張碩，智慧，唐嬋娟，羅明昭，湯沙，賈冠清，賈彥超，刁現(xiàn)民

谷子條紋葉突變體的細(xì)胞學(xué)特性分析及基因定位

張碩1,2，智慧1，唐嬋娟1，羅明昭1，湯沙1，賈冠清1，賈彥超1，刁現(xiàn)民1

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081；2湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，武漢 430064

【】谷子是C4模式植物，其葉色突變體是研究C4光合途徑的良好材料。通過研究谷子條紋葉突變體的細(xì)胞學(xué)特性并對突變基因進(jìn)行定位，為克隆突變基因、解析谷子葉綠體合成及發(fā)育機(jī)理、進(jìn)一步理解C4光合調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。谷子條紋葉突變體是由育種創(chuàng)制的中間材料A36自然變異而來。對比及其正常表型等基因系的表型特征，調(diào)查二者的株高、葉寬、葉長、穗重、千粒重、結(jié)實(shí)率等農(nóng)藝性狀指標(biāo)；測定和的葉綠素含量、凈光合速率、胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率等光合指標(biāo)，分析的光合特性；觀察和對照品種豫谷1號(hào)的葉片半薄橫截切片和超薄切片，分析葉片解剖結(jié)構(gòu)特征，分別統(tǒng)計(jì)葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞中葉綠體的數(shù)量和面積，從而分析葉綠體合成及發(fā)育情況；構(gòu)建×SSR41的F2分離群體，統(tǒng)計(jì)群體中正常表型單株與條紋葉單株的數(shù)量，進(jìn)行遺傳分析；分別構(gòu)建F2分離群體正常單株與條紋葉單株的DNA混池，采用集團(tuán)分離分析法（BSA法）進(jìn)行突變基因的定位；篩選、開發(fā)多個(gè)SSR標(biāo)記及In-Del標(biāo)記，掃描F2群體中條紋葉單株，進(jìn)行進(jìn)一步基因定位。谷子條紋葉突變體在全生育期表現(xiàn)出葉片不規(guī)則白色條紋的表型。農(nóng)藝性狀分析表明，相比其近等基因系，在株高、葉寬、穗重、千粒重、結(jié)實(shí)率等表型上均顯著下降。光合指標(biāo)測定表明葉片中葉綠素含量明顯降低，尤其是葉綠素b含量下降更為嚴(yán)重，同時(shí)凈光合速率也明顯下降。葉片解剖結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，與對照豫谷1號(hào)相比，的Kranz結(jié)構(gòu)變化并不明顯，但葉綠體數(shù)量和大小都顯著低于對照。觀察葉綠體超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)的不同細(xì)胞間葉綠體發(fā)育狀況差異較大，依據(jù)葉綠體發(fā)育情況可將葉片細(xì)胞可分為3類：Ⅰ類細(xì)胞具有正常發(fā)育的葉綠體；Ⅱ類細(xì)胞葉綠體基粒及片層結(jié)構(gòu)減少；Ⅲ類細(xì)胞則葉綠體結(jié)構(gòu)嚴(yán)重異常甚至不含有葉綠體。遺傳分析表明表型受隱性單基因控制，利用F2分離群體將突變基因定位在第4染色體7.66—27.90 Mb區(qū)間內(nèi)。谷子條紋葉突變體表現(xiàn)為農(nóng)藝性狀及光合能力下降，葉片細(xì)胞葉綠體的數(shù)量、大小及結(jié)構(gòu)均表現(xiàn)出顯著異常。條紋葉性狀受隱性單基因控制，利用分子標(biāo)記將候選基因定位于第4染色體7.66—27.90 Mb區(qū)間內(nèi)。

