李媛媛 向天敏 陳思現(xiàn) 陳永鋒 周素麗 陸 偉 張楨珍 蔡永廣

1.廣東省農(nóng)墾中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科五區(qū)，廣東湛江 524002；2.上海鹍遠生物技術(shù)有限公司醫(yī)學科研部，上海 524002

肺癌是最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均 居全球惡性腫瘤首位，其中非小細胞肺癌（NSCLC）占肺癌的80%～85%，是最常見的肺癌類型[1]。鉑類為主的雙藥化療是治療NSCLC 的一線方案，雖可一定程度緩解病情、改善生活質(zhì)量、延長生存期，但細胞毒性和化療不良反應影響患者的治療依從性。近年來，隨著分子譜分析、靶向治療藥物和精準醫(yī)療的發(fā)展，NSCLC 的靶向治療引起臨床廣泛關(guān)注[2]。目前EGFR體細胞突變和ALK、ROS1 和RET 重排已被證實為NSCLC 治療的重要靶點[3-7]。臨床研究顯示，應用表皮生長因子受體絡氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）治療NSCLC 具有良好的有效性和安全性[8]。KRAS 基因是NSCLC 常見的突變癌基因，是NSCLC 治療的重要靶點[9]。研究顯示不同的KRAS 突變可能導致NSCLC中不同的信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)及不同的致癌和藥物敏感性，KRAS 狀態(tài)可作為預測化療效果的生物標志物[9]。KRAS 是EGFR 信號通路的下游結(jié)點，KRAS 發(fā)生持續(xù)活化突變，可能影響患者對EGFR-TKIs 的治療效果[10]。因此NSCLC 患者化療或EGFR 靶向治療前檢測KRAS 基因的突變狀態(tài)對指導腫瘤患者個體化用藥具有重要臨床意義。本研究對單中心NSCLC 患者KRAS 基因突變進行檢測，并分析KRAS 突變與患者臨床特征的相關(guān)性，旨在為進一步研究非小細胞肺癌個體化治療提供數(shù)據(jù)參考。

1.資料與方法

1.1 一般資料

收集2016 年12 月—2020 年10 月廣東農(nóng)墾中心醫(yī)院保存的NSCLC 患者的組織標本103 例，血液標本107 例。其中肺腺癌185 例，其他NSCLC 25 例（包括鱗癌21 例、腺鱗癌3 例和大細胞癌1 例）；男104 例，女106 例；吸煙者68 例，不吸煙者106 例，其他36 例未知；青年（＜40 歲）4 例，中老年（≥40 歲）206 例。本研究獲得了患者的知情同意書，并經(jīng)廣東農(nóng)墾中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查批準。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 腫瘤組織用10%中性緩沖福爾馬林固定過夜，常規(guī)石蠟包埋，由病理學家進行病理診斷和腫瘤純度檢測，腫瘤組織大于10%的樣本用于DNA提取。采集外周血10 mL 于Streck 管內(nèi)，1600 g 離心10 min，取上清血漿樣本于2 mL EP 管，再16 000 g離心10 min，抽取上清于2 mL EP 管保存于-80℃用于后續(xù)分析。

1.2.2 DNA 提取組織樣本DNA 采用QIAamp FFPE組織DNA 提取試劑盒（德國凱杰公司，貨號：56404）分離純化；血漿游離DNA 采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit 試劑盒分離純化（德國凱杰公司，貨號：55114）。所有步驟均嚴格按照說明書進行。使用1%的凝膠電泳檢測樣本目的條帶是否有雜帶或降解，以測定樣本核酸的完整性；使用Qubit 3.0 進行濃度的精確定量，以備后續(xù)文庫構(gòu)建所用。

