王嬌，張秀瓏，王佳興，付鶴鵬，張玉想*

1河北北方學(xué)院研究生學(xué)院，河北張家口 075000；2河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北張家口 075000；3解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100091；4河北省滄州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河北滄州 061001

膿毒癥的病理生理特征是感染引起宿主體內(nèi)失控性的炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)組織及器官功能損傷，嚴(yán)重者可進(jìn)展為多臟器衰竭(multiple organ failure，MOF)[1]。急性肺損傷(acute lung injury，ALI)及急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是膿毒癥的主要并發(fā)癥[2]，但目前膿毒癥肺損傷的機(jī)制及治療方法尚不十分明確[3]。自噬是由溶酶體介導(dǎo)的對老化細(xì)胞器、病原體的吞噬降解過程，是一種重要的防御保護(hù)機(jī)制，在細(xì)胞老化、代謝、免疫、感染等方面起著重要作用[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥大鼠肺組織自噬水平升高，而上調(diào)自噬可以減輕膿毒癥大鼠的肺損傷[6-8]。盡管近年來膿毒癥的治療已經(jīng)取得了長足的進(jìn)步[9]，但膿毒癥仍然是危重患者死亡的重要原因?？ńj(luò)磺鈉是一種腎上腺素縮氨脲與磺酸鈉的復(fù)合物，主要通過提高毛細(xì)血管壁的彈性而降低血管通透性，增強(qiáng)血管損傷部位的回縮能力，從而減輕出血或止血[10]。本研究觀察卡絡(luò)磺鈉對膿毒癥大鼠肺形態(tài)學(xué)、影像學(xué)、血氧交換功能、血管通透性改變及自噬水平的影響，并初步探討其作用機(jī)制，以期為膿毒癥肺損傷的救治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 健康清潔級雄性Wistar大鼠145只，體重220～240 g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。注射用卡絡(luò)磺鈉(20 mg/支，武漢華龍生物制藥有限公司)，自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)及伊文氏藍(lán)(美國Sigma公司)，Micro-CT(德國西門子公司，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所影像平臺提供)，GEM PREMIER 4000血?dú)夥治鰞x(美國Werfen公司)，兔抗大鼠LC3B的多克隆抗體(美國CST公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，Nikon & Spot圖像采集處理系統(tǒng)(日本Nikon公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 膿毒癥大鼠模型制備及實(shí)驗(yàn)分組 選取125只大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、膿毒癥組、卡絡(luò)磺鈉低劑量(8 mg/kg)組、卡絡(luò)磺鈉中劑量(40 mg/kg)組、卡絡(luò)磺鈉高劑量(80 mg/kg)組，每組25只。按照文獻(xiàn)[11]中的方法對大鼠行盲腸結(jié)扎穿孔，構(gòu)建嚴(yán)重腹腔感染致膿毒癥模型：動物術(shù)前稱重、編號，禁食12 h，自由飲水。用3%戊巴比妥40 mg/kg行腹腔注射麻醉。大鼠麻醉后固定，沿腹中線做一長約1.5 cm的切口，逐層切開，暴露直腸并小心游離其盲腸盲端，在距盲端1 cm處結(jié)扎，用18號針頭貫穿2次，擠出少量腸內(nèi)容物，并留置一條2 mm寬的橡皮條貫通盲腸，防止針孔閉合。然后將盲腸小心移入腹腔，逐層縫合腹壁切口。術(shù)后動物可自由活動及飲水。假手術(shù)組只開腹翻動腸管后關(guān)腹，不結(jié)扎及穿孔盲腸?？ńj(luò)磺鈉低、中、高劑量組分別在術(shù)后0.5 h、8 h及16 h于大鼠腹腔內(nèi)注射不同劑量(8、40、80 mg/kg)的卡絡(luò)磺鈉。假手術(shù)組與膿毒癥組大鼠于同時間點(diǎn)腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2 大鼠術(shù)后生存率觀察 每組隨機(jī)選取15只大鼠，分別于術(shù)后6、12、24、36、48、72 h觀察其生存情況，計(jì)算生存率。