谷子；條紋葉突變體；葉綠體；基因定位

0 引言

【研究意義】谷子（(L.) P. Beauv.）屬于禾本科（Granineae）黍亞科（Panicoideae）狗尾草屬（），是中國北方傳統(tǒng)糧食作物[1]。谷子為二倍體植物，基因組?。▋H430 Mb左右）。近年來，隨著谷子高質(zhì)量基因組序列的獲得[2-4]，以及一些矮稈早熟品種高效遺傳轉(zhuǎn)化的突破[5]，谷子作為功能基因組研究的模式作物而逐漸受到重視[6-7]。谷子同時(shí)也是典型的C4植物，隨著環(huán)境問題及糧食安全問題的日趨嚴(yán)重，科學(xué)家提出將C4光合途徑引入C3水稻及其他C3主要糧食和經(jīng)濟(jì)作物中，從而提高其產(chǎn)量和耐逆性的設(shè)想。谷子與傳統(tǒng)的C4模式植物玉米和高粱相比，生育期短且基因組簡單，加之其與水稻具有高度的基因組共線性，使其成為研究C4光合途徑、構(gòu)建水稻C4光合系統(tǒng)的新的模式植物。突變體是基因挖掘與功能研究的重要工具，目前，許多國內(nèi)外機(jī)構(gòu)都在廣泛開展谷子及其野生近緣種狗尾草（(L.) P. Beauv.）C4光合相關(guān)突變體的篩選及研究工作[8-10]。葉色突變體通常具有光合能力下降、光合器官結(jié)構(gòu)異常等特點(diǎn)，是研究光合作用的重要材料。利用谷子葉色突變體開展光合生理學(xué)及細(xì)胞學(xué)觀察，進(jìn)而開展葉色調(diào)控基因的功能研究，對于進(jìn)一步理解C4光合途徑機(jī)理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物葉色突變體具有多種類型，調(diào)控葉色的基因及機(jī)理也各不相同。目前，研究較為廣泛且深入的葉色調(diào)控基因主要包括以下幾類：（1）參與葉綠素合成及代謝的基因，比較典型的包括鎂離子螯合酶D/I/H亞基的編碼基因、和[11-12]、葉綠素a加氧酶基因[13]、葉綠素b還原酶基因[14]等，這些基因的變異往往導(dǎo)致葉片發(fā)生白化、黃化或持綠等均勻的葉色變化，有些還伴隨葉綠體結(jié)構(gòu)的異常；（2）參與葉綠體形成及發(fā)育的基因，這些基因中有些是直接編碼某些葉綠體蛋白或結(jié)構(gòu)組分的，例如葉綠體蛋白酶基因[15]、類囊體結(jié)合蛋白基因[16]等，這些基因變異會(huì)導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)異常，有些則參與調(diào)控葉綠體基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響葉綠體的形成及發(fā)育，這類基因的突變很多都會(huì)導(dǎo)致白化甚至致死等嚴(yán)重后果，例如葉綠體核糖體L13蛋白基因[17]、質(zhì)體RNA聚合酶相關(guān)蛋白基因[18]、參與葉綠體RNA編輯及剪切的[19]等；（3）一些參與鉀、鐵等金屬離子吸收及運(yùn)輸?shù)幕颍@些基因突變后，通常會(huì)影響葉綠體的正常發(fā)育，導(dǎo)致葉色變異，例如鐵螯合物運(yùn)輸基因[20]、鉀離子外排逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因[21]等；（4）一些參與核酸合成及代謝的基因，在其功能喪失后，機(jī)體為保證核基因及線粒體基因的正常復(fù)制，會(huì)被迫犧牲葉綠體基因的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致葉綠體合成發(fā)育受到抑制，發(fā)生條紋或白化等葉色異常，例如尿嘧啶核苷酸激酶基因[22]、核糖核苷酸還原酶小亞基基因/[23]等?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，已經(jīng)在谷子上克隆了若干調(diào)控葉色的基因，包括鎂離子螯合酶D亞基編碼基因[24]、核糖核苷酸還原酶大亞基基因[25]、脫氧胞苷脫氨酶基因[26]、金屬肽鏈內(nèi)切酶[27]、類PsbP蛋白編碼基因[28]等。然而，對于C4模式植物谷子而言，目前克隆的葉色調(diào)控基因尚少，C4植物葉綠體合成、發(fā)育及光合作用相關(guān)基因的研究基礎(chǔ)仍然缺乏?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究中谷子突變體是來源于育種創(chuàng)制材料A36的一個(gè)自然突變體，葉片具有不規(guī)則白色條紋。通過對的光合參數(shù)、葉片細(xì)胞葉綠體合成發(fā)育情況進(jìn)行觀察分析，以探究葉色變異造成的光合生理和細(xì)胞學(xué)影響，并利用BSA圖位克隆技術(shù)對條紋葉致變基因進(jìn)行定位，以期為谷子光合作用相關(guān)基因的鑒定和功能分析提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

谷子突變體由育種創(chuàng)制的中間材料A36（1066A×創(chuàng)62后代穩(wěn)定系）自然變異而來，其葉片全生育期表現(xiàn)出不規(guī)則白條紋，經(jīng)多代自交后表型穩(wěn)定。與A36系回交多代后，分離得到的正常表型等基因系，在農(nóng)藝性狀及光合參數(shù)測定中作為對照。豫谷1號(hào)為華北夏谷區(qū)廣泛栽培的品種，也是最早完成基因組測序的谷子品種，在以往各研究中廣泛作為參照品種使用，在本研究中用作葉片解剖結(jié)構(gòu)和葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察的對照。

1.2 表型及農(nóng)藝性狀調(diào)查

突變體及其正常表型的等基因系于2017年夏季種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所網(wǎng)室（北京，116°20′E，39°56′N）進(jìn)行表型觀察，并于抽穗后調(diào)查株高、葉長、葉寬、穗長、穗粗等農(nóng)藝性狀，待成熟且籽粒自然風(fēng)干后，測定穗重、千粒重、結(jié)實(shí)率等產(chǎn)量相關(guān)性狀。每組性狀測定時(shí)取5個(gè)重復(fù)，結(jié)果采用檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 葉綠素含量測定

