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        西瓦克顆粒指紋圖譜及抗氧化活性研究

        2021-07-29 05:50:48馬慶苓希爾艾力吐?tīng)栠d信學(xué)雷阿吉艾克拜爾艾薩

        陳 麗 劉 柳 馬慶苓 希爾艾力·吐?tīng)栠d 吳 濤 信學(xué)雷 阿吉艾克拜爾·艾薩

        1.中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆烏魯木齊 830011;2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)研究生院,北京 100049;3.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所維吾爾醫(yī)方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆烏魯木齊 830049

        西瓦克方劑由一枝蒿、茵陳、毛菊苣、玫瑰花、大黃和甘草六味藥材組成,傳統(tǒng)采取全方水提制成口服制劑,在新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院主要用于治療肝損傷,具有顯著的保肝護(hù)肝功效,但其質(zhì)控方面尚未完善。中藥指紋圖譜能夠全面反映復(fù)方所含的復(fù)雜化學(xué)成分,且已在中藥質(zhì)量控制研究中得到了廣泛的應(yīng)用,是評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量非常重要的手段之一[1-9]。本課題組前期已對(duì)西瓦克顆粒物質(zhì)作用基礎(chǔ)及小鼠肝損傷保肝作用進(jìn)行了初步的研究[10],本實(shí)驗(yàn)建立了西瓦克顆粒指紋圖譜及含量測(cè)定方法[11-21],并測(cè)定了10 批西瓦克顆粒中5 個(gè)成分的含量。同時(shí)采用薄層色譜-生物自顯影的方法對(duì)西瓦克顆粒體外抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

        1 材料

        1.1 儀器

        Agilent 高效液相色譜儀(美國(guó));Sartorius BT 25S型十萬(wàn)分之一電子天平(賽多利斯);SK7210LHC 型超聲清洗儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司);高效薄層色譜儀(HPLC,瑞士CAMAG);薄層色譜掃描儀(瑞士CAMAG,型號(hào):TLC Scanner3 System)。

        1.2 藥品與試劑

        10 批次西瓦克顆粒(自制),批號(hào)分別為S1:20161206,S2:20161208,S3:20170105,S4:20161213,S5:20170109,S6:20161216,S7:20161219,S8:20161220,S9:20161222,S10:20170112。一枝蒿酮酸(中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所提供,批號(hào):GSB11-2530-2016);沒(méi)食子酸(批號(hào):110831-201604)、3,5-O-二咖啡??鼘幩幔ㄅ?hào):111782-201706)、4,5-O-二咖啡??鼘幩幔ㄅ?hào):111894-201602)、異槲皮苷(批號(hào):111809-201403)對(duì)照品均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

        1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)(德國(guó)慕尼黑),2,2’-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)(Sigma),甲醇、乙腈均為色譜純,重蒸水(自制)。高效薄層色譜正相硅膠玻璃板GF254(20 cm×10 cm,Merck,Darmstadt,德國(guó))。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件

        InertSustain C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為乙腈(A)-0.2%磷酸(B),梯度洗脫0~10 min,4%~7%A;10~30 min,7%~8%A;30~35 min,8%~10%A;35~65 min,10%~13%A;65~80 min,13%~16%A;80~100 min,16%~28%A。檢測(cè)波長(zhǎng):0~<39 min:320 nm,39~<63 min:300 nm,63~<67 min:360 nm,67.0~<70.5 min:350 nm,70.5~<73.5 min:245 nm,73.5~<100.0 min:260 nm,流速1.0 mL/min;柱溫30℃,進(jìn)樣量10 μL,理論塔板數(shù)按各色譜峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

        2.2 對(duì)照品溶液制備

        分別精密稱取5 個(gè)特征化合物對(duì)照品適量,置棕色量瓶中,加50%甲醇溶液分別制成每1 mL 含沒(méi)食子酸86.10 μg、3,5-O-二咖啡??鼘幩?.25 μg、異槲皮苷20.21 μg、4,5-O-二咖啡??鼘幩?2.08 μg、一枝蒿酮酸25.67 μg 的混合對(duì)照品溶液。