1.2.3 大鼠動脈血?dú)鉁y定 每組隨機(jī)選取10只大鼠用于檢測卡絡(luò)磺鈉對膿毒癥肺損傷肺形態(tài)學(xué)及功能的影響。術(shù)后24 h，假手術(shù)組及膿毒癥組、卡絡(luò)磺鈉低、中、高劑量組各存活10、6、7、9、8只大鼠，麻醉后用肝素抗凝的1 ml動脈血?dú)忉樈?jīng)腹主動脈采血0.5 ml，采用PREMIER 4000動脈血血?dú)夥治鰞x測定氧分壓(PO2)、二氧化碳分壓(PCO2)，計(jì)算氧合指數(shù)。

1.2.4 大鼠肺部Micro-CT檢測 術(shù)后24 h麻醉大鼠，采用Micro-CT觀察大鼠肺部影像學(xué)特點(diǎn)。測量參數(shù)：攝片時間120 s，電壓90 kV，電流160 μA，照片像素40 μm，重建后圖片像素大小1024×1024。

1.2.5 大鼠肺系數(shù)檢測 采用頸部脫臼法將各組存活大鼠處死，取大鼠雙側(cè)肺，吸干表面水分，計(jì)算肺系數(shù)。肺系數(shù)(LW/BW)=肺濕重(mg)/大鼠體重(g)。

1.2.6 大鼠肺組織病理學(xué)觀察及評分 剪取各組大鼠右肺下葉組織小塊，浸入4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片(5 μm)，HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。在光鏡下任意選取10個視野，參照Hong等[12]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肺組織病理損傷計(jì)分。DM4000B光學(xué)顯微鏡觀察病理學(xué)結(jié)果，進(jìn)行病理學(xué)評分，評分項(xiàng)目包括肺泡腔充血、中性粒細(xì)胞浸潤、纖維蛋白滲出、肺泡間隔增寬，每項(xiàng)按損傷程度評為0、1、2及3分，分別為無損傷、輕度損傷、中度及重度損傷，取其平均值。

1.2.7 大鼠肺組織通透性檢測 采用伊文氏藍(lán)(EB)染料滲出技術(shù)[13]檢測大鼠肺組織通透性。大鼠尾靜脈注射溶于生理鹽水的EB(2 ml/kg)，然后用PBS(10 ml)沖洗肺循環(huán)；取右下肺葉約0.2 g，浸泡在2 ml甲酰胺溶液(1 ml/100 mg)中，與甲酰胺在60 ℃條件下共孵化16 h，待肺組織中色素全部萃取后，取出組織，7000×g離心10 min，取上清液，測量吸光度(OD620)值，計(jì)算組織中的EB含量，以此表示肺血管通透性。

1.2.8 Western blotting測定大鼠肺組織LC3蛋白表達(dá)量 由于卡絡(luò)磺鈉中、高劑量組大鼠肺組織改變無明顯差異，因此只測定假手術(shù)組、膿毒癥組、卡絡(luò)磺鈉低劑量組、卡絡(luò)磺鈉中劑量組大鼠肺組織中LC3的表達(dá)。將100 μg大鼠肺組織裂解液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂奶粉封閉。一抗為兔抗大鼠LC3多克隆抗體(1:800，美國CST公司)，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1:5000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色。以GAPDH為內(nèi)參照。以特異性LC3與對應(yīng)GAPDH蛋白條帶光密度值的比值LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表示LC3蛋白的表達(dá)量。

1.2.9 3-MA對大鼠肺組織自噬水平的影響 為探討卡絡(luò)磺鈉干預(yù)機(jī)制與自噬的關(guān)系，另取大鼠20只，隨機(jī)分為自噬抑制劑組(3-MA組)與卡絡(luò)磺鈉中劑量(40 mg/kg)組，每組10只?？ńj(luò)磺鈉中劑量組分別于術(shù)后0.5 h、8 h及16 h腹腔內(nèi)注射40 mg/kg卡絡(luò)磺鈉；3-MA組于術(shù)后即刻腹腔內(nèi)注射15 mg/kg 3-MA，術(shù)后0.5 h、8 h及16 h予40 mg/kg卡絡(luò)磺鈉干預(yù)。按1.2.3、1.2.6和1.2.8中的方法檢測大鼠肺組織氧合功能、組織病理學(xué)改變及LC3蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；兩組間比較采用t檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法分析生存率。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 卡絡(luò)磺鈉對膿毒癥大鼠生存率的影響 各卡絡(luò)磺鈉組大鼠生存率均高于膿毒癥組，卡絡(luò)磺鈉中劑量及高劑量組大鼠生存率高于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，卡絡(luò)磺鈉中劑量與高劑量組大鼠生存率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1)。

