劉少靜，秦 蓓**，余麗麗，姚 琳，康冬妮，何曉佳

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021；2.西安醫(yī)學(xué)院 藥物研究所，陜西 西安 710021)

惡性腫瘤近年來成為嚴(yán)重威脅人類健康的重要?dú)⑹种?，尋找有效的抗癌藥物成為世界醫(yī)學(xué)面臨的重大課題。目前使用的化療藥物多數(shù)存在副作用大、選擇性差、成本高等缺點(diǎn)，針對(duì)抗腫瘤藥物的研發(fā)，在提高藥效的同時(shí)，應(yīng)提高選擇性、降低毒副作用[1-2]。目前從中藥中尋找安全、有效的抗腫瘤活性部位及有效單體化合物已成為開發(fā)抗癌新藥的途徑之一[3-5]。中國被毛孢(Hirsutellasinensis)是冬蟲夏草的無性型菌株，被公認(rèn)為是冬蟲夏草唯一代表性真菌，具有免疫調(diào)節(jié)、降血脂、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤和降血糖等多種生物活性[6-9]。其化學(xué)成分與天然冬蟲夏草成分相似，包括腺苷、尿苷、蟲草素等，已有相關(guān)研究表明蟲草素、中國被毛孢菌絲體多糖等均具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力的活性[10-14]，但未見相關(guān)中國被毛孢提取物及其主要活性成分的抗腫瘤活性進(jìn)行對(duì)比研究的報(bào)道。作者采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)中國被毛孢提取物及其主要活性成分蟲草素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30的抑制率，同時(shí)針對(duì)樣品對(duì)細(xì)胞形態(tài)及凋亡情況的影響進(jìn)行考察。初步對(duì)比其抗腫瘤活性，為中國被毛孢制劑及其單體化合物作為癌癥輔助治療手段提供科學(xué)依據(jù)與臨床指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料、試劑與儀器

蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品：HPLC>98%，上海源葉生物科技有限公司；中國被毛孢菌絲體：杭州眾芝康菇生物技術(shù)有限公司；人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30：中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。

MTT：批號(hào)為M5655，碘化丙啶(PI)：生化試劑，美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)液：批號(hào)為AAK208935，胎牛血清：批號(hào)為NZE1145，美國Hyclone科技有限公司；胰蛋白酶溶液：批號(hào)為2016062902，w(胰蛋白酶)=0.25%，w[乙二胺四乙酸(EDTA)]=0.02%，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、無水乙醇等：均為分析純，市售。

倒置顯微鏡：Ti-u，日本Nikon公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱：MCO-15AC，日本Sanyo公司；自動(dòng)全波長酶標(biāo)儀：Multiskan go，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；冷凍干燥機(jī)：FD-1000，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：CCA-1111 CE，東京理化器械株式會(huì)社；循環(huán)水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；分析天平：ADVENTURER，奧豪斯儀器有限公司；超凈工作臺(tái)：SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 樣品的制備

1.2.1 中國被毛孢提取物的制備

稱取中國被毛孢菌粉約20 g，加入φ(乙醇)=75%溶液，于60 ℃回流提取3次，1 h/次。合并3次提取液，減壓濃縮除去乙醇；加適量水于濃縮液中，進(jìn)行分散后冷凍干燥，制得粉末狀提取物。

(1)提取物溶液的制備：精密稱取1.2.1方法提取物適量，加入DMSO超聲溶解，配置1.5 mg/mL儲(chǔ)備液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。采用RPMI-1640培養(yǎng)基[φ(胎牛血清)=10%]將提取物儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度為25、50、100、200、400、800 μg/mL溶液。

(2)蟲草素溶液的制備：精密稱取蟲草素適量，配置成1 mg/mL的儲(chǔ)備液，過0.22 μm微孔濾膜除菌，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩２捎肦PMI-1640培養(yǎng)液[φ(胎牛血清)=10%]將其稀釋成質(zhì)量濃度為25、50、100、200、400、800 μg/mL溶液。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將復(fù)蘇后的乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30培養(yǎng)于培養(yǎng)基RPMI-1640[φ(胎牛血清)=10%]中，置于37 ℃，φ(CO2)=5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)生長情況換液或消化，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT法檢測(cè)樣品對(duì)腫瘤細(xì)胞活力的影響

將處于對(duì)數(shù)生長期的乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，接種到96孔板中。細(xì)胞貼壁后加入不同質(zhì)量濃度的樣品溶液(25、50、100、200、400、800 μg/mL)，

每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，作用24 h后終止培養(yǎng)；每孔加入ρ(MTT)=5 g/L溶液20 μL，37 ℃避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，保留結(jié)晶物(甲臜)，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃振蕩15 min溶解甲臜，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定每孔的吸光度(OD)。以不加樣品溶液的細(xì)胞懸液作為對(duì)照組，根據(jù)公式(1)計(jì)算樣品對(duì)乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞抑制率，并采用Origin2018軟件進(jìn)行擬合計(jì)算樣品對(duì)乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

(1)

1.5 倒置顯微鏡觀察ZR-75-30細(xì)胞的形態(tài)

