任本春，周曉真，卓孝福

（福建省血液中心，福建 福州 350004）

采供血機構為阻止HBV輸血傳播，對病毒標志物HBsAg和HBV-DNA進行篩查。HBsAg是HBV感染后的特異性血清學標志物,檢測方法通常為酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。由于ELISA可因cut-off設置、內源性以及外源性因素干擾而造成HBsAg假陽性[1],HBsAg ELISA試劑盒說明書提出，對檢測結果反應性標本，應行中和確認試驗進行確證，以排除可能的假陽性。與電化學發(fā)光法、化學發(fā)光法比較，ELISA仍可篩查出絕大部分HBsAg陽性獻血者[2]；中和確認試驗是HBsAg確證試驗，可作為判斷HBsAg是否真陽性的參考標準。HBV-DNA是HBV感染4-5周后，可在血液中檢出的標志物，檢測方法一般包括PCR和TMA。HBV-DNA檢測不僅可以縮短HBV感染窗口期，還可以檢出隱匿性HBV感染（OBI）[3-6]。有些HBV感染者血液只存在HBsAg等血清學標志物，不存在或存在極低載量HBV-DNA,ELISA和NAT平行檢測時，可出現(xiàn)HBsAg+/HBV-DNA-結果，但經過一段時間仍有部分獻血者轉為顯性HBV感染，轉變?yōu)镠BsAg+/HBV-DNA+[7,8]。此外，在獻血者屏蔽和歸隊管理工作中,會對HBsAg+/HBV-DNA-獻血者進行歸隊檢測，根據(jù)歸隊檢測結果，評估獻血者是否恢復獻血資格。

為了解HBsAg+/HBV-DNA-、HBsAg可疑結果/HBV-DNA-（ELISA檢測S/CO值在0.900-0.999）獻血者其HBsAg的S/CO檢測值與中和確認試驗結果之間關系以及HBsAg+/HBV-DNA-獻血者歸隊檢測情況，探討HBsAg+/HBV-DNA-獻血者HBsAg確證的必要性及其歸隊策略，本研究收集兩種標本⑴HBsAg+/HBV-DNA-標本，⑵HBsAg可疑結果/HBV-DNA-標本，對其進行HBsAg中和確認試驗，并對HBsAg S/CO檢測值、中和確認試驗結果以及部分HBsAg+/HBV-DNA-獻血者歸隊檢測資料進行統(tǒng)計、分析，報告如下。

1 材料與方法

1.1 樣本來源2014年1月－2017年3月在本中心無償獻血者269421名（次），每位獻血者均抽2管標本，1管EDTA-K2抗凝真空采血管抽取5 ml用于酶免檢測，1管EDTA-K2抗凝真空采血管抽取8ml用于核酸檢測。HBsAg中和確認試驗采用HBsAg+/HBV-DNA-及HBsAg結 果 可 疑/HBVDNA-獻血者樣本血漿，在-80℃保存。歸隊體檢標本為HBsAg+/HBV-DNA-獻血者后續(xù)歸隊留取,采集標本程序同獻血者標本，用于ELISA/NAT平行檢測。

1.2 試劑與儀器HBsAg試劑盒由DiaSorin S.p.A.UK branch提供。HBsAg中和確認試驗試劑由DiaSorin S.p.A.UK branch Murex提供。核酸聯(lián)合單人份檢測試劑及HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA鑒別試劑盒由西班牙Grifols公司提供。ELISA法所用試劑均為國家批批檢合格且均在有效期內使用。HBsAg質控物質由康徹斯坦生物公司提供，濃度為0.2 IU/ml。HBV-DNA標準物質由康徹斯坦生物公司提供，濃度30IU/ml。全自動加樣系統(tǒng)MICROLAB STAR和酶免反應設備Micro Lab FAME均由瑞士Halmiton公司提供，核酸檢測設備Procleix TIGRIS System由西班牙Grifols公司提供。

