曾自珍 鐘倪俊 李曉燕 梁 齊 文桂卿 鐘蘭英 王利勝

1.廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院 廣東省清遠市人民醫(yī)院藥學部，廣東清遠 511518；2.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東廣州 511400

刺芫荽（Eryngium foetidum L.）別名刺芹、野芫荽、假芫荽，是傘形科刺芹屬多年生草本植物，廣泛分布于墨西哥、孟加拉、泰國、拉丁美洲、加勒比等國家和地區(qū)，被當?shù)厝俗鳛槭秤檬卟思坝糜谥委煾忻?、咳嗽、哮喘等疾病[1]。在中國主要分布于廣東、廣西、云南、海南等熱帶及亞熱帶地區(qū)[2-3]。經(jīng)現(xiàn)代藥理學證明，刺芫荽具有抗炎[4]、抗氧化[5]等生物活性，揮發(fā)油、多糖[6]及黃酮類化合物[7]、酚酸類化合物[8]是其主要的活性成分。

國內(nèi)最早對刺芫荽揮發(fā)油成分進行分析的是官智等[9]，認為壬醛與葵醛是主要成分；高燕等[10]在2013 年對云南刺芫荽揮發(fā)油再次進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2-十二碳烯醛（45.24%）、2，4，5-三甲基苯甲醛(6.15%)為主要成分，葵醛只占1.72%；翟銳銳等[11]對海南刺芫荽全草揮發(fā)油進行研究，其主要成分為十二烯醛（22.18% ）、2，4，5-三甲基苯甲醛（14.27%）和1，11-十二二烯（11.15%），葵醛相對含量只有0.36%。由此可見，不同產(chǎn)地的刺芫荽同一物質(zhì)的含量以及含有物質(zhì)的種類有所不同。因此，要充分利用刺芫荽的藥用價值，應要將產(chǎn)地因素考慮在內(nèi)。

固相微萃取（SPME）是Arther 和Pawliszyn[12]在1990 提出的一種新型樣品前處理技術(shù)，其是基于氣固吸附和液固吸附平衡的富集方法，活性固體表面能對分析物有一定吸附能力，從而達到分離富集的目的，具有操作簡便、耗費時間少、無須溶劑和效率高等優(yōu)點[13]，被廣泛用于藥品[14-15]、食品[16-17]和環(huán)境分析[18-19]等領(lǐng)域。

目前尚未見文獻有對廣東產(chǎn)地的刺芫荽進行揮發(fā)性成分分析，本研究采用頂空固相微萃取法聯(lián)合氣相色譜-質(zhì)譜對其揮發(fā)性成分進行分析，為其揮發(fā)性成分體內(nèi)外藥理活性研究和合理開發(fā)利用提供重要依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

儀器：安捷倫7890B-5977A 氣相色譜-質(zhì)譜（GCMS）聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；HP-5MS 色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）（美國安捷倫公司）；SPME-GC 萃取手柄（美國Supelco 公司）；SPME 專用磁力加熱攪拌器（美國Supelco 公司）；固相微萃取纖維頭聚二甲基硅氧烷PK3（PDMS，100 μm）、聚丙烯酸酯PK3（PA，85 μm）、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯PK3（PDMS/DVB，65 μm）（美國Supelco 公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱XHDHG-系列（上海宵漢實業(yè)發(fā)展有限公司）；四兩裝高速中藥粉碎機型號105（瑞安市永歷制藥機械有限公司）。

1.2 試藥

廣東刺芫荽藥材（采自廣東省清遠市地區(qū)）經(jīng)清遠市人民醫(yī)院藥學部鑒定為廣東刺芫荽。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品處理

將新鮮刺芫荽洗凈，置于60℃烘箱烘干，經(jīng)粉碎機粉碎后過4 號篩，備用。

2.2 氣相色譜條件

HP-5MS 色譜柱，柱流量1.0 mL/min；進樣口溫度250℃；程序升溫從80℃開始，以4℃/min 升至200℃，再以8℃/min 升至250℃，保持5 min；分流比20∶1。