取和拔節(jié)期相同葉位的新鮮葉片各0.2 g，剪碎后于95%乙醇中避光震蕩48 h直至葉片完全變白，充分提取葉綠素。采用Lichtenthaler[29]的方法，分別測定665和649 nm波長下的OD值，并計(jì)算葉綠素a與葉綠素b的含量。計(jì)算公式為：Chl a=13.95OD665—6.88OD649，Chl b=24.96OD649—7.32OD665。設(shè)定3個(gè)重復(fù)，結(jié)果采用檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 光合參數(shù)測定

選擇晴朗天氣，于上午9：00—11：00，利用Li-6400便攜式光合測定儀分別測定抽穗期與旗葉的凈光合速率、胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度及蒸騰速率。設(shè)定5組重復(fù)，結(jié)果采用檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 葉片橫截切片制作及葉綠體數(shù)量、面積的統(tǒng)計(jì)

取苗期表型特征明顯的葉片及豫谷1號(hào)葉片，剪成2 mm×1 mm的長方形碎片，于2.5%的戊二醛固定液中抽真空，并過夜固定。固定好的材料經(jīng)脫水透明后，包埋于樹脂中，并使用切片機(jī)進(jìn)行葉片橫截切片，切片厚度10 μm。切片用0.2%甲苯胺藍(lán)染色后，于顯微鏡下觀察葉片解剖結(jié)構(gòu)。統(tǒng)計(jì)視野中所有葉肉細(xì)胞及維管束鞘細(xì)胞中葉綠體的數(shù)量，分別統(tǒng)計(jì)了117個(gè)豫谷1號(hào)葉片細(xì)胞和318個(gè)葉片細(xì)胞，并對葉綠體數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對橫截切片進(jìn)行拍照后，利用Image-Pro plus 6.0軟件分別統(tǒng)計(jì)照片中所有維管束鞘細(xì)胞葉綠體和葉肉細(xì)胞葉綠體的面積，計(jì)算平均值，并利用檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 透射電鏡觀察

取苗期表型特征明顯的葉片及豫谷1號(hào)葉片，小心剪成2 mm×1 mm的長方形碎片，于2.5%戊二醛固定液中抽真空固定，并包埋于樹脂中。之后用超薄切片機(jī)切片并用醋酸雙氧鈾（uranyl acetate，UA）染色。使用JEM-1230透射電鏡觀察，并照相。

1.7 遺傳分析及基因定位

以作為母本，以谷子品種SSR41作為父本，進(jìn)行雜交。觀察F1表型并自交產(chǎn)生F2。對F2分離群體中正常表型及條紋葉植株數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并取F2中所有條紋葉后代共881株的葉片用于基因定位。

基因定位首先采用集團(tuán)分離分析法（BSA法），選取條紋葉表型的F2代20株，采用CTAB法提取DNA，測定濃度后等量混合構(gòu)建混池。在谷子基因組9條染色體上篩選與SSR41間存在多態(tài)性的SSR標(biāo)記共60個(gè)，以、SSR41、F1、混池DNA為模板，利用這些標(biāo)記分別進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)帶型判斷標(biāo)記與目標(biāo)基因的連鎖情況。找到連鎖標(biāo)記后，在連鎖標(biāo)記上下游選取多態(tài)性標(biāo)記，掃描所有的F2條紋葉單株，并統(tǒng)計(jì)連鎖交換事件，以確定目標(biāo)基因所在區(qū)間。

2 結(jié)果

2.1 A36-S條紋葉突變體的表型特征分析

谷子突變體是由A36系自然突變而來的條紋葉突變體，其葉片全生育期表現(xiàn)出白色不規(guī)則條紋（圖1）。是與1066A恢復(fù)系經(jīng)多代回交后獲得的等基因系，其葉片表型正常，理論上具有與相同的遺傳背景。通過調(diào)查比較與的農(nóng)藝性狀，發(fā)現(xiàn)株高和葉寬顯著下降（分別下降15.08%和25.40%），而植株莖節(jié)數(shù)和葉長與沒有顯著差異。在產(chǎn)量性狀上，的穗長、主穗重、穗粒重、千粒重、結(jié)實(shí)率均顯著低于（表1），其中結(jié)實(shí)率下降幅度最大，達(dá)到38.34%，說明的育性受到較嚴(yán)重影響，產(chǎn)量下降主要原因是育性降低。

2.2 A36-S突變體的光合特性分析

為分析條紋葉表型對光合特性的影響，對拔節(jié)期與葉片葉綠素含量進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，與相比，的葉綠素a含量顯著下降（=0.031，下降8.99%），而葉綠素b含量極顯著下降（=7.170×10-4，下降52.33%）（圖2-A）。的葉綠素a/b值為1.357，而的葉綠素a/b值為2.591。上述結(jié)果表明，的葉綠素含量受到影響，尤其是葉綠素b受到影響更加嚴(yán)重，葉綠素a/b值升高。