1.3 檢測方法

1.3.1 HBsAg與病毒核酸篩查 所有標本采用平行ELISA/NAT檢測模式。HBsAg采用ELISA檢測。NAT采用轉錄介導的核酸擴增技術（TMA），采用HBV-DNA、HCV-RNA和HIV-RNA病毒聯(lián)合單人份檢測，反應性標本需進行鑒別試驗，以區(qū)分感染病毒類別。

1.3.2 HBsAg中和確認試驗 將所保存的標本復融后，進行中和確認試驗。對每一標本，在HBsAg診斷試劑盒的微孔板上設置對照孔和特異孔。在對照孔和特異孔分別加入不含抗-HBs的特異性抗體試劑和樣本進行反應。特異孔中的特異性抗體和微孔板中的固相抗-HBs抗體競爭樣本中的HBsAg，從而使結合到微板上的HBsAg量減少；而對照孔因不存在競爭,樣本中的量正常結合到微孔板,隨后按HBsAgELISA診斷試劑盒使用說明書進行測定。

1.3.3 病毒核酸鑒別試驗 將核酸篩查反應性標本進行HBV-DNA、HCV-RNA和HIV-RNA鑒別試驗，以準確區(qū)分感染病毒類別。鑒別試驗結果為HBV-DNA陽性，方可確定為HBV-DNA陽性。如果鑒別結果均為陰性，定義為不確定性。

1.3.4 歸隊檢測HBsAg+/HBV-DNA-歸隊獻血者按照獻血者標本采集程序采集血樣進行常規(guī)血清學篩查、核酸篩查以及核酸鑒別試驗。

1.3.5 結果判定HBsAg S/CO值＜0.9為無反應性，判為合格。S/CO值≥1為反應性，判為不合格。S/CO值在0.900～0.999之間，結果判為可疑。判為可疑結果標本進行雙孔復查，兩孔S/CO值均小于0.9為無反應性，只要其中1孔為反應性或可疑均判為不合格。HBsAg中和確認試驗按試劑說明書要求計算中和率，以中和率50%為確證陽性。NAT試驗為HBV、HCV、HIV聯(lián)合單人份檢測，OD值≥cut-off值判斷為有反應性，經鑒別試驗后區(qū)分HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA。

1.3.6 質量控制 每天進行室內控制。HBsAg質控品隨同標本檢測，質控值>均值-3SD試驗有效。NAT檢測按照試劑說明書判讀結果的有效性。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、分析，繪制ROC曲線，計算ROC曲線下面積（AUC）,以AUC＞0.9認為診斷有準確性。組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HBsAg、HBV-DNA檢出情況 在2014年1月-2017年3月期間檢出HBsAg+/HBV-DNA-獻血者標本499例，檢出率為0.185%（499/269421）；檢出HBsAg結果可疑/HBV-DNA-獻血者標本62份，檢出率為0.023%（62/269421）。

2.2 HBsAg+/HBV-DNA-獻血者HBsAg中和確認試驗結果 對499例HBsAg+/HBV-DNA-獻血者標本進行中和確認試驗，確證陽性346例，確證陽性率為69.3%，假陽性率30.7%。以HBsAg中和確認試驗結果為診斷參考標準，對ELISA檢測的S/CO值進行分組，各組中和確認試驗確證陽性率隨S/CO值增加而增高，其陽性率從7.5%升高到91.2%，見表1。

表1 499例HBsAg+/HBV-DNA-獻血者HBsAg中和確認試驗確證結果

2.3 HBsAg結果可疑/HBV-DNA-獻血者標本中和確認試驗結果 對62例HBsAg結果可疑/HBVDNA-獻血者標本進行HBsAg中和確認試驗，除2例為確證陽性之外，其余60例結果為陰性。

2.4 ROC曲線繪制 將ELISA S/CO值及中和確認試驗結果導入SPSS20.0，進行ROC曲線分析，ROC線下面積（AUC）為0.934，以AUC＞0.9認為診斷有準確性。Youdeng指數(shù)取最大時最佳截斷CO值（S/CO）為1.60，比試劑廠家推薦的CO值高。最佳截斷CO值時其靈敏度為95.4%，特異性為80.6%，見圖1。

