羅丹，鄧永強(qiáng)，秦成峰

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，北京 100071

自2002年以來，β-冠狀病毒共導(dǎo)致了三次重大傳染病疫情的暴發(fā)，包括2002－2003年的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)和2012年的中東呼吸綜合征(MERS)，以及2019年底發(fā)現(xiàn)的由新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2，SARS-CoV-2)引起的新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)[1]。與SARS的病死率(10%)相比，COVID-19的病死率低，約為3.7%，但其傳染性高[2]。截至2021年4月19日，全球累計(jì)確診新冠肺炎1.4億例以上，累計(jì)死亡302.6萬例。目前還沒有針對(duì)COVID-19的特效藥，但已有多個(gè)候選藥物在臨床前或臨床研究階段獲得了樂觀的試驗(yàn)結(jié)果[3]。本文主要總結(jié)了COVID-19的潛在治療藥物，并介紹它們的作用機(jī)制、安全性及有效性。

1 SARS-CoV-2的生物學(xué)特性

SARS-CoV-2屬于單正鏈RNA包膜病毒，通常為球形，直徑60～140 nm，外觀形似日冕[4]。SARS-CoV-2基因組由29 903個(gè)核苷酸組成[5]，且與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)基因組序列有79.6%的相似度[6]。SARS-CoV-2基因組分為非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)與結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)(圖1)，共編碼29種蛋白[5]。非蛋白編碼區(qū)編碼16種非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structural proteins，NSP)，其中NSP7、NSP8及NSP12形成RNA依賴的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)，在病毒的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄周期中發(fā)揮重要作用；而NSP3、NSP5可使其他NSP從復(fù)制-轉(zhuǎn)錄復(fù)合物(replication-transcription complex，RTC)中釋放出來，NSP3即木瓜蛋白酶(papain like protease，PLpro)，NSP5即3C蛋白酶(3C-like proteinase，3CLpro)或主蛋白酶(main protease，Mpro)。因此，RdRp、PLpro及3CLpro可作為抑制病毒復(fù)制的藥物靶標(biāo)。結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)主要編碼刺突(spike，S)蛋白、包膜(envelope，E)蛋白、膜(m e m b r a n e，M)蛋白及核衣殼(nucleocapsid，N)蛋白，4種結(jié)構(gòu)蛋白形成冠狀病毒外層，保護(hù)內(nèi)部的RNA。研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2依賴絲氨酸蛋白酶TMPRSS2啟動(dòng)S蛋白[7]，利用S蛋白與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)結(jié)合[1]，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞[8]。近期發(fā)現(xiàn)，在ACE2存在的情況下，嗅上皮細(xì)胞與嗅神經(jīng)細(xì)胞上高表達(dá)另一種受體——神經(jīng)纖毛蛋白(neuropilin-1，NRP1)受體[9-10]，NRP1可通過與S蛋白亞單位S1結(jié)合，增強(qiáng)SARS-CoV-2感染宿主細(xì)胞的能力。因此，TMPRSS2、S蛋白、ACE2及NRP1同樣是抗SARS-CoV-2藥物研究的重要靶點(diǎn)。此外，SARS-CoV-2還編碼9種有助于改變胞內(nèi)環(huán)境、促進(jìn)病毒復(fù)制的輔助蛋白。

圖1 SARS-CoV-2基因編碼蛋白Fig.1 Proteins encoded by SARS-CoV-2 genome

2 病毒靶向藥物

2.1 阿比朵爾(arbidol) 阿比朵爾是一種血凝素抑制劑，可抑制流感病毒脂質(zhì)囊膜與宿主細(xì)胞膜的接觸、吸附及融合。目前包括回顧性隊(duì)列研究、病例報(bào)告在內(nèi)的證據(jù)都顯示，阿比朵爾單獨(dú)或聯(lián)合抗病毒藥物治療COVID-19有一定療效[11-14]，并能改善COVID-19患者的肺部CT影像，提高鼻咽拭子轉(zhuǎn)陰率[15]。

2.2 氯喹(chloroquine，CQ)及羥氯喹(hydroxychloroquine，HCQ) CQ及HCQ廣泛用于治療瘧疾及自身免疫性疾病，可作用于病毒囊膜發(fā)揮抗病毒活性。體外研究顯示，CQ、HCQ在SARS-CoV-2細(xì)胞進(jìn)入及進(jìn)入后階段均起作用[16]，其半最大效應(yīng)濃度(EC50)分別為2.71、4.51 μmol/L[17]。然而，有臨床研究發(fā)現(xiàn)，口服HCQ會(huì)使COVID-19患者的QT間期延長，患者出現(xiàn)心律不齊及心臟性猝死的風(fēng)險(xiǎn)較高[18]。同時(shí)，另外幾項(xiàng)大型隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)研究也證明CQ抗SARS-CoV-2的作用不明顯，且不良反應(yīng)多[19-20]。

2.3 S蛋白靶向藥物 S蛋白在病毒識(shí)別宿主受體、吸附及進(jìn)入細(xì)胞等過程中發(fā)揮重要作用。目前發(fā)現(xiàn)的幾種S蛋白靶向藥物見表1。

表1 S蛋白靶向藥物Tab.1 Drugs targeting spike protein

2.4 PLpro及3CLpro抑制劑

2.4.1 洛匹那韋/利托那韋(lopinavir/ritonavir，LPV-r) 研究發(fā)現(xiàn)，LPV-r可通過抑制冠狀病毒PLpro及3CLpro發(fā)揮抗病毒活性[29-30]，且有多項(xiàng)臨床證據(jù)表明，LPV-r可改善SARS或MERS重癥患者的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，從而改善患者預(yù)后[29,31-32]。最近一項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究指出，LPV-r與阿比朵爾聯(lián)合治療可改善COVID-19患者的肺部CT影像學(xué)表現(xiàn)，對(duì)病毒轉(zhuǎn)陰也有促進(jìn)作用[15]。然而，其他臨床試驗(yàn)則顯示，LPV-r治療并不能降低28 d內(nèi)死亡人數(shù)[33]，且LPV-r治療還會(huì)出現(xiàn)急性腎損傷及繼發(fā)性感染等嚴(yán)重并發(fā)癥[34]。

2.4.2 N3、11a及11b N3是一種Michael受體抑制劑，能與SARS-CoV-2的3CLpro形成共價(jià)鍵，是一種不可逆的3CLpro抑制劑。體外實(shí)驗(yàn)表明，N3可顯著抑制SARS-CoV-2對(duì)Vero細(xì)胞的感染，其EC50為16.77 μmol/L[35]?；?CLpro的三維結(jié)構(gòu)，研究人員還設(shè)計(jì)合成了擬肽類化合物11a、11b，并通過空斑試驗(yàn)測定出11a、11b對(duì)SRAS-CoV-2同樣具有較好的抑制作用，其EC50分別為0.53、0.72 μmol/L[36]。2.5 RdRp抑制劑

2.5.1 瑞德西韋(remdesivir) 瑞德西韋屬于核苷酸類似物，最初是為了控制埃博拉病毒而開發(fā)[37]，隨后證實(shí)其在體外可干擾病毒RdRp，具有抗SