接種培養(yǎng)后，取1 mL菌液作為陰性對(duì)照，經(jīng)終濃度0.25 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE結(jié)果顯示，含有His-tag的重組蛋白分子量約在30 kD，與預(yù)測(cè)的重組蛋白大小一致。將誘導(dǎo)后的菌液超聲破碎后，檢測(cè)包涵體和上清，目的蛋白主要在上清表達(dá)。蛋白純化后用重組腸激酶切除His-tag，獲得單一條帶的目的蛋白，大小在25 kD左右，符合目的蛋白大?。▓D2）。

A：AcorOBP11核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列，信號(hào)肽用單下劃線表示Nucleotide sequence and amino acid sequence of AcorOBP11. The predicted signal peptide is underlined；B：AcorOBP11與其他昆蟲(chóng)OBP的序列比對(duì)Sequences alignment of AcorOBP11 with other insect OBPs；C：AcorOBP11與其他昆蟲(chóng)OBP的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Phylogenetic tree of AcorOBP11 and other insect OBPs

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物Protein molecular weight marker；1：未誘導(dǎo)的pET28a-AcorOBP11菌體Non-induced pET28a-AcorOBP11 in Escherichiacoli；2：經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的pET28a-AcorOBP11-His目的蛋白Expressed protein pET28a-AcorOBP11-His after induction by IPTG；3：經(jīng)過(guò)鎳柱純化獲得pET28a-AcorOBP11蛋白Purified protein pET28a-AcorOBP11 through Ni-NTA column；4：經(jīng)過(guò)重組腸激酶切除His標(biāo)簽后的pET28a-AcorOBP11蛋白Purified protein pET28a-AcorOBP11 with His-tag cleaved by recombinant enterokinase

2.3 AcorOBP11與氣味配體的結(jié)合

AcorOBP11與1-NPN的結(jié)合曲線如圖3-A所示，表明AcorOBP11與1-NPN具有良好的結(jié)合特性。利用Scatchard方程可計(jì)算出復(fù)合物AcorOBP11/1-NPN的結(jié)合常數(shù)為8.819 μmol·L-1。

銅綠麗金龜與37種植物揮發(fā)物的熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果表明（表1），AcorOBP11結(jié)合譜較廣，能夠識(shí)別供試的絕大多數(shù)寄主植物揮發(fā)物，但其與不同寄主植物揮發(fā)物的結(jié)合能力存在顯著差異（圖3-B），對(duì)13種寄主植物揮發(fā)物具有較強(qiáng)的結(jié)合能力（IC50＜40 μmol·L-1）。其中，AcorOBP11與植物揮發(fā)物-紫羅蘭酮結(jié)合能力最強(qiáng)，解離常數(shù)Ki值為22.78 μmol·L-1，其次是異戊醛（Ki=24.49 μmol·L-1）、丙烯酸-2-乙基己酯（Ki=25.11 μmol·L-1）和乙酸龍腦酯（Ki=26.36 μmol·L-1）?？傮w而言，AcorOBP11更傾向于結(jié)合醛類(lèi)化合物，除了上述異戊醛，還對(duì)反-2-己烯醛、2-乙基己醛、庚醛、丁醛、辛醛有較強(qiáng)的結(jié)合能力。

表1 AcorOBP11與配體的結(jié)合特性

續(xù)表1 Continued table 1

A：AcorOBP11和1-NPN的結(jié)合曲線以及Scatchard方程Binding curves and Scatchard plots ofAcorOBP11 and 1-NPN；B：AcorOBP11與6種植物揮發(fā)物的結(jié)合曲線Binding curves of AcorOBP11 to six plant volatiles