1.2.3 高通量測序和數(shù)據(jù)分析 使用OncoAim?肺癌靶向基因檢測試劑盒（上海鹍遠生物技術(shù)有限公司，貨號：A01D-1）構(gòu)建高通量測序文庫，對肺癌相關(guān)的12 個基因的基因突變、重排、拷貝數(shù)的變異情況進行檢測。采用NextSeq 500 測序儀（美國Illumina 公司）進行PE150 測序。使用序列比對軟件BWA 將原始數(shù)據(jù)比對到人類參考基因組（hg19），使用軟件GATK 3.2、MuTect 和VarScan 進行本地序列比對優(yōu)化、變異識別和注釋，結(jié)合人工校對，判斷KRAS 基因突變情況。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用R 軟件4.0.1 版本對突變結(jié)果進行統(tǒng)計分析，計數(shù)數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗或Fisher’s 精確檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 KRAS 突變位點分析

210 例NSCLC 患者中，KRAS 突變29 例（13.8%），其中密碼子G12X 占58.6%（17/29），密碼子G13X 占10.3%（3/29），密碼子Q61X 占27.6%（8/29）。除了G12C 外（31.0%，9/29），Q61L 突變檢出率在本研究對象中相對較高（24.1%，7/29），其中1 例患者同時檢測到Q61L 和K117N 雙突變。見圖1。

圖1 29 例KRAS 突變的非小細胞肺癌患者各種密碼子突變頻率分布

2.2 KRAS Q61L 突變頻率與文獻報道數(shù)據(jù)比較

與歐美人群、東亞人群的數(shù)據(jù)比較，本研究Q61L的突變檢出率顯著高于文獻報道數(shù)據(jù)，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 本組研究與文獻報道的NSCLC 患者Q61L 突變的比較（例）

2.3 NSCLC 患者中KRAS 基因突變與臨床特征的關(guān)系

KRAS 突變與性別相關(guān)，男性患者突變率高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），而與年齡、是否吸煙、組織學類型以及樣本類型無關(guān)（P ＞0.05），見表2。吸煙患者密碼子G12/13 堿基的突變高于不吸煙患者，差異有統(tǒng)計學意義（P <0.05）；吸煙患者密碼子Q61L堿基突變與非吸煙患者比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），見表3。

表2 NSCLC 患者臨床病理特征與KRAS 基因突變情況[例（%）]

表3 NSCLC 患者吸煙、非吸煙與KRAS 基因各密碼子突變的關(guān)系[例（%）]

2.4 KRAS 基因突變在組織樣本與血漿樣本中的比較分析

在103 例組織樣本中檢測到KRAS 突變13 例，突變率為12.6%（13/103）；在107 例血液樣本中檢測到KRAS 突變16 例，突變率為15.0%（16/107）。見表2。組織樣本、血漿樣本中，男性KRAS 突變率均明顯高于女性（P <0.05）；然而，在組織樣本和血漿樣本中，KRAS 基因突變均與吸煙史無關(guān)（P ＞0.05）。見表4。

表4 不同樣本類型KRAS 突變與臨床病理特征的關(guān)系（例）

3 討論

KRAS 基因是RAS 家族中的原癌基因，也是EGFR 信號轉(zhuǎn)導通路中關(guān)鍵的下游信號分子。研究顯示，KRAS 是大多數(shù)癌癥中最常見的突變基因之一，約90%胰腺癌和50%的結(jié)腸癌患者存在KRAS 突變。歐美國家NSCLC 患者人群中KRAS 基因突變頻率較高，在腺癌患者中甚至達到了30%～50%，但東亞NSCLC 患者KRAS 突病率約為10%[12,14]。本研究單中心人群的NSCLC 患者KRAS 基因突變率，與文獻報道的東亞人群基本一致。提示單中心人群KRAS 突變數(shù)據(jù)符合整個東亞人群的KRAS 突變分布規(guī)律，不存在地域特異性。也進一步證實了亞洲地區(qū)NSCLS 患者的KRAS 突變率低于歐美的NSCLC 人群[12,14]。