A：抽穗期植株；B：抽穗期葉片；C：抽穗期葉片細(xì)節(jié)；D：成熟后穗部

對抽穗期與的光合參數(shù)進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)的凈光合速率相比顯著降低了29.09%（圖2-B）；雖然的氣孔導(dǎo)度平均值比有所下降（9.89%），胞間CO2濃度平均值有所上升（19.02%），但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上，與的這兩項(xiàng)指標(biāo)無顯著差異（圖2-C和圖2-D）；與的蒸騰速率沒有顯著差異（圖2-E）。這些結(jié)果說明葉片光合能力明顯降低。

表1 A36-S與A36-N的主要農(nóng)藝性狀對比

*表示在<0.05水平差異顯著；**表示在<0.01水平差異極顯著 *: significant difference at0.05 level; **: significant difference at0.01 level

圖2 A36-S與A36-N的葉綠素含量及光合參數(shù)

2.3 A36-S突變體的葉片解剖結(jié)構(gòu)分析

為了進(jìn)一步分析導(dǎo)致突變體葉片條紋表型的細(xì)胞學(xué)原因，對及具有正常葉片的谷子品種豫谷1號(hào)的苗期葉片進(jìn)行橫截半薄切片觀察。谷子屬于NADP-ME亞型C4植物，葉片具有典型的Kranz結(jié)構(gòu)，即維管束鞘細(xì)胞形態(tài)飽滿，內(nèi)含許多體積大且不含基粒的葉綠體（圖3-A，藍(lán)色箭頭指示豫谷1號(hào)維管束鞘細(xì)胞葉綠體），一層葉肉細(xì)胞整齊地圍繞維管束鞘細(xì)胞排列，內(nèi)含許多具豐富基粒的葉綠體（圖3-A，紅色箭頭指示豫谷1號(hào)葉肉細(xì)胞葉綠體）。相比而言，的葉片Kranz結(jié)構(gòu)變化并不明顯，但葉綠體的發(fā)育情況明顯異常。雖然部分細(xì)胞含有正常數(shù)量的葉綠體（圖3-B，紅色和藍(lán)色箭頭分別指示正常葉肉細(xì)胞及維管束鞘細(xì)胞葉綠體），然而也有許多維管束鞘細(xì)胞（圖3-B，藍(lán)色星號(hào)）及葉肉細(xì)胞（圖3-B，紅色星號(hào)）不含有葉綠體，這可能是葉片呈現(xiàn)白色條紋的主要原因。

對切片不同視野中所有葉肉細(xì)胞及維管束鞘細(xì)胞中葉綠體數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖4-A）。豫谷1號(hào)葉片細(xì)胞中葉綠體數(shù)量分布較離散，從1個(gè)到7個(gè)不等，葉綠體數(shù)中值為4個(gè)；相比而言，葉片細(xì)胞葉綠體數(shù)量從0個(gè)到8個(gè)不等，中值為2個(gè)，但數(shù)據(jù)在0 個(gè)處密集分布，說明部分細(xì)胞中葉綠體數(shù)量正常，但大量細(xì)胞中不含有葉綠體。通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明，細(xì)胞中葉綠體數(shù)量顯著低于豫谷1號(hào)（=4.98×10-17）。進(jìn)而，對豫谷1號(hào)和的葉綠體大小進(jìn)行了比較。由于維管束鞘細(xì)胞與葉肉細(xì)胞的葉綠體體積存在明顯差異，因此對這兩種類型細(xì)胞的葉綠體分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，的維管束鞘細(xì)胞葉綠體和葉肉細(xì)胞葉綠體面積均顯著小于豫谷1號(hào)（圖4-B）。上述結(jié)果說明在葉綠體形成及發(fā)育方面均受到抑制。

A：豫谷1號(hào)葉片橫截切片（標(biāo)尺50 μm）；B：A36-S葉片橫截切片（標(biāo)尺50 μm）；紅色箭頭指示正常葉肉細(xì)胞葉綠體；藍(lán)色箭頭指示正常維管束鞘細(xì)胞葉綠體；紅色星號(hào)指示不含葉綠體的葉肉細(xì)胞；藍(lán)色星號(hào)指示不含葉綠體的維管束鞘細(xì)胞

圖4 豫谷1號(hào)與A36-S葉綠體數(shù)量和面積的統(tǒng)計(jì)