2.4 AcorOBP11同源建模及分子對(duì)接

根據(jù)Swiss-model模板搜索的結(jié)果，選擇岡比亞按蚊（）氣味結(jié)合蛋白AgamOBP48（PDB ID：4ij7）作為模板，構(gòu)建了AcorOBP11三維結(jié)構(gòu)圖（圖4-A），其主要包括6個(gè)螺旋，分別由51—69（1）、82—91（2）、102—113（3）、117—137（4）、146—162（5）、172—184（6）位氨基酸組成。利用Procheck評(píng)估蛋白構(gòu)象的合理性，分析拉氏圖（圖4-B）可知，AcorOBP11序列中位于最佳區(qū)域和較適合區(qū)域的氨基酸殘基總和＞90%，其中87.7%的氨基酸殘基位于最佳區(qū)域，9.4%的氨基酸殘基位于較合適區(qū)，表明構(gòu)建的AcorOBP11三維結(jié)構(gòu)是合理的。

由構(gòu)建的AcorOBP11三維結(jié)構(gòu)和6種化合物進(jìn)行分子對(duì)接結(jié)果可知（表2），AcorOBP11與6種化合物均具有較低的結(jié)合能，其中與-紫羅蘭酮結(jié)合能最低，為-24.74 kJ·mol-1，表明其結(jié)合能力最強(qiáng)。由蛋白與配體結(jié)合的二維圖可以看出（圖5），-紫羅蘭酮、乙酸龍腦酯、異戊醛、丙烯酸-2-乙基己酯和反-2-己烯醛5種化合物分別與蛋白結(jié)合腔中的Cys163、Lys51、Glu52、Ala53、Asn176等氨基酸殘基形成了氫鍵，檸檬烯雖然未與結(jié)合腔中的氨基酸殘基形成氫鍵，但與12個(gè)氨基酸形成疏水作用。另外，由蛋白與配體結(jié)合的三維圖（圖6）可以看出，-紫羅蘭酮的疏水端進(jìn)入了蛋白的疏水腔中，兩個(gè)甲基與蛋白表面契合，幾何匹配度極高，因此，-紫羅蘭酮與蛋白間結(jié)合能力最強(qiáng)；乙酸龍腦酯、丙烯酸-2-乙基己酯、異戊醛也分別與結(jié)合腔表面凹槽形狀匹配；反-2-己烯醛與檸檬烯則完全進(jìn)入了蛋白結(jié)合腔內(nèi)部，周?chē)肿娱g作用力很緊密，因此結(jié)合力較強(qiáng)。

表2 AcorOBP11與配體的結(jié)合能

3 討論

銅綠麗金龜利用靈敏的嗅覺(jué)系統(tǒng)來(lái)識(shí)別環(huán)境中的寄主植物揮發(fā)物等氣味化合物，氣味結(jié)合蛋白是其行使嗅覺(jué)功能的重要嗅覺(jué)蛋白[19]。本文克隆了，其編碼的氨基酸序列在第6個(gè)半胱氨酸后存在2個(gè)保守的半胱氨酸殘基和1個(gè)保守的脯氨酸殘基，屬于Plus-C OBP亞家族，具有鞘翅目氣味結(jié)合蛋白的典型特征。寄主植物揮發(fā)物在昆蟲(chóng)對(duì)寄主植物的定位、識(shí)別、取食和產(chǎn)卵等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[20]。本研究選取了37種銅綠麗金龜寄主植物揮發(fā)物，AcorOBP11與其中13種化合物具有較好的結(jié)合能力，如反-2-己烯醛、反-2-己烯醇、辛醛、庚醛等化合物均能引起銅綠麗金龜強(qiáng)烈的行為反應(yīng)[5,21]，表明AcorOBP11在銅綠麗金龜對(duì)寄主植物的識(shí)別定位中發(fā)揮著重要作用。然而，水楊酸甲酯、-松油醇、石竹烯、羅勒烯、3,4-二甲基苯乙酮、苯甲醛、壬醛、法尼烯等植物揮發(fā)物雖然也能引起銅綠麗金龜成蟲(chóng)的行為趨性，但是與AcorOBP11結(jié)合較弱或不結(jié)合，推測(cè)這些寄主植物揮發(fā)物由銅綠麗金龜其他OBP識(shí)別，不同OBP分工明確，協(xié)同配合，共同完成其對(duì)寄主植物的識(shí)別過(guò)程[5,21]。

