王 選 董世雷 張亞培 范芳華 朱 杰

浙江醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，浙江杭州 310013

新德里金屬β 內(nèi)酰胺酶（New Delhi metallo-βlactamase，NDM）是2008 年首次發(fā)現(xiàn)的一種新型碳青霉烯酶[1]。隨后其便以驚人的速度在世界范圍內(nèi)播散流行。目前認(rèn)為南亞、歐洲以及中東為NDM 最為流行的地區(qū)[2]。2011 年浙江省發(fā)現(xiàn)首例產(chǎn)NDM-1 鮑曼不動(dòng)桿菌患者[3]，隨后NDM 便在細(xì)菌中蔓延開(kāi)來(lái)[4-8]。NDM 國(guó)內(nèi)雖多有研究，但菌株大多呈分散分布[9]。關(guān)于blaNDM-1基因分子水平研究，目前國(guó)內(nèi)還比較欠缺。本研究擬通過(guò)對(duì)2015 年1 月—6 月分離的29 株產(chǎn)NDM-1 腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行同源性分析，了解其在該地區(qū)的流行情況；通過(guò)周圍序列分析，闡明該基因所處的周圍環(huán)境。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

29 株產(chǎn)NDM-1 腸桿菌科細(xì)菌分離自浙江醫(yī)院碳青霉烯類抗生素耐藥菌株，包括9 株陰溝腸桿菌（Eo），6 株產(chǎn)氣腸桿菌（EA），4 株大腸埃希菌（EC），4 株弗勞地枸櫞酸桿菌（FC），2 株肺炎克雷伯菌（KP），2 株產(chǎn)酸克雷伯菌（KO）和2 株摩根摩根菌（MM）。本研究經(jīng)浙江醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器

Vitek2 compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和藥敏系統(tǒng)（法國(guó)梅里埃公司，型號(hào)：VITEK?2 COMPACT 30）；VITEK MS 質(zhì)譜儀（法國(guó)梅里埃公司，型號(hào)：VITEK?MS）；哥倫比亞血瓊脂平板（鄭州貝瑞特生物制品有限公司，批號(hào)：0052020）；Taq 酶及PCR 相關(guān)試劑（日本Takara 公司，批號(hào)：R007WZ）；質(zhì)粒抽提試劑盒（美國(guó)Axygen 公司，批號(hào)：12318KA1）；PCR 儀器及紫外成像系統(tǒng)（德國(guó)Biometra 公司，型號(hào)：Bio-1000F）；脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀及成像系統(tǒng)及相關(guān)試劑（德國(guó)Biometra 公司，型號(hào)：Biometra-Rotaphor?6.0）。

1.3 菌株鑒定及耐藥檢測(cè)

Vitek2 compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和藥敏系統(tǒng)進(jìn)行菌株鑒定和藥敏試驗(yàn)，VITEK MS 質(zhì)譜儀對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。

1.4 特異性PCR 擴(kuò)增和測(cè)序

質(zhì)粒提取試劑盒提取菌株DNA 為模板，分別擴(kuò)增碳青霉烯酶耐藥基因和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）耐藥基因，引物參照文獻(xiàn)[10-11]。陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序分析，確定耐藥基因類型。

1.5 脈沖場(chǎng)凝膠電泳

采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)對(duì)攜帶blaNDM-1基因腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行同源性分析。具體操作流程和判定標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[12]。

1.6 多位點(diǎn)序列分型

對(duì)EC、KP 和Eo 進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型。管家基因引物序列及擴(kuò)增條件參見(jiàn)參考文獻(xiàn)[13-15]。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，以確定該菌株的多位點(diǎn)序列分型（MLST）型別。

1.7 接合試驗(yàn)

受體菌為利福平耐藥大腸埃希菌EC600，供體菌為攜帶blaNDM-1菌株。接合子用VITEK MS 進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，PCR 擴(kuò)增接合子blaNDM-1確認(rèn)。

1.8 以PCR 為基礎(chǔ)的質(zhì)粒復(fù)制子分型（PBRT）

方法為以接合子DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增特異性引物來(lái)確定質(zhì)粒型別。擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制子分型。

1.9 目的基因周圍序列分析

提取接合子質(zhì)粒DNA，根據(jù)國(guó)內(nèi)攜帶blaNDM-1質(zhì)粒pNDM-HN380 的全質(zhì)粒測(cè)序序列（GenBank，JX10476 0.1），設(shè)計(jì)引物PCR 擴(kuò)增接合子該基因周圍序列（8828 bp）。PCR 陽(yáng)性結(jié)果測(cè)序，測(cè)序所得DNA 序列進(jìn)行拼接，繪制開(kāi)放閱讀框架示意圖。