        2.3 供試品溶液制備

        取西瓦克顆粒約1.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇25 mL,稱定重量,超聲處理30 min,取出,冷卻至室溫,再稱定重量,用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足減少的重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

        2.4 西瓦克顆粒指紋圖譜的建立

        將10 批西瓦克顆粒HPLC 圖譜導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A 版)”進(jìn)行分析,以S1 為參照?qǐng)D譜,時(shí)間窗為0.1 min,采用多點(diǎn)校正后,自動(dòng)進(jìn)行色譜峰匹配,以中位數(shù)法生成指紋圖譜(圖1)。經(jīng)處理后共標(biāo)定36 個(gè)共有峰,通過(guò)與對(duì)照品的比較對(duì)照,指認(rèn)了其中5 個(gè)特征峰,分別是沒(méi)食子酸、3,5-O-二咖啡??鼘幩?、異槲皮苷、4,5-O-二咖啡??鼘幩帷⒁恢锿幔▓D2)。結(jié)果表明,10 批西瓦克顆粒色譜圖相似度均≥0.811(表1)。表明制備工藝穩(wěn)定,方法準(zhǔn)確可靠。

        表1 10 批西瓦克顆粒相似度

        圖1 10 批西瓦克顆粒指紋圖譜

        圖2 混合對(duì)照品與西瓦克顆粒高效液相色譜分析圖

        2.5 方法學(xué)考察

        2.5.1 線性范圍考察 精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2.0、4.0、8.0、10.0、12.0、16.0、20.0 μL,按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,以沒(méi)食子酸、3,5-O-二咖啡??鼘幩?、異槲皮苷、4,5-O-二咖啡??鼘幩?、一枝蒿酮酸的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,各成分回歸方程見(jiàn)表2。

        表2 西瓦克顆粒中5 種化合物回歸方程與線性范圍

        2.5.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取適量濃度的對(duì)照品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣6 次,測(cè)得沒(méi)食子酸、3,5-O-二咖啡??鼘幩帷愰纹ぼ?、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸、一枝蒿酮酸的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)分別為0.85%、0.59%、2.09%、1.39%、0.47%,均<3%,表明儀器精密度良好。

        2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品(S4,批號(hào):20161213),按“2.3”項(xiàng)下方法,制備供試品溶液。于制備后0、2、4、6、8、10、12 h 分別進(jìn)樣,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,測(cè)得沒(méi)食子酸、3,5-O-二咖啡??鼘幩帷愰纹ぼ?、4,5-O-二咖啡??鼘幩?、一枝蒿酮酸峰面積的RSD分別為0.52%、0.76%、2.02%、2.20%、0.43%,均<3%,表明供試品溶液放置12 h 穩(wěn)定。

        2.5.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品(S4,批號(hào)為20161213),按“2.3”項(xiàng)下的方法,制備6 份供試品溶液,按2.1 項(xiàng)下測(cè)定,測(cè)得沒(méi)食子酸、3,5-O-二咖啡??鼘幩帷愰纹ぼ?、4,5-O-二咖啡??鼘幩?、一枝蒿酮酸峰含量的RSD 分別為1.24%、2.43%、2.07%、2.42%、2.18%,均<3%,表明該方法重復(fù)性良好。

        2.5.5 加樣回收率 取已知含量的供試品0.350 g(其中沒(méi)食子酸、3,5-O-二咖啡??鼘幩?、異槲皮苷、4,5-O-二咖啡??鼘幩帷⒁恢锿岬暮糠謩e為1.59、0.21、0.28、0.20、0.43 mg/g),精密稱定,共9 份于10 mL容量瓶中,按照供試品中5 個(gè)化合物的含量與各自對(duì)照品溶液1∶1 的量分別加入混合對(duì)照品,加入50%甲醇適量,超聲處理(250 W,頻率40 kHz)30 min,取出,放冷,定容至刻度,按上述方法測(cè)定5 個(gè)化合物的加樣回收率。見(jiàn)表3~7。