圖4 AcorOBP11的三維結(jié)構(gòu)模型（A）及拉氏圖（B）

圖5 AcorOBP11與配體相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基（二維結(jié)構(gòu)）

圖6 AcorOBP11與配體相互作用的氨基酸殘基（三維結(jié)構(gòu)）

選取的37種寄主植物揮發(fā)物包含酮類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)、烯類(lèi)、酸類(lèi)、醇類(lèi)和酚類(lèi)化合物，其中AcorOBP11與醛類(lèi)化合物結(jié)合種類(lèi)最多，與酮類(lèi)、酯類(lèi)、烯類(lèi)、酸類(lèi)都可結(jié)合，但不能與醇類(lèi)和酚類(lèi)化合物結(jié)合，說(shuō)明化合物的官能團(tuán)可影響AcorOBP11與寄主植物揮發(fā)物的結(jié)合。DENG等研究表明，氣味分子的碳原子數(shù)影響配體與蛋白的結(jié)合能力，在一定范圍內(nèi)，隨著碳原子數(shù)的增加，配體與重組蛋白的結(jié)合能力逐漸減弱[11,22-23]；JU等研究認(rèn)為氣味配體的結(jié)合能力與配體的碳原子個(gè)數(shù)之間無(wú)明顯線性關(guān)系[9,24-25]。本研究通過(guò)熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合和分子對(duì)接試驗(yàn)表明，配體與AcorOBP11的結(jié)合能力與碳鏈長(zhǎng)度不呈線性相關(guān)。AcorOBP11既可以結(jié)合-紫羅蘭酮（C13）、乙酸龍腦酯（C12）、丙烯酸-2-乙基己酯（C11），也可以結(jié)合丁醛（C4）、異戊醛（C5）、異戊酸（C5）。根據(jù)氣味結(jié)合蛋白的三維結(jié)構(gòu)模擬可以看出，其表面可形成形狀各異的凹槽，推測(cè)化合物通過(guò)誘導(dǎo)契合原理結(jié)合在形狀與之匹配的凹槽中，因此同一蛋白可能會(huì)結(jié)合不同大小及官能團(tuán)的配體[26]。

熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合和分子對(duì)接試驗(yàn)中，AcorOBP11均與-紫羅蘭酮結(jié)合能力最強(qiáng)，主要是由于-紫羅蘭酮與AcorOBP11在Cys163處形成長(zhǎng)3.11 ?的氫鍵，推測(cè)氫鍵是一種較強(qiáng)的分子間作用力，可使蛋白與配體結(jié)合更加穩(wěn)定。盡管其他化合物也與蛋白疏水腔形成了氫鍵，但-紫羅蘭酮不僅與蛋白形成氫鍵，其疏水端進(jìn)入了蛋白的結(jié)合腔中，兩個(gè)甲基與蛋白表面高度契合，因此，推測(cè)蛋白結(jié)合腔與氣味配體間的契合程度可以增加蛋白結(jié)合配體的穩(wěn)定性。

分子對(duì)接從理論分析角度計(jì)算蛋白與配體的作用，與熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果一致，研究結(jié)果明確了AcorOBP11蛋白的識(shí)別譜，推測(cè)AcorOBP11在銅綠麗金龜寄主植物的定位過(guò)程中發(fā)揮作用，不僅為解析銅綠麗金龜?shù)男嵊X(jué)識(shí)別機(jī)制打下了基礎(chǔ)，也為其生態(tài)防控提供了新思路。后續(xù)將通過(guò)RNA干擾、行為生測(cè)等進(jìn)行功能的驗(yàn)證，利用分子動(dòng)力學(xué)模擬、蛋白突變等手段探究蛋白與化合物的結(jié)合過(guò)程，深度解析AcorOBP11的功能；并進(jìn)一步開(kāi)展氣味受體識(shí)別植物揮發(fā)物的功能研究，以期系統(tǒng)解析銅綠麗金龜定位寄主植物的分子機(jī)制。