2.4 A36-S突變體的葉綠體超微結(jié)構(gòu)分析

對及豫谷1號(hào)苗期葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，由于谷子葉片維管束鞘細(xì)胞與葉肉細(xì)胞的葉綠體存在結(jié)構(gòu)及功能差異，因此對二者分別進(jìn)行觀察分析（圖5）。豫谷1號(hào)的維管束鞘細(xì)胞葉綠體具有排列整齊的基質(zhì)片層，且包含許多淀粉顆粒（圖5-A）；葉肉細(xì)胞葉綠體則含有大量的基粒，淀粉粒含量也十分豐富（圖5-B）。的情況則較為復(fù)雜，不同細(xì)胞間葉綠體發(fā)育情況存在較大差異。根據(jù)細(xì)胞中葉綠體的發(fā)育情況將其分為3類：

Ⅰ類細(xì)胞：包含發(fā)育正常的葉綠體。的有些細(xì)胞中，葉綠體數(shù)量相對正常，葉綠體的超微結(jié)構(gòu)也與對照豫谷1號(hào)無明顯差異（圖5-C為維管束鞘細(xì)胞及內(nèi)部的葉綠體，圖5-D為葉肉細(xì)胞及內(nèi)部的葉綠體），推斷這些細(xì)胞位于條紋葉的綠色部分。

Ⅱ類細(xì)胞：葉綠體結(jié)構(gòu)基本完整，但基粒及片層結(jié)構(gòu)減少。表現(xiàn)為維管束鞘細(xì)胞葉綠體片層結(jié)構(gòu)排列松散（圖5-E），葉肉細(xì)胞葉綠體基粒數(shù)量及囊狀堆疊層數(shù)明顯減少（圖5-F），并且葉綠體中僅含有少量或不含有淀粉粒（圖5-E和圖5-F），說明光合作用積累的糖類減少，光合能力下降。

Ⅲ類細(xì)胞：不含葉綠體或含有嚴(yán)重異常的葉綠體。表現(xiàn)為有些細(xì)胞中完全沒有葉綠體形成，有些細(xì)胞雖含有葉綠體（圖5-G），但葉綠體不含有基質(zhì)片層及基粒結(jié)構(gòu)，僅含有一些泡狀結(jié)構(gòu)（圖5-H，白色箭頭指示泡狀結(jié)構(gòu)）。

綜上所述，盡管部分細(xì)胞中葉綠體結(jié)構(gòu)正常，A36-S的葉綠體形成及發(fā)育依然受到較嚴(yán)重影響。

2.5 A36-S突變基因的定位

為定位突變基因，以為母本構(gòu)建了F2代分離群體。選擇的雜交父本SSR41具有正常葉片表型，其株高、生育期等性狀與相近似，且育性良好。前期研究表明，SSR41與豫谷1號(hào)、遼谷1號(hào)、大青秸等谷子品種都具有較高的遺傳多態(tài)性，因此，長期以來被作為構(gòu)建作圖群體的主要親本材料，廣泛進(jìn)行雜交組合的組配，并成功定位了若干基因[25-27, 30]。選擇SSR41作為作圖群體父本。對F2代分離群體進(jìn)行遺傳統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，群體中正常后代455株，條紋葉后代130株，分離比例符合3﹕1（表2），說明的條紋葉性狀由隱性單基因控制。

A：豫谷1號(hào)維管束鞘細(xì)胞葉綠體；B：豫谷1號(hào)葉肉細(xì)胞葉綠體；C：A36-S的Ⅰ類維管束鞘細(xì)胞；D：A36-S的Ⅰ類葉肉細(xì)胞；E：A36-SⅡ類維管束鞘細(xì)胞葉綠體；F：A36-SⅡ類葉肉細(xì)胞葉綠體；G：A36-S的Ⅲ類細(xì)胞；H：A36-S Ⅲ類細(xì)胞中的葉綠體，白色箭頭指示泡狀結(jié)構(gòu)；SG：淀粉顆粒；SL：基質(zhì)片層；GR：基粒；CLP：葉綠體

采用集團(tuán)分離分析法（BSA法）進(jìn)行突變基因的初定位。選取F2分離群體中條紋葉單株20株，提取DNA構(gòu)建混池。在谷子基因組9條染色體上均勻選取與SSR41間多態(tài)性良好的SSR標(biāo)記60個(gè)，用于基因初定位。結(jié)果顯示，使用第4染色體標(biāo)記SiCAAS4019（9 999 146 bp）、SiCAAS4054（15 511 536 bp）、SiCAAS4033（23 843 301 bp）擴(kuò)增混池DNA得到條帶與母本帶型一致（圖6），說明突變基因與這幾個(gè)標(biāo)記緊密連鎖。

表2 A36-S與SSR41雜交F2代分離比統(tǒng)計(jì)

♀：A36-S突變體；♂：SSR41；F1：A36-S×SSR41；P：F2群體條紋葉單株混池DNA

利用上述3個(gè)標(biāo)記檢測40株F2條紋葉單株，發(fā)現(xiàn)所有單株均與母本帶型一致。因此，為確定定位區(qū)間邊界，在這三個(gè)標(biāo)記的上下游再次選取和開發(fā)了多個(gè)SRR及In-Del標(biāo)記，用來檢測上述40株F2條紋葉單株（表3），將突變基因定位于InDel 14與SiCAAS4034之間26.2 Mb區(qū)間內(nèi)。