在NSCLC 中，KRAS 突變主要發(fā)生在第12、13 和61 密碼子，其中以密碼子G12X 突變最為常見[15]，本研究結(jié)果與此結(jié)論相符。本研究檢測到了顯著高于既往文獻報道[11-13]的KRAS Q61L 突變，這可能與地域差異有關(guān)。湛江市位于中國大陸最南端、廣東省最南部，常年日照時間比較長。有文獻報道，紫外線輻射靶向嘧啶二聚體，導致高度偏倚產(chǎn)生RAS Q61 突變[16]。文獻報道顯示，紫外線輻射相關(guān)的皮膚黑色素瘤患者中，NRAS 基因突變患者中密碼子Q61X 檢出率接近90%[17]。因此，日照充足的南方地區(qū)的確可能比北部區(qū)域產(chǎn)生更多的Q61 相關(guān)突變，但目前僅有一個研究中心的數(shù)據(jù)支持這一假說。今后尚需進一步開展更多中心的相關(guān)研究以驗證該結(jié)論。

本研究認為男性NSCLC 患者KRAS 基因突變率高于女性患者，這與有關(guān)文獻結(jié)論一致[18]。吸煙可引起KRAS 突變積累[18-20]，而女性吸煙比例普遍較低，本研究的女性患者吸煙比例不足10%，這可能是導致男性與女性間KRAS 基因突變檢出率存在明顯差異的原因，但性別差異的具體機制尚待進一步研究。本研究的單中心數(shù)據(jù)顯示KRAS 基因與患者是否吸煙無關(guān)，這與許多文獻報道吸煙與KRAS 基因突變密切相關(guān)不一致[18-19]，可能是因為其他研究中G12/13 位為最主要的突變位點，而本中心存在較多的Q61L 突變導致的。進一步分析吸煙與具體突變位點的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)的吸煙與KRAS 基因G12/13 密碼子突變有關(guān)，與Q61L 突變無關(guān)。這與已有研究結(jié)論一致，即在KRAS突變的肺癌患者中，第12、13 密碼子最常見，其中顛換突變（G＞T 或G＞C）在曾經(jīng)吸煙和正在吸煙的患者中非常普遍[20]。

腫瘤組織仍是用于檢測基因突變的最佳樣本，但是對于晚期無法進行手術(shù)、組織DNA 不足以及經(jīng)治療后復發(fā)的患者獲取活檢組織比較困難，就可能導致患者錯過最佳的分子靶向治療期。研究顯示，近年來研究發(fā)現(xiàn)外周血液中存在著腫瘤細胞凋亡壞死釋放出的游離DNA（ctDNA），可反映腫瘤細胞的基因狀態(tài)，是特征性的腫瘤標志物[21-22]。研究報道血漿與組織基因突變總一致率80%以上[23-24]。由于ctDNA 在血漿中含量低、易降解[25-26]，選擇一種高靈敏度的檢測方法對于檢測結(jié)果的準確性起到了關(guān)鍵作用。本研究中基于高通量測序的方法檢測出血漿與組織樣本中KRAS陽性檢出率沒有顯著性差異，將兩組樣本中KRAS 突變與臨床病理特征進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，統(tǒng)計學結(jié)果跟兩組樣本合并分析得出的結(jié)果一致，KRAS 基因突變與性別相關(guān)，而跟吸煙史無關(guān)。本研究結(jié)果提示了血漿樣本基因檢測分析可以反映本研究人群KRAS基因整體突變情況。

綜上所述，本研究中單中心NSCLC 患者KRAS的整體突變率與東亞人群數(shù)據(jù)一致，而突變位點分布與既往報道存在差異；KRAS 基因密碼子Q61L 突變相對較高，可能是該中心NSCLC 患者的一個重要的驅(qū)動突變；Q61L 突變與吸煙無關(guān)，導致了該中心KRAS總突變與患者是否吸煙無關(guān)。液體活檢可作為一種有效的方法用于臨床分子檢測，為不便采集組織樣本的腫瘤患者提供支持。