圖1 各組大鼠生存率比較(n=15)Fig.1 Comparison of survival rate of rats in each group (n=15)

2.2 卡絡(luò)磺鈉對膿毒癥大鼠肺氧合功能的影響膿毒癥組大鼠動脈血PO2及氧合指數(shù)低于假手術(shù)組，各卡絡(luò)磺鈉組大鼠動脈血PO2及氧合指數(shù)均高于膿毒癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；各卡絡(luò)磺鈉組間大鼠動脈血PO2及氧合指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組大鼠動脈血PCO2差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 各組大鼠動脈血PO2、PCO2及氧合指數(shù)比較 (mmHg,±s)Tab.1 Comparison of PO2, PCO2 and oxygenation index of rats in each group (mmHg, ±s)

表1 各組大鼠動脈血PO2、PCO2及氧合指數(shù)比較 (mmHg,±s)Tab.1 Comparison of PO2, PCO2 and oxygenation index of rats in each group (mmHg, ±s)

PO2. 氧分壓；PCO2. 二氧化碳分壓；與假手術(shù)組比較，(1)P<0.01；與膿毒癥組比較，(2)P<0.01。

組別 PO2PCO2氧合指數(shù)假手術(shù)組(n=10)118.5±21.7 31.3±8.7 564.3±103.2膿毒癥組(n=6)60.0±20.0(1) 38.3±11.5 285.7±95.2(1)卡絡(luò)磺鈉低劑量組(n=7) 77.13±22.0(2) 38.9±11.3 367.3±104.6(2)卡絡(luò)磺鈉中劑量組(n=9) 87.0±14.0(2) 33.4±8.5 414.4±66.9(2)卡絡(luò)磺鈉高劑量組(n=8) 85.9±16.3(2) 34.1±11.4 408.7±77.9(2)F 9.9800.7749.981 P<0.0010.549<0.001

2.3 卡絡(luò)磺鈉對膿毒癥大鼠肺影像學(xué)的影響Micro-CT結(jié)果顯示，膿毒癥大鼠雙肺見斑片狀滲出，嚴(yán)重者可發(fā)生肺不張及肺實(shí)變(圖2，黑色箭頭)。給予卡絡(luò)磺鈉干預(yù)后，大鼠雙肺斑片滲出明顯減少，未見明顯的肺不張及肺實(shí)變；且隨著藥物劑量的增加，大鼠肺部炎癥表現(xiàn)逐漸減輕(圖2)。

圖2 各組大鼠肺Micro-CT結(jié)果Fig.2 Micro-CT show of each group rats

2.4 卡絡(luò)磺鈉對膿毒癥大鼠肺水腫的影響 肉眼觀察見假手術(shù)組大鼠肺組織表面光滑、干燥，紅白相間；膿毒癥大鼠肺組織腫脹明顯，表面呈暗紅色，且液體滲出較多。與膿毒癥大鼠比較，卡絡(luò)磺鈉組大鼠肺組織腫脹減輕，表面逐漸恢復(fù)至紅白相間，且肺表面液體滲出逐漸減少(圖3)。肺系數(shù)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，膿毒癥組大鼠肺系數(shù)明顯增加，而卡絡(luò)磺鈉中、高劑量組大鼠的肺系數(shù)與膿毒癥組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

圖3 各組大鼠肺組織標(biāo)本肉眼觀Fig.3 Macroscopic view of lung tissue specimens of rats in each group

表2 各組大鼠肺組織的特征表現(xiàn)(±s)Tab.2 Appearance of lung tissue of rats in each group (±s)

表2 各組大鼠肺組織的特征表現(xiàn)(±s)Tab.2 Appearance of lung tissue of rats in each group (±s)