2.3 質(zhì)譜條件

電離源為EI 離子源；電離電壓70 eV；離子源溫度230℃；掃描范圍10～500 aum；溶劑延遲3 min。

2.4 固相微萃取條件的優(yōu)化

2.4.1 萃取頭種類的選擇 在裝樣量0.5 g，溫度170℃，平衡時間10 min，萃取時間10 min，解吸附時間3 min 條件下，考察100 μm PDMS、85 μm PA、65 μm PDMS/DVB 3 種萃取頭的萃取能力，以出峰數(shù)目為指標進行篩選，結(jié)果分別為100 μm PDMS 出峰54 個，85 μm PA 47 個，65 μm PDMS/DVB 35 個。因此，選擇100 μm PDMS 作為進行下一步實驗的萃取頭。

2.4.2 平衡溫度的考察 選取80℃、120℃、150℃、170℃4 個溫度作考察。溫度的提高能增加揮發(fā)性成分的濃度，有利于萃取；另一方面，萃取是放熱反應，溫度過高會使已經(jīng)被吸附的物質(zhì)脫落。4 個溫度梯度的出峰數(shù)分別為31、42、48、54 個。170℃下測得揮發(fā)性成分數(shù)目較多，選取此溫度作為平衡溫度。

2.4.3 平衡時間的考察 考察平衡時間為10、20、30 min，其余條件按“2.2”“2.3”項下不變。10、20、30 min 出峰數(shù)分別為54、56、60 個。平衡30 min 后出峰數(shù)目最多，選擇30 min 為平衡時間。

2.4.4 萃取時間的考察 實驗選定10、20、30 min 萃取時間進行考察，以出峰數(shù)為指標。出峰分別為60、61、69 個。萃取30 min 出峰數(shù)有明顯的提高，所以選取30 min 為萃取時間。

2.5 固相微萃取

將稱量好的0.5 g 樣品裝入帶有聚四氟乙烯隔墊的頂空瓶，置于170℃磁力攪拌器平衡10 min。平衡完畢后將萃取頭插入頂空瓶中，推出萃取頭，萃取10 min。萃取結(jié)束后于250℃GC-MS 進樣口解吸附3 min。每次取樣前將萃取頭在250℃下老化10 min。

2.6 廣東芫荽揮發(fā)性成分分析

通過峰面積歸一化法計算廣東刺芫荽中各揮發(fā)性成分的相對峰面積，并使用NIST14.L 譜庫檢索鑒定各個化合物結(jié)構(gòu)與名稱。

2.7 廣東刺芫荽揮發(fā)性成分分析

綜合上述結(jié)果，廣東刺芫荽最佳分析條件為使用PDMS 萃取頭，裝樣量0.5 g，平衡溫度170℃，平衡時間30 min，萃取時間30 min。分析結(jié)果見圖1、表1，主要揮發(fā)性物質(zhì)見圖2。

圖1 廣東刺芫荽揮發(fā)性成分TIC 總離子流圖

圖2 廣東刺芫荽主要揮發(fā)性成分

表1 廣東刺芫荽揮發(fā)油化學成分分析結(jié)果

2.8 云南、海南刺芫荽揮發(fā)性成分分析及與廣東刺芫荽相同成分

使用“2.7”項下分析廣東刺芫荽固相微萃取條件，對云南、海南產(chǎn)地刺芫荽成分進行分析。結(jié)果見圖3～4，云南、海南二產(chǎn)地與廣東刺芫荽相同揮發(fā)性成分見表2。