        表3 沒(méi)食子酸回收率

        表4 3,5-O-二咖啡??鼘幩峄厥章?/p>

        表5 異槲皮苷回收率

        表6 4,5-O-二咖啡??鼘幩峄厥章?/p>

        表7 一枝蒿酮酸回收率

        2.6 10 批西瓦克顆粒5 個(gè)特征成分的含量測(cè)定

        取10 批西瓦克顆粒,照“2.3”項(xiàng)下方法,依法制備,按上述擬定的含測(cè)方法測(cè)定5 個(gè)化合物含量,平行操作2 次,取平均值,結(jié)果見(jiàn)表8。

        表8 10 批西瓦克顆粒中5 個(gè)特征化合物的含量(mg/g)

        2.7 薄層色譜指紋圖譜

        分別取10 批西瓦克顆粒1.5 g,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。取秦皮乙素,同法制成每1 mL 含0.2 mg 的對(duì)照品溶液。以乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水(12∶1∶1∶1)為展開(kāi)劑,展開(kāi)后置紫外燈下檢視。通過(guò)對(duì)薄層板斑點(diǎn)位置、顏色的比對(duì),表明供試品質(zhì)量均一、穩(wěn)定,由此建立了供試品薄層色譜指紋圖譜的方法。見(jiàn)圖3(封三)。

        圖3 西瓦克顆粒和秦皮乙素薄層色譜圖

        2.8 薄層生物自顯影法檢測(cè)西瓦克顆粒體外抗氧化活性

        薄層生物自顯影法可以準(zhǔn)確、快速、直觀地判斷中藥復(fù)方制劑清除自由基的能力[22-24]。當(dāng)ABTS 和DPPH 與抗氧化活性成分結(jié)合后,會(huì)形成白色和黃色斑點(diǎn)[25-26]。供試品與自由基反應(yīng)后,色譜條帶多數(shù)部位分別呈現(xiàn)出白色和亮黃色,說(shuō)明西瓦克顆粒含有具備清除自由基的成分,具備一定抗氧化活性。見(jiàn)圖4(封三)。

        圖4 西瓦克顆粒和秦皮乙素薄層色譜圖

        3 討論

        本實(shí)驗(yàn)采用50%甲醇制備供試品溶液,以0.2%磷酸:乙腈系統(tǒng)為流動(dòng)相,并根據(jù)HPLC 色譜圖中不同類型化合物的保留時(shí)間及吸收波長(zhǎng)的特點(diǎn),采用分時(shí)段波長(zhǎng)檢測(cè),同時(shí)測(cè)定黃酮、多酚和倍半萜等不同類型的化合物。

        由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,10 批西瓦克顆粒指紋圖譜相似度均≥0.811,提示西瓦克顆粒制備工藝穩(wěn)定性、重現(xiàn)性良好,可批量生產(chǎn)。通過(guò)與對(duì)照品比對(duì),指認(rèn)了5 個(gè)特征化合物,分別為沒(méi)食子酸、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、異槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸、一枝蒿酮酸。并能在同一色譜條件下,同時(shí)測(cè)定10 批西瓦克顆粒中5 個(gè)特征化合物的含量,為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

        通過(guò)西瓦克顆粒與ABTS、DPPH 的反應(yīng)表明其具有良好的清除自由基和抗氧化活性的作用[27-28]。

        綜上所述,本研究所建立的指紋圖譜可用于西瓦克顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià),含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便,可同時(shí)測(cè)定5 種特征成分的含量,與抗氧化活性相關(guān)的有效成分及其保肝作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的探索和研究。

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