為了直觀反映中國被毛孢提取物及蟲草素對(duì)乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞的毒性作用，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。取對(duì)數(shù)生長期的乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞，以每孔1.8 mL(1.8×105個(gè)/孔)接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，吸棄舊培養(yǎng)基，每孔加入ρ(樣品)：25、50、100、200、400、800 μg/mL，溶液2 mL，培養(yǎng)24 h。以相同體積的DMSO溶液代替樣品溶液作為對(duì)照組，于37 ℃，φ(CO2)=5%的條件下培養(yǎng)12 h，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.6 PI單染熒光檢測(cè)細(xì)胞凋亡

在1.5實(shí)驗(yàn)操作的基礎(chǔ)上，向6孔板的每孔中加入1 mLρ(PI)=10 μg/mL溶液，避光孵育30 min，棄去上清液，PBS洗滌3次，置于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

在對(duì)我國各建筑工地進(jìn)行了多次的走訪與調(diào)查之后，從調(diào)查的結(jié)果中不難看出，我國現(xiàn)階段有部分企業(yè)對(duì)于成本的控制缺乏科學(xué)性，存在諸多管理問題?？刂品椒ú豢茖W(xué)，其主要原因有管理制度的缺失，企業(yè)的實(shí)際經(jīng)濟(jì)狀況與工程預(yù)算相脫節(jié)等問題。部分企業(yè)的成本控制方式僅限于理論，并未能結(jié)合實(shí)際，屬于紙上談兵，以至于工程的正常施工受到阻礙，成本資金出現(xiàn)浪費(fèi)問題[2]。除此之外，在工程項(xiàng)目前期的招、投標(biāo)階段，相關(guān)企業(yè)未能理清事實(shí)，過分追求經(jīng)濟(jì)利益的最大化，致使企業(yè)的相關(guān)人員對(duì)于成本的管控缺少嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度，使之控制缺少科學(xué)依據(jù)，會(huì)降低企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益，不利于其經(jīng)營。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品對(duì)乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞生長增殖的影響

配置不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，采用MTT法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度樣品對(duì)乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞活力的影響，并計(jì)算樣品對(duì)乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞抑制率，結(jié)果見圖1。

ρ(樣品)/(μg·mL-1)圖1 不同樣品對(duì)乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞的抑制率

由圖1可知，經(jīng)中國被毛袍提取物、蟲草素處理乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞24 h后，抑制率均隨著ρ(樣品)的增大呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，即抑制率與ρ(樣品)存在依賴關(guān)系。

IC50值是抑制率為50%時(shí)的ρ(樣品)值，IC50值越低，其樣品對(duì)乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞的抑制能力越強(qiáng)。采用Origin2018軟件擬合計(jì)算蟲草素和中國被毛孢提取物對(duì)乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)，結(jié)果見圖2。

樣品圖2 不同樣品對(duì)乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞作用24h的IC50

由圖2可知，蟲草素和中國被毛孢提取物對(duì)乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為51.38和180.16 μg/mL，可以看出，不同樣品對(duì)乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞的抑制能力大小為蟲草素>中國被毛袍提取物。

2.2 乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果

不同ρ(樣品)對(duì)乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞形態(tài)的影響見圖3～圖5。

圖3 對(duì)照組

a 50 μg/mL

b 200 μg/mL

c 400 μg/mL圖4 不同ρ(提取物)對(duì)乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞形態(tài)的影響

a 50 μg/mL

b 200 μg/mL

c 400 μg/mL圖5 不同ρ(蟲草素)對(duì)乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞形態(tài)的影響

由圖3可知，對(duì)照組中的大多數(shù)細(xì)胞生長狀態(tài)良好、排列緊密，呈梭形且邊界清晰；由圖4、圖5可知，加藥組細(xì)胞的形態(tài)均隨著ρ(藥物)增大而發(fā)生顯著變化，細(xì)胞排列逐漸稀疏，出現(xiàn)形態(tài)變圓，細(xì)胞固縮、體積縮小，貼壁細(xì)胞脫落、數(shù)量逐漸減少等死亡特征，表明中國被毛袍提取物、蟲草素均對(duì)乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞有抑制作用，且呈質(zhì)量濃度依賴性。

2.3 乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞凋亡結(jié)果

PI熒光染色后呈現(xiàn)的紅色熒光數(shù)量多少代表了凋亡細(xì)胞的數(shù)目，不同質(zhì)量濃度樣品對(duì)乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞凋亡影響見圖6、圖7。

由圖6、圖7可知，隨著ρ(藥品)增大，2組凋亡細(xì)胞數(shù)目均逐漸增多，說明中國被毛袍提取物、蟲草素均能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且呈質(zhì)量濃度依賴性，ρ(藥品)越大，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力越強(qiáng)。蟲草素誘導(dǎo)乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞凋亡能力大于提取物。

a 50 μg/mL

b 200 μg/mL

c 400 μg/mL圖6 不同ρ(提取物)對(duì)乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞凋亡影響

a 50 μg/mL

b 200 μg/mL

c 400 μg/mL圖7 不同ρ(蟲草素)對(duì)乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞凋亡影響

3 結(jié) 論

(1)采用MTT法檢測(cè)中國被毛孢提取物、蟲草素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30的生長抑制作用，其IC50值分別為180.16和51.38 μg/mL；

(2)PI單染熒光拍照檢測(cè)發(fā)現(xiàn)2個(gè)樣品均以濃度依賴方式誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30凋亡，蟲草素誘導(dǎo)能力大于提取物。提示中國被毛孢提取物、蟲草素能夠有效抑制人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30的生長增殖。