圖3 云南刺芫荽揮發(fā)性成分TIC 總離子流圖

圖4 海南刺芫荽揮發(fā)性成分TIC 總離子流圖

3 討論

3.1 廣東刺芫荽主要成分

3.1.1 萃取溫度的選擇 在海南和云南刺芫荽中含量占比最高的是十二烯醛，分別為22.8%和45.24%，此類含量高的長鏈醛類在廣東刺芫荽中也含有，為十二醛，在本研究中占比8.41%，含量不及海南和云南刺芫荽中的高，經(jīng)分析原因可能為平衡溫度較高，一方面會造成已被吸附的小分子揮發(fā)性物質(zhì)會部分脫落，不利于小分子揮發(fā)性物質(zhì)的吸附；另一方面溫度的升高會使其他揮發(fā)性物質(zhì)的含量增加，十二醛的占比也有相應的減少。溫度在120℃和150℃以下，十二醛相對百分含量為26.8%和18.8%，皆為含量占比最高的物質(zhì)。綜合分析，廣東刺芫荽的主要揮發(fā)性物質(zhì)為1-2，6，6-三甲基-1，3-環(huán)己二烯基醇和十二醛。在80℃、120℃、150℃下，出峰數(shù)較少，雖然十二醛比例占比最高，但是檢測到的揮發(fā)性物質(zhì)種類比170℃下少，因此綜合考慮選擇170℃為平衡溫度。

3.1.2 廣東、海南、云南三地刺芫荽主要成分的比較 廣東刺芫荽揮發(fā)性成分最高為酚醇類（41%），其次為醛酮（24%）和烯烴（22%）；云南刺芫荽揮發(fā)油主要為醛酮類（58.05%）烯烴只占5%，海南刺芫荽揮發(fā)油成分主要為烷酸類（26%），其次為醛酮類（23%），烯烴占總揮發(fā)油成分13%。從表2 分析結(jié)果得知，云南刺芫荽與廣東刺芫荽相同的成分有15 種，而海南刺芫荽則有24 種，且從相對含量上看，海南產(chǎn)地刺芫荽與廣東刺芫荽更為接近。

表2 云南、海南與廣東刺芫荽共有揮發(fā)性成分對比結(jié)果（%）

3.1.3 廣東刺芫荽中主要成分的作用 十二醛呈無色至透明油狀液體，具有強烈脂肪香氣，類似松葉油和橙油的強烈香氣，是刺芫荽的香氣主要成分；據(jù)文獻報道，反式-2-十二烯醛是一種高效的神經(jīng)元電壓門控鉀離子通道激活劑，具有抗癲癇作用[20]；石竹烯屬于雙環(huán)倍半萜，具有抗炎、抗腫瘤、神經(jīng)保護、減輕腦缺血再灌注損傷的作用[21]；β-欖香烯是一種新型的抗癌藥，具有抗腫瘤、增強免疫[22-23]和抗粥樣動脈硬化[24]作用。

3.1.4 HS-SPME-GC-MS 聯(lián)用法與傳統(tǒng)提取方法比較水蒸氣蒸餾法提取時間長，加熱溫度高，可能會造成含量小的物質(zhì)損失[25]；與其他方法相比，SPME 法能測定更多的成分[26]。SPME 法是根據(jù)相似相溶原理，不同涂層的萃取頭對不同物質(zhì)的親和力不同，從而達到富集樣品揮發(fā)性成分的目的，具有樣品用量少、加熱溫度低、加熱時間短的特點[27]，能夠方便快捷、更全面反映揮發(fā)性物質(zhì)成分的優(yōu)點[28]。文獻[10-11]采用的水蒸氣蒸餾法和同時蒸餾萃取法，鑒定出刺芫荽的成分分別為38 和24 個，而本研究采用HS-SPME 法鑒定的刺芫荽揮發(fā)性成分有55 個，對揮發(fā)性成分的提取大有提高。本研究采用HS-SPME-GC-MS 法對廣東刺芫荽揮發(fā)性成分進行分析，并與不同產(chǎn)地的刺芫荽進行揮發(fā)性成分比較，發(fā)現(xiàn)可能的具有藥理作用的物質(zhì)，為廣東刺芫荽的揮發(fā)性成分的研究和開發(fā)利用提供重要的依據(jù)。