圖1 S/CO ROC曲線

2.5 歸隊檢測結果86例HBsAg+/HBV-DNA-獻血者參加歸隊檢測，2.4%(2/86)獻血者檢測結果由HBsAg+/HBV-DNA-轉為HBsAg+/HBV-DNA+，67.4%(58/86)獻血者檢測結果由HBsAg+/HBVDNA-轉為HBsAg-/HBV-DNA-，30.2%(26/86)獻血者檢測結果保持HBsAg+/HBV-DNA-不變。2例獻血者HBV-DNA陽轉情況，見表2。

表2 2例HBsAg+/HBV-DNA-轉為HBsAg+/HBV-DNA+的獻血者情況

3 討論

HBV可經血液和血制品傳播，是我國《血站標準操作規(guī)程》規(guī)定的強制檢驗項目，可采用ELISA、化學發(fā)光法篩查HBsAg及NAT篩查HBV-DNA。ELISA篩查HBsAg由于操作簡單、敏感性高、成本低廉，適用于大批量標本，但也受方法學、內外源干擾因素的影響，可造成假陽性。劉孫琴[9]等報告HBsAg反應性標本必須經中和確認試驗確證后方可報告HBsAg陽性。WHO頒布的《篩查獻血者血液經輸血傳播感染的建議書》，要求血站實驗室開展篩查和確認試驗,分別用于血液篩查和獻血者管理[10]。

2014年1月-2017年3月檢出499例HBsAg+/HBV-DNA-獻血者標本,檢出率為0.185%（499/269421），經HBsAg中和確認驗后，確認HBsAg真陽性346例，確證陽性率69.3%。這提示：⑴即使HBV-DNA檢測陰性，如果不進行HBsAg檢測，仍有相當部分獻血者存在HBV漏檢可能。因此應重視血清學HBsAg檢測，⑵對于弱反應性S/CO值在1.0～1.29和1.30～2.99獻血者標本,中和確認試驗確證陽性率分別為7.5%，49.0%,HBsAg假陽性率分別為92.5%、51.0%。這些弱反應性獻血者如果未進行中和確認試驗,采供血機構會將這些獻血者永久屏蔽，這不但會造成獻血者流失，還會給其帶來心理壓力，引起抱怨和投訴，不利于血液事業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，我們認為，實驗室應不斷優(yōu)化實驗室質量管理體系，從人、機、料、法、環(huán)方面著手，制定科學的SOP，加強工作人員培訓，對設備定期進行有效的維護和校準,使用前對試劑進行科學的性能評價、選擇靈敏度和特異性高的HBsAg酶免試劑盒,加強檢測前標本質量控制，減少標本凝塊、溶血和標本污染產生,在提高檢測準確性時盡量減少假陽性產生。HBsAg中和確認試驗是以HBsAg酶免篩查反應性的血液標本進行的確證實驗，可以滿足獻血者管理的需要。對于存在非特異性或生物學假陽性篩查結果應向獻血者解釋說明，勸其推遲獻血或回歸進一步隨訪，然后根據(jù)隨訪結果，做出永久屏蔽獻血或可再次獻血的決定。

62例HBsAg結果可疑獻血者中，2例被確證為陽性。對于這類低于cut-off值一些的標本，各個實驗室中和確認試驗結果不一。李雪梅[11]等在46份科華試劑檢測的HBsAg灰區(qū)（S/CO值0.8-1.0）標本經中和確認試驗后確證2例陽性,王瑞[12]在44例灰區(qū)獻血者標本（S/CO值在0.900-0.990）進行中和確認試驗，結果均為無反應性。由于中和試驗本身可能具有的方法學上的缺陷,加上本次2例陽性結果未進行其它檢驗方法和血清標志物驗證及追蹤檢測，故僅憑中和確認試驗結果無法確定其是否為HBV感染攜帶者。根據(jù)朱為剛等[13]研究，HBsAg濃度0.5ng/ml以下的檢出率為0.27%；也有研究認為，部分血清HBsAg處于低水平狀態(tài)，忽視弱反應性結果,尤其是陽性分界cut-off值以下的結果會造成人群的漏檢[14]；從理論上分析，一些真陽性標本其真實值S/CO為1，但由于試劑、設備、操作、環(huán)境等因素影響，檢測的S/CO值出現(xiàn)大于1或小于1的概率為50%,真陽性標本可能發(fā)生漏檢；因此對低于cut-off值一些的標本，各實驗室可根據(jù)具體情況用其它方法或檢測其它血清學標志物進行驗證[15]。