為了進(jìn)一步定位突變基因，一方面擴(kuò)大群體，將F2條紋葉單株增加至881株，另一方面根據(jù)現(xiàn)有基因組In-Del數(shù)據(jù)信息，在定位區(qū)間內(nèi)開發(fā)In4-3、In4-17、In4-20、In4-21、In4-29、In4-32、In4-33共7對In-Del標(biāo)記（標(biāo)記物理位置及引物序列見表4）。對881個(gè)F2條紋葉單株進(jìn)行掃描，統(tǒng)計(jì)各標(biāo)記處雜合帶型的數(shù)量（表4）。將突變基因定位于In4-20（7 661 828 bp）與In4-32（27 896 330 bp）之間20.13 Mb區(qū)間內(nèi)。

3 討論

3.1 對A36-S葉綠素a/b值升高原因的分析

本研究中，與對照相比，的葉綠素含量顯著下降，且葉綠素b下降的幅度更大，葉綠素a/b值明顯升高。發(fā)現(xiàn)谷子的幾個(gè)葉色變異材料[24]、[27]、黃金苗[32]等也存在類似的情況。有報(bào)道指出葉綠素a/b值與總?cè)~綠素含量及光合速率呈負(fù)相關(guān)，即總?cè)~綠素含量越高，葉綠素b的占比越大，葉綠素a/b值越低，葉片光合速率越高[33]。這可能與葉綠素a和葉綠素b在光合作用原初反應(yīng)中的功能差異有關(guān)。葉綠素a與葉綠素b都負(fù)責(zé)吸收與傳遞光能，而少數(shù)激發(fā)態(tài)的葉綠素a還具有將光能轉(zhuǎn)化為電能及化學(xué)能的作用。因此，葉綠素b相對含量升高有利于在光照不足狀態(tài)下增加光能的吸收，葉綠素a相對含量升高有利于在強(qiáng)光狀態(tài)下提高光合速率[34]。由此推測，等葉色突變體中葉綠素a/b值的升高，可能是植物應(yīng)對葉片光合能力下降的一種適應(yīng)性機(jī)制。

表3 40株F2代條紋葉單株標(biāo)記檢測結(jié)果

S：母本帶型；H：雜合子帶型 S: The band of female parent; H: The band of heterozygous individual

加粗字體：突變基因定位區(qū)間 Bold fonts: The locating region of the mutant gene

另外，還有研究指出，由于分子結(jié)構(gòu)不同，葉綠素a與葉綠素b對于不同脅迫的敏感程度不同，例如葉綠素a對活性氧的增加更加敏感[35]，葉綠素b對于酸脅迫更加敏感[36]。中的基因突變有可能通過損害某一代謝通路對植株造成某種脅迫，使得葉綠素b的含量受到更嚴(yán)重的影響，這一推測還需要在完成基因克隆后進(jìn)一步證實(shí)。

3.2 A36-S突變基因可能參與調(diào)控葉綠體合成發(fā)育的上游途徑

谷子突變體葉片呈現(xiàn)不規(guī)則白色條紋（圖1-B和圖1-C）。對葉片解剖結(jié)構(gòu)及葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，葉綠體的大小和數(shù)量與豫谷1號(hào)相比均顯著下降（圖4），且部分葉綠體結(jié)構(gòu)異常，有些細(xì)胞中甚至不含有葉綠體（圖5），說明的某些細(xì)胞中，葉綠體在早期合成及發(fā)育時(shí)即受到抑制，這可能是葉片呈現(xiàn)白色條紋的原因。目前谷子報(bào)道的相似表型突變體有[25]、[26]，二者均表現(xiàn)為不規(guī)則白色條紋葉，并且葉片中同樣包含部分不含有葉綠體的葉肉細(xì)胞及維管束鞘細(xì)胞，葉綠體發(fā)育也受到了阻礙，二者的突變基因分別為核糖核苷酸還原酶大亞基編碼基因和脫氧胞苷脫氨酶基因[25-26]，但這兩個(gè)基因均不在本研究的初定位區(qū)間內(nèi)，可排除為或等位突變體的可能性。

水稻等其他禾本科植物中也報(bào)道了許多與表型類似的白條紋葉突變體，例如水稻[37]、[38]、[39]、[40]、[41]等，這些突變體均表現(xiàn)出葉片不規(guī)則白色條紋、葉綠體發(fā)育不良、部分細(xì)胞葉綠體缺失等表型，它們的突變基因分別參與葉綠體核糖體合成、葉綠體RNA剪切、核酸代謝等通路，通過控制葉綠體關(guān)鍵基因的合成、轉(zhuǎn)錄、翻譯上游途徑來調(diào)控葉綠體的合成及發(fā)育。結(jié)合谷子及的表型和突變基因功能，推測A36-S的突變基因也可能參與核酸代謝、葉綠體基因轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)控等葉綠體合成及發(fā)育的上游途徑。