2 結(jié)果

2.1 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

29 株攜帶blaNDM-1基因菌株中，86.9%（26/29）合并ESBLs 或其他碳青霉烯酶耐藥基因。其中，3 株EA，2 株FC，1 株Eo 和1 株KP 同時(shí)含有blaNDM-1和blaKPC-2基因；1 株Eo 同時(shí)攜帶blaNDM-1和blaIMP-4基因；1 株KP 同時(shí)攜帶blaNDM-1和blaVIM-1基因。耐藥基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）和MLST 分析結(jié)果

PFGE 分析發(fā)現(xiàn)，6 株EA，5 株Eo，2 株EC 及2 株KO 分別具有同源性，見(jiàn)圖1。MLST 發(fā)現(xiàn)3 株大腸埃希菌為ST167，5 株陰溝腸桿菌為ST114，見(jiàn)表1。

圖1 菌株P(guān)FGE 示意圖

2.3 接合實(shí)驗(yàn)與PBRT 質(zhì)粒分型結(jié)果

27 株菌株接合成功，見(jiàn)表1。接合子進(jìn)行PBRT 質(zhì)粒分型發(fā)現(xiàn)，其中16 株為IncX3 型質(zhì)粒，7 株為無(wú)法區(qū)分的型別，2 株為IncN 型質(zhì)粒，2 株為IncF 型質(zhì)粒。

表1 29 株產(chǎn)NDM-1 腸桿菌科細(xì)菌及其結(jié)合子菌株信息表

2.4 基因周圍環(huán)境分析

基因周圍環(huán)境分析見(jiàn)圖2。其中菌株KO-03、FC-05、EC-06 和Eo-09 的開(kāi)放閱讀框架同已公開(kāi)序列的KP 質(zhì)粒pNDM-HN380（GenBank 登錄號(hào)JX104760.1）完全一致，基因片段blaNDM-1-bleMBL-trpF 存在于所有已測(cè)序成功的16 株菌株中。

圖2 blaNDM-1 基因及其周圍環(huán)境的開(kāi)放閱讀框架示意圖

3 討論

兩種碳青霉烯酶存在于同一菌株中，在國(guó)內(nèi)外極少出現(xiàn)[16-17]。本研究結(jié)果顯示，9 株菌株攜帶兩種碳青霉烯酶。多種耐藥基因的合并存在，給產(chǎn)NDM-1 菌株的治療帶來(lái)更大挑戰(zhàn)。在國(guó)內(nèi)，極少出現(xiàn)同一克隆株的傳播流行現(xiàn)象[18-19]。本研究通過(guò)PFGE 分析發(fā)現(xiàn)部分菌株具有同源性，提示需加強(qiáng)院內(nèi)感控，關(guān)注多重耐藥菌的傳播流行現(xiàn)象。質(zhì)粒是介導(dǎo)blaNDM-1基因傳播轉(zhuǎn)移的主要載體。目前世界上可以攜帶該基因的質(zhì)粒有IncX3、A/C、L/M、FI/FII、I1 等型別[20-21]。其中，IncX3 型質(zhì)粒認(rèn)為是國(guó)內(nèi)介導(dǎo)該基因傳播轉(zhuǎn)移的主要載體[22-23]。本研究對(duì)接合子進(jìn)行PBRT 質(zhì)粒分型發(fā)現(xiàn)，59.3%（16/27）的質(zhì)粒為IncX3 型別，提示IncX3 型質(zhì)粒同樣是介導(dǎo)本地區(qū)blaNDM-1基因轉(zhuǎn)移的主要質(zhì)粒。

本研究對(duì)所獲菌株blaNDM-1基因周圍序列進(jìn)行測(cè)序拼接發(fā)現(xiàn)，測(cè)序成功菌株中均存在基因片段blaNDM-1-bleMBL-trpF，這與國(guó)內(nèi)報(bào)道一致[24-25]。本研究所有該基因上游均存在至少一個(gè)插入序列ISAba125。提示與ISAba125 相關(guān)的初始動(dòng)員機(jī)制可能是blaNDM-1-bleMBL- trpF 基因獲得的原因。但是，trpF 下游區(qū)域基因序列

是多樣的，這提示浙江省blaNDM-1基因的獲得可能有多種來(lái)源。

綜上所述，本研究從菌株、質(zhì)粒以及基因3 個(gè)水平對(duì)NDM-1 的傳播方式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，多種傳播轉(zhuǎn)移方式的共同作用加速了該酶在腸桿菌科細(xì)菌中的流行。因此，院內(nèi)感染控制科迫切需要監(jiān)測(cè)腸桿菌科細(xì)菌中的碳青霉烯酶，特別是NDM-1，以控制和預(yù)防這類細(xì)菌的傳播流行。