以HBsAg中和確認試驗結果為診斷參考標準,ELISA為診斷試驗,繪制的ROC線下面積(AUC)為0.934，以AUC＞0.9認為診斷有準確性，可以認為ELISA檢測HBsAg準確性較高。利用ROC曲線最佳cut-off值(S/CO=1.6)來判定ELISA檢測結果時,特異性為80.6%，靈敏度為95.4%，但會有15份S/CO小于1.6、中和確認試驗陽性的標本被判斷為無反應性，這可能導致陽性標本漏檢。使用廠家推薦的cut-off值為診斷分界值時，靈敏度為99.4%，特異性為28.2%，其靈敏度提高，特異性降低，導致假陽性標本數(shù)量增多，影響試驗的整體性能。由于血站實驗室以篩檢為目的，應盡可能檢出HBV感染的獻血者,若以廠家推薦cut-off值來判定有無反應性標準，雖可導致部分假陽性，但也可保證血液安全，降低經血傳播HBV感染機會。

對86例HBsAg+/HBV-DNA-獻血者歸隊檢測結果表明，僅有2.4%（2/86）HBsAg+/HBV-DNA-獻血者轉為HBsAg+/HBV-DNA+，低于張宏[7]在30例HBsAg＋/HBV-DNA-獻 血 者 中 有13例 轉 為 顯 性HBV感染（HBsAg+/HBV-DNA+）的比例，也低于黃成垠等[8]報道的50%（4/8例）陽轉比例。對于HBsAg+/HBV-DNA-檢測結果可認為此時血液中存在HBV表面外殼蛋白，不存在或存在極低載量的HBV-DNA,以致高靈敏度的核酸擴增方法呈陰性。本研究中2例HBV-DNA陽轉若排除了非特異性或假陽性因素,造成HBV-DNA陽轉的原因可能為機體免疫功能下降，HBV-DNA再次復制所致[16]。值得注意的是,由表2可知，2例發(fā)生HBV-DNA陽轉的獻血者其HBsAg S/CO=1附近波動，提示HBV-DNA陰性、HBsAg S/CO=1附近波動的獻血者也可發(fā)生HBV-DNA陽轉，應引起重視。本研究中67.4%(58/86)獻血者檢測結果由HBsAg+/HBVDNA-轉為HBsAg-/HBV-DNA-,成為HBV感染康復獻血者。因此對于血液篩查結果為HBsAg+/HBVDNA-的獻血者,其獻血資格是否保留或淘汰需謹慎判斷,以本研究結論傾向于對這類獻血者進行歸隊檢測，若歸隊檢測合格，可恢復其獻血資格。

綜上所述,由于NAT檢測HBV-DNA存在缺陷,存在漏檢可能，因此NAT與ELISA檢測呈互補作用，血站應強制篩查HBsAg。在選擇HBsAg試劑時,要考慮血站實驗室是以篩檢為目的的檢出要求，應盡可能檢出HBV感染獻血者，因此要選擇靈敏度和特異度都較高的試劑。ELISA篩查HBsAg存在假陽性，出現(xiàn)HBsAg+/HBV-DNA-檢測結果時有必要對獻血者進行HBsAg中和確認試驗，根據(jù)確證結果對獻血者進行合理的解釋，從而有利于獻血者的管理。此外，HBsAg+/HBV-DNA-獻血者可參加歸隊檢測，根據(jù)歸隊檢測結果評估是否恢復獻血資格。