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        一起人腺病毒55型引起的兒童發(fā)熱暴發(fā)疫情病原學(xué)鑒定

        2021-07-29 02:45:56劉師文熊英李健雄張艷妮徐剛肖芳劉曉慶龔甜
        實驗與檢驗醫(yī)學(xué) 2021年3期
        關(guān)鍵詞:疫情兒童

        劉師文,熊英,李健雄,張艷妮,徐剛,肖芳,劉曉慶,龔甜

        (江西省疾病預(yù)防控制中心疾病檢測所,江西 南昌 330029)

        人腺病毒55型(Human adenovirus type 55,HAdV-55)是2006年中國首次在呼吸道感染疫情中分離鑒定的一個新基因型人腺病毒[1]。該病毒是由腺病毒B組HAdV-14和HAdV-11重組進化而來,其基因骨架來自引起呼吸道感染的HAdV-14,部分六鄰體(Hexon)基因來自引起泌尿道感染的HAdV-11[2]。HAdV-55感染主要導(dǎo)致急性呼吸道感染以發(fā)熱、咳嗽、咽痛和咳痰為主要臨床表現(xiàn),易并發(fā)肺炎[3]。與親本HAdV-14及呼吸道腺病毒HAdV-3、HAdV-7相比,HAdV-55的傳播能力更強,發(fā)熱和肺炎的比例更高,暴發(fā)流行的規(guī)模更大[3,4]。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示HAdV-55暴發(fā)以成人為主[5-7],未見引起兒童暴發(fā)疫情的報道。

        2020年8月江西某地出現(xiàn)一起兒童發(fā)熱暴發(fā)疫情,本實驗室根據(jù)臨床癥狀和流行病學(xué)史,采集了3例患兒咽拭標(biāo)本,采用TaqMan微流體芯片、病毒分離及全基因組測序技術(shù)對這起疫情的病原體進行鑒定,報告如下。

        1.1 標(biāo)本采集2020年8月21-8月24日江西省宜某縣29名兒童先后出現(xiàn)發(fā)熱,不同程度咽痛癥狀,所有兒童均于8月9日-8月23日在同一游泳館學(xué)游泳。采集3例具有發(fā)熱(38.5℃~40℃)、咽痛癥狀的患兒(7~9歲)咽拭子標(biāo)本,冷藏運輸條件下運送至本實驗室進行檢測。

        1.2 核酸提取 采用Qiagen公司的QIAamp MinElute Virus Spin Kit試劑提取咽拭子樣本和病毒分離物的核酸,具體操作參照試劑說明書。

        1.3 病原種類確定 采用TaqMan Gene Expression Custom Array Card(Cat No:4342253,美國Applied Biosystems公司)微流體芯片技術(shù)對樣本進核酸檢測,病原包括腺病毒、流感病毒、冠狀病毒、肺炎衣原體、肺炎鏈球菌等42種呼吸道病原體。根據(jù)TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix(Cat No:4444 432,美國Applied Biosystems公司)說明書要求配置預(yù)混液。每個樣本取30μl的核酸模板加入到70μl的預(yù)混液中,混均,加入到檢測板,離心后上機進行核酸擴增。采用ABI ViiA 7實時熒光定量PCR儀進行擴增,反應(yīng)條件:50℃20 min;95℃2 min;95℃3s,60℃30s(收集熒光信號),45個循環(huán)。

        1.4 人腺病毒Hexon基因片段擴增和序列測定采用巢式PCR對腺病毒陽性標(biāo)本核酸Hexon基因片段進行擴增,引物序列及擴增方法參照文獻[8],目的片段大小688bp-821bp(不同型別腺病毒目的片段大小有差異)。

        擴增出Hexon基因產(chǎn)物瓊脂糖電泳后切膠回收,回收產(chǎn)物采用美國ABI SeqStudio Genetic Analyzer一代測序儀進行基因序列測定。測序結(jié)果經(jīng)Blast同源比對,確定與之同源性最高的基因序列。從Genbank下載腺病毒基因參考序列,采用MEGA7.0軟件以最大似然法(Maximum Likelihood method,ML)構(gòu)建Hexon基因片段序列系統(tǒng)進化樹,確定腺病毒的基因型別。

        1.5 病毒分離 采用Hep-2細胞對腺病毒陽性咽拭子標(biāo)本進行病毒分離,方法參照文獻[9]。

        1.6 腺病毒分離株基因組序列測定 采用78對引物分段擴增腺病毒分離株的全基因組序列,引物序列和擴增方法參照文獻[10],擴增產(chǎn)物送至上海生物工程有限責(zé)任公司進行序列測定,運用CLC Genomics Workbench生物學(xué)軟件對序列進行拼接,采用MEGA7.0軟件以最大似然法構(gòu)建腺病毒基因全序系統(tǒng)進化樹。

        2 結(jié)果

        2.1 病原種類確定 共采集3名患兒咽拭子標(biāo)本3份(樣本編號:2020YQ522-524)。對3份樣本進行42種病原的檢測,其中有兩種檢測腺病毒引物,結(jié)果顯示3份樣本均為腺病毒陽性,見圖1,流感病毒等其他41種病原均為陰性。

        圖1 微流體芯片檢測擴增圖

        2.2 腺病毒Hexon基因擴增和測序 對3份人腺病毒核酸陽性標(biāo)本Hexon基因片段進行擴增,PCR產(chǎn)物電泳圖,見圖2,三個樣本均出現(xiàn)了目的條帶。