與假手術(shù)組比較，(1)P<0.0 5；與膿毒癥組比較，(2)P<0.05；與卡絡(luò)磺鈉低劑量組比較，(3)P<0.05。

EB含量(μg/g)假手術(shù)組 (n=10)3.2±0.42.5±1.416.3±3.1膿毒癥組 (n=6)4.4±0.4(1) 13.5±1.5(1) 40.7±2.7(1)卡絡(luò)磺鈉低劑量組(n=7) 4.1±0.5 10.9±2.2(2) 31.0±2.0(2)卡絡(luò)磺鈉中劑量組(n=9) 3.8±0.7(2) 5.8±1.7(2)(3) 24.5±2.3(2)(3)卡絡(luò)磺鈉高劑量組(n=8) 3.7±0.4(2) 5.0±2.6(2)(3) 22.4±2.8(2)(3)F 6.50443.180102.100 P 0.001<0.001<0.001組別肺系數(shù)(mg/g)病理學(xué)評分(分)

2.5 卡絡(luò)磺鈉對膿毒癥大鼠肺組織學(xué)的影響 HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠肺泡壁光滑，肺泡腔無滲出且結(jié)構(gòu)清晰完整。膿毒癥組大鼠肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)大量紅細(xì)胞、炎性細(xì)胞及血漿樣物質(zhì)滲出，肺泡間隔及肺泡壁明顯增厚不均，部分肺泡腔塌陷。各卡絡(luò)磺鈉組大鼠肺部均呈一定程度的組織水腫、炎性浸潤，但嚴(yán)重程度均不及膿毒癥組；中、高劑量組大鼠肺組織的炎癥改變程度較低劑量組進(jìn)一步減輕(圖4)。與假手術(shù)組比較，膿毒癥組大鼠肺病理學(xué)評分明顯升高，各卡絡(luò)磺鈉組大鼠肺病理學(xué)評分均低于膿毒癥組，且卡絡(luò)磺鈉中、高劑量組大鼠肺病理學(xué)評分低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

圖4 各組大鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)Fig.4 Pathological appearance of lung tissues of rats in each group

2.6 卡絡(luò)磺鈉對膿毒癥大鼠肺血管通透性的影響

與假手術(shù)組比較，膿毒癥大鼠肺血管通透性增加，各卡絡(luò)磺鈉組大鼠的肺血管通透性均低于膿毒癥組，且卡絡(luò)磺鈉中、高劑量組大鼠肺組織的通透性低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

2.7 卡絡(luò)磺鈉對膿毒癥大鼠肺組織自噬水平的影響 與假手術(shù)組比較，膿毒癥組大鼠肺組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高(5.1±2.7vs. 2.7±0.7)，卡絡(luò)磺鈉低、中劑量組大鼠肺組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值高于膿毒癥組(6.8±2.6、8.9±1.4vs. 5.1±2.7)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

圖5 卡絡(luò)磺鈉對膿毒癥大鼠肺組織自噬水平的影響Fig.5 The effect of carbazochrome sodium sulfonate on the autophagy level of lung tissue in septic rats

2.8 3-MA對卡絡(luò)磺鈉中劑量組大鼠肺組織氧合功能、病理學(xué)改變及自噬水平的影響 與卡絡(luò)磺鈉中劑量組比較，3-MA組大鼠肺組織病理損傷加重(圖6A)，氧合指數(shù)下降[(292.3±82.1) mmHgvs.(451.9±104.0) mmHg]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6B)。與卡絡(luò)磺鈉中劑量組比較，3-MA組大鼠肺組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低(3.1±1.7vs.8.7±1.6)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6C、D)。

圖6 3-MA對卡絡(luò)磺鈉中劑量組大鼠肺組織氧合功能、病理學(xué)改變及自噬水平的影響Fig.6 そe effect of 3-MA on the oxygenation function, histology and autophagy level of rat lung tissue in the middle dose carbazochrome sodium sulfonate group