另外，在葉片橫截切片及葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察中使用的對照品種豫谷1號(hào)與突變體之間存在一定的遺傳背景差異，有可能會(huì)影響葉綠體大小和數(shù)量。然而相比豫谷1號(hào)，表現(xiàn)出大量細(xì)胞葉綠體缺失，葉綠體結(jié)構(gòu)明顯異常，C4植物固有的葉片解剖結(jié)構(gòu)不完整等嚴(yán)重缺陷，遺傳背景的差異很難導(dǎo)致這樣的缺陷。因此，認(rèn)為在葉片解剖結(jié)構(gòu)及葉綠體發(fā)育上的異常的確是由基因突變導(dǎo)致的。在后續(xù)研究中，為使結(jié)果更加準(zhǔn)確嚴(yán)謹(jǐn)，將以近等基因系為對照，進(jìn)一步研究在葉片解剖結(jié)構(gòu)、葉綠體大小數(shù)量及結(jié)構(gòu)上的變化，以確認(rèn)突變基因功能。

3.3 A36-S突變基因的精細(xì)定位

本研究將突變基因定位在第4染色體20.13 Mb區(qū)間內(nèi)。沒能完成精細(xì)定位的主要原因是作圖群體中交換株過少，盡管群體數(shù)量已經(jīng)足夠多，但在定位區(qū)間內(nèi)染色體重組的頻率非常低。是一個(gè)來源于育種中間材料的自然突變體，推測在定位區(qū)間內(nèi)存在與作圖親本SSR41差別較大的復(fù)雜的染色體結(jié)構(gòu)差異，干擾這一段染色體與SSR41對應(yīng)染色體片段的正常配對，從而導(dǎo)致重組交換率偏低。而這種染色體結(jié)構(gòu)變異可能是由于自然突變導(dǎo)致的，也可能本來就存在與的野生型中。為解決這一問題，本研究計(jì)劃一方面使用與遺傳關(guān)系更近的材料重新構(gòu)建作圖群體，進(jìn)行基因定位，但這很有可能導(dǎo)致在定位區(qū)間內(nèi)找不到足夠的多態(tài)性標(biāo)記；另一方面對及其近等基因系進(jìn)行初定位區(qū)間的高通量測序，通過比對二者在區(qū)間內(nèi)的序列差異來尋找突變基因。

3.4 A36-S突變基因功能與C4光合途徑的關(guān)系

決定C4植物高效光合作用的關(guān)鍵之一在于其具有獨(dú)特的Kranz解剖結(jié)構(gòu)及CO2濃縮機(jī)制。目前已報(bào)道一些可能調(diào)控Kranz結(jié)構(gòu)及維管束鞘細(xì)胞葉綠體發(fā)育的蛋白，例如玉米GLK轉(zhuǎn)錄因子可誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生pro-Kranz結(jié)構(gòu)并促使維管束鞘細(xì)胞中葉綠體的發(fā)育[42]，SCR/SHR轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控維管束鞘細(xì)胞發(fā)育和葉脈排列模式[43]。通過葉片橫截切片觀察，發(fā)現(xiàn)的維管束鞘細(xì)胞與葉肉細(xì)胞中都發(fā)生了葉綠體的數(shù)量減少、面積下降以及結(jié)構(gòu)異常，說明突變基因?qū)θ~綠體的影響不存在細(xì)胞類型特異性。而的Kranz結(jié)構(gòu)不完整是由于維管束鞘細(xì)胞及葉肉細(xì)胞中葉綠體的喪失導(dǎo)致的，Kranz結(jié)構(gòu)的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞排列方式等沒有明顯異常。因此我們推測的突變基因可能并不直接參與C4解剖結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，而是通過控制葉綠體合成及發(fā)育間接參與其中。而在C4生化途徑上發(fā)生了哪些變化，C4通路上關(guān)鍵基因的表達(dá)是否受到影響尚未證實(shí)。谷子是C4模式植物，其葉綠體發(fā)育異常突變體對于C4光合途徑仍然具有較高的研究價(jià)值。下一步應(yīng)在初定位的基礎(chǔ)上進(jìn)行基因精細(xì)定位并克隆候選基因，進(jìn)一步研究基因生物功能，以及其與C4途徑的相互關(guān)系，對于加深人們對葉綠體合成發(fā)育調(diào)控機(jī)理以及C4光合作用的理解具有一定意義。