        圖2 Hexon基因片段擴增產(chǎn)物電泳圖

        3個PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后一代測序均獲得長708bp的基因序列。測序結(jié)果經(jīng)Blast同源比對,確定該3個序列與HAdV-55型同源性最高,其次為腺病毒B組HAdV-11。通過與HAdV-7、HAdV-3、HAdV-11、HAdV-14型 以及7株HAdV-55型參考株基因序列進行比對,并構(gòu)建基因親緣性關(guān)系樹,見圖3發(fā)現(xiàn),2020YQ522、2020YQ523、2020YQ5 24均分布在B組HAdV-55一個分支上,和其他參考腺病毒型別相比,與HAdV-11親緣關(guān)系最近。同源性分析發(fā)現(xiàn)2020YQ522、2020YQ523、2020YQ 524之間核苷酸序列同源性100%,與HAdV-55原型株(DS-DLL)的Hexon基因核苷酸序列同源性為100%。

        圖3 人腺病毒Hexon部分基因親緣性關(guān)系樹(409-1086bP)

        2.3 腺病毒病毒分離 采用Hep-2細胞對咽拭子樣本進行分離,其中2020YQ523、2020YQ524在接種后第二天開始出現(xiàn)細胞變圓,聚集如葡萄串狀等典型腺病毒CPE病變特征,接種后第3d和第5d完全病變,最終成功分離到兩株腺病毒(2020YQ 523、2020YQ524),2020YQ522未分離成功。

        2.4 腺病毒分離株基因組序列與分析 選取病毒分離株2020YQ523核酸進行分段擴增測序,經(jīng)序列拼接獲得長34 443bp的基因序列。應(yīng)用MEGA7.0軟件比對分析顯示獲得的腺病毒基因組序列與HAdV-55原型株QS-DLL同源性最高,為99.99%,僅存在4個核苷酸差異,分別為核苷酸第1 721位(A-T)、8 394位(A-T)、22 904位(G-A)、28 827位(G-T),其中第1 721、22 904位核苷酸變異分別導(dǎo)致氨基酸發(fā)生了I-L、P-L的變異,第8 394、28827位核苷酸變異未導(dǎo)致氨基酸發(fā)生變異。

        基于腺病毒全基因組構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹見圖4,由圖可見2020YQ523分布在B組HAdV-55型分支,和其他參考腺病毒型別相比,該病毒與HAdV-14親緣關(guān)系最近。

        圖4 基于腺病毒全基因組構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

        3 討論

        腺病毒可通過不同基因型之前發(fā)生重組而產(chǎn)生新的基因型,HAdV-55就是由HAdV-14和HAdV-11在Hexon基因發(fā)生重組產(chǎn)生。張艷妮等[9]對江西省2010年至2014年2645份兒童呼吸道感染樣本腺病毒基因型別進行研究未發(fā)現(xiàn)HAdV-55。本研究通過微流體芯片、病毒分離、基因組測序分析技術(shù)確定本次疫情病原體為HAdV-55。序列分析結(jié)果顯示,與參考的其他型別腺病毒相比,2020YQ523毒株Hexon基因片段序列與HAdV-11親緣關(guān)系最近,而全基因序列分析顯示與HAdV-14親緣關(guān)系最近,研究結(jié)果與朱小娟等一致[11],進一步證實該病毒是由HAdV-14和HAdV-11重組病毒而來,對HAdV-55病原鑒定時應(yīng)結(jié)合全基因序列分析的方法。這是江西省內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)由HAdV-55引起暴發(fā)疫情的報道,事件原因可能是因為游泳館集中培訓(xùn)造成的人員交叉感染。

        目前報道的HAdV-55的暴發(fā)疫情主要為成人[5-7],尤其是在軍營中[6,12],其次是青少年(中學(xué))[1,13],尚未見兒童暴發(fā)疫情的報道??赡苁腔诂F(xiàn)有研究報道,有研究提到了HAdV-55暴發(fā)流行感染人群的特殊性[14],然而本次疫情涉及至少29名兒童,采集到樣本的3名患兒分別為7、8、9歲,確定為一起兒童發(fā)熱暴發(fā)疫情。結(jié)合HAdV-55在人群散發(fā)感染中的報道,如Xu等[15]通過對急性呼吸道感染兒童進行了5年的腺病毒監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)8例HAdV-55感染,患兒平均年齡0.73±0.78歲;本實驗室曾在散發(fā)兒童急性眼結(jié)膜炎兒童中發(fā)現(xiàn)6例HAdV-55感染,患兒年齡4月~10歲[16];Cao等[3]發(fā)現(xiàn)21例HAdV-55感染社區(qū)獲得性肺炎病例均大于10歲,我們認為HAdV-55暴發(fā)流行感染不具有人群的特殊性,可能在各年齡人群暴發(fā),而且可能不僅存在發(fā)熱呼吸道疾病暴發(fā)風(fēng)險,也存在急性結(jié)膜炎等暴發(fā)風(fēng)險。

        為了更好的應(yīng)對由HAdV-55引起的暴發(fā)或者流行,急需建立有效的腺病毒監(jiān)測體系,加強監(jiān)測,掌握該病毒進化及流行情況,為其感染暴發(fā)的預(yù)測預(yù)警提供科學(xué)依據(jù)。

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