3 討 論

卡絡(luò)磺鈉是一種毛細(xì)血管穩(wěn)定劑，已被廣泛用于治療因毛細(xì)血管脆弱性引發(fā)的出血，也可用于治療牙周、關(guān)節(jié)腔、膀胱、前列腺等組織器官的血管高通透性，從而達(dá)到保護(hù)組織器官功能的作用[14-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，卡絡(luò)磺鈉可以抑制肺血管通透性的增加，減輕由碘克沙酸誘導(dǎo)的動脈血PO2降低[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，卡絡(luò)磺鈉可提高膿毒癥大鼠的生存率，對膿毒癥肺損傷具有保護(hù)作用，且具有劑量依賴性。本研究還發(fā)現(xiàn)，卡絡(luò)磺鈉能明顯降低大鼠肺組織EB含量，使動脈血PO2及氧合指數(shù)明顯提升，肺系數(shù)降低，提示卡絡(luò)磺鈉干預(yù)可降低膿毒癥引起的肺血管通透性增加，減輕組織液滲漏，降低肺水含量，改善肺氧合功能，與上述研究結(jié)果一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與膿毒癥組比較，卡絡(luò)磺鈉組大鼠肺影像學(xué)及病理組織學(xué)結(jié)果顯示炎癥浸潤減少，血漿樣滲出減輕，病理評分明顯降低，且中劑量組的效果明顯優(yōu)于低劑量組，證實(shí)應(yīng)用卡絡(luò)磺鈉治療能減輕膿毒癥大鼠的肺損傷，并改善膿毒癥大鼠ALI的特征性改變。

自噬是將體內(nèi)受損的細(xì)胞器或蛋白分子通過溶酶體進(jìn)行自我吞噬及自我降解的過程。細(xì)胞可以通過自噬降解不需要的自身成分，循環(huán)利用氨基酸及其他可以被重新利用的物質(zhì)，且有利于維持細(xì)胞的穩(wěn)定[19]。自噬的改變與肺部疾病相關(guān)，尤其在慢性阻塞性肺疾病、肺動脈高壓、肺纖維化、炎癥性肺損傷、ARDS及結(jié)核的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，可能成為相關(guān)疾病的干預(yù)靶點(diǎn)[20-22]。以往多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)自噬參與了膿毒癥肺損傷的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制[6-8,23]。本實(shí)驗(yàn)通過測定LC3的蛋白表達(dá)量即LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比值來反映自噬程度。LC3是哺乳動物細(xì)胞中酵母自噬相關(guān)基因8(autophagy-related gene 8，ATG8)的同源物，定位于前自噬泡及自噬泡膜表面，是參與自噬體形成的重要基因。自噬未啟動時，LC3以可溶性的LC3-Ⅰ形態(tài)常規(guī)表達(dá)于細(xì)胞表面；當(dāng)自噬發(fā)生時，脂質(zhì)衍生物磷脂酰乙醇胺與LC3-Ⅰ結(jié)合形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ是反映自噬水平的重要分子標(biāo)志物，與自噬泡數(shù)量呈正比[21]。本研究通過Western blotting檢測了膿毒癥急性肺損傷時自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá)情況以及卡絡(luò)磺鈉干預(yù)對其的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膿毒癥肺損傷大鼠肺組織中LC3-Ⅱ表達(dá)增高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯高于假手術(shù)組，提示膿毒癥急性肺損傷時自噬水平增加；卡絡(luò)磺鈉干預(yù)使肺組織的自噬水平增高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值較膿毒癥組增加，且具有一定的劑量依賴性，中劑量組的效果優(yōu)于低劑量組，表明卡絡(luò)磺鈉可上調(diào)大鼠肺組織的自噬水平。本研究結(jié)果還顯示3-MA組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著低于卡絡(luò)磺鈉中劑量組，且3-MA組大鼠肺通透性及組織學(xué)改變明顯加重，提示卡絡(luò)磺鈉的肺保護(hù)作用可被自噬抑制劑3-MA減弱。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，卡絡(luò)磺鈉可能通過減輕血管滲漏、上調(diào)肺組織的自噬水平而對膿毒癥的ALI產(chǎn)生保護(hù)作用，且該保護(hù)作用具有一定的劑量依賴性?？ńj(luò)磺鈉上調(diào)肺組織自噬水平的機(jī)制尚不清楚，未來仍需要進(jìn)一步探討卡絡(luò)磺鈉的作用機(jī)制，并進(jìn)行臨床試驗(yàn)，以期為臨床防治膿毒癥肺損傷提供理論依據(jù)。