4 結(jié)論

AcorOBP11能結(jié)合多種寄主植物揮發(fā)物，表明其可能在銅綠麗金龜找尋與定位寄主植物的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果可為解析銅綠麗金龜嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)制打下理論基礎(chǔ)，并為害蟲(chóng)的無(wú)害化防控提供分子靶標(biāo)。

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Expression, purification and functional analysis of Odorant Binding Protein 11 (OBP11) in

QIN JianHui, LI JinQiao, ZHAO Xu, LI KeBin, CAO YaZhong, YIN Jiao

State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193

【】The objective of this research is to explore the function ofodorant binding protein 11 (AcorOBP11) by studying the binding characteristics of AcorOBP11 with the host plant volatiles, and to lay the foundation for clarifying the olfactory molecular mechanism of AcorOBP11.【】Reverse transcription PCR (RT-PCR) was used to clone the full-length ORF ofby specific primers,and sequences with high similarity were downloaded for sequence comparison and analysis by BLAST. Prokaryotic expression of AcorOBP11 was conducted byprotein expression system,thewas inserted into the expression vector pET28a, and the recombinant plasmid was transferred intocompetent cells BL21 (DE3). The target protein was purified by using recombinant enterokinase to remove the His-tag and purified again by using a nickel column. The purified protein was diluted with 50 mmol·L-1Tris-HCl (pH 7.4) to a dilution of 2 μmol·L-1, and the odorant was diluted with chromatographic grade methanol to a final concentration of 1 mmol·L-1, and 1-NPN was used as a fluorescent probe to determine the binding characteristics of AcorOBP11 to 37 host plant volatiles by fluorescence competitive binding assay. Modeller was used to obtain the three-dimensional structure of AcorOBP11 by using AgamOBP48 (PDB ID: 4ij7) as a template. Autodock semi-flexible docking was used to simulate the binding of AcorOBP11 to host plant volatiles.【】The full-length ORF ofwas amplified, which is 639 bp in total, including 17 amino acids of signal peptide at the N-terminal. With eight conserved cysteine sites, AcorOBP11 belongs to the Plus-C OBP subfamily. The evolutionary tree results indicated that it had the closest evolutionarily relationship with HparOBP9.was successfully inserted into pET-28a and expressed at 0.25 mmol·L-1IPTG and induced expression at 37℃. the target protein was obtained by nickel column purification twice. The results of competitive binding experiments showed that AcorOBP11 has a good binding ability to 13 kinds of host plant volatiles, such as-ionone, 3-methylbutanal, 2-ethylhexyl acrylate, bornyl acetate, cinene, trans-2-hexenal, 2-ethylhexanal, isovaleric acid. Among them,-ionone has the best binding ability, and its competitive dissociation constant is 22.78 μmol·L-1. The molecular docking results showed that AcorOBP11 has the lowest binding free energy with-ionone, which is -24.74 kJ·mol-1, and forms a hydrogen bond at Cys163, indicating that it has the strongest binding ability with-ionone, which is consistent with the fluorescence competition binding result.【】AcorOBP11 can recognize a variety of host plant volatiles, and it is speculated that it plays an important role in locating host plants for.The results will provide new insights forecological control.

; odorant binding protein 11 (OBP11); prokaryotic expression; fluorescence competitive binding; homology modeling; molecular docking

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.008

2020-10-31；

2020-12-05

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD0201000）

秦健輝，E-mail：17863800974@163.com。通信作者尹姣，E-mail：jyin@ippcaas.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）