4 結(jié)論

與正常表型的等基因系相比，谷子條紋葉突變體在株高、葉寬、穗重、千粒重、結(jié)實(shí)率等農(nóng)藝性狀上顯著下降，葉片葉綠素含量及凈光合速率顯著降低。葉片細(xì)胞中葉綠體數(shù)量減少且體積變小，不同細(xì)胞間葉綠體發(fā)育狀況差異較大：部分細(xì)胞具有正常發(fā)育的葉綠體，部分細(xì)胞葉綠體基粒及片層結(jié)構(gòu)減少，有些細(xì)胞則葉綠體結(jié)構(gòu)嚴(yán)重異常甚至不含有葉綠體。的突變表型受隱性單基因控制，利用分子標(biāo)記將該基因定位于第4染色體7.66—27.90 Mb區(qū)間內(nèi)。

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Cytological Characters Analysis and Low-resolution Mapping of Stripe-Leaf Mutantin Foxtail Millet

ZHANG Shuo1,2ZHI Hui1, TANG ChanJuan1, LUO MingZhao1, TANG Sha1, JIA GuanQing1, JIA YanChao1, DIAO XianMin1

1Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100081;2Food Crop Research Institute, Hubei Academy of Agricultural Science, Wuhan 430064

【】Foxtail millet is a C4model plant, and its leaf color mutants are good materials for C4photosynthetic pathway research. Through the cytological characters analysis and gene initial mapping of the stripe-leaf mutantin foxtail millet, it laid the foundation for cloning the mutant gene, analyzing the chloroplast biogenesis and development, and further understanding the C4photosynthetic regulation mechanism in foxtail millet. 【】The stripe-leaf mutant of foxtail milletwas naturally mutated from intermediate material A36 created by breeding. Comparing the phenotypic characteristics ofand its isogenic line, which showed normal phenotypes, and investigating the agronomic traits, such as plant height, leaf width, leaf length, panicle weight, thousand-grain weight, and seed setting rate. To analyze the photosynthetic characters of, the chlorophyll content, net photosynthetic rate, intercellular CO2concentration, stomatal conductance, and transpiration rate ofandwere determined. By observing the leaf transverse section and ultrathin section ofand the control variety Yugu1, the leaf anatomical structure characters were analyzed, by counting the numbers and areas of the chloroplasts in mesophyll cells and bundle sheath cells respectively, the chloroplast biogenesis and development were assessed. An F2segregation population of×SSR41 were created, and genetic analysis was conducted by counting the number of normal phenotype single plant and stripe-leaf single plant in the population. The DNA mixed pools of normal single plants and stripe-leaf single plants of the F2segregation population were constructed separately, and the method of Bulked Segregation Analysis (BSA) was used to locate the mutant gene. By screening the stripe-leaf plants in the F2generation using SSR and In-Del markers, the mutant gene were furtherly located.【】The stripe-leaf mutant of foxtail milletshowed the phenotype of irregular white stripe-leaf in the whole growth period. Agronomic traits analysis showed that compared with its isogenic line,decreased significantly in plant height, leaf width, panicle weight, thousand-grain weight, and setting percentage. Photosynthetic index measurement showed that the chlorophyll contents ofwere also reduced significantly, especially the chlorophyll b content declined more severely, additionally, the net photosynthetic rate was also decreased significantly. Observation of the leaf anatomical structure showed that the chloroplasts number and area were significantly lower than that of the contrast Yugu1, while the changes in Kranz structure were not obvious. Furtherly, the ultrastructure of chloroplast was observed and showed that the chloroplast development situation in different cells was quite different. And the leaf cells ofcould be classified into three types: type Ⅰ cells had normal chloroplasts, type Ⅱ cells had chloroplasts with reduced grana and lamellar structures, while type Ⅲ cells had severely abnormal chloroplasts or even had no chloroplast. Genetic analysis suggested that the stripe-leaf trait ofwas controlled by a single recessive gene, and the mutant gene was located to the region from 7.66 Mb to 27.90 Mb of chromosome 4 by F2population. 【】Stripe-leaf mutant of foxtail milletrepresented decreased agronomic traits and photosynthetic capacity, and the number, size, and ultrastructure of leaf cell chloroplast were significantly abnormal. The stripe-leaf trait ofwas controlled by a single recessive gene, which was mapped to a region from 7.66 Mb to 27.90 Mb of chromosome 4.

(L.) P. Beauv.; stripe-leaf mutant; chloroplast; gene mapping

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.14.003

2020-12-11；

2021-02-01

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2019YFD1000704，2019YFD1000700）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程協(xié)同創(chuàng)新任務(wù)“作物高光效育種生物學(xué)基礎(chǔ)及核心材料創(chuàng)制”（CAAS-XTCX2016002）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-06-13.5-A4）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（特色農(nóng)作物優(yōu)異種質(zhì)資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)）、湖北省農(nóng)科院青年科學(xué)基金（2020NKYJJ02）

張碩，E-mail：zhangshuo0728@126.com。通信作者刁現(xiàn)民，E-mail：diaoxianmin@caas.cn

（責(zé)任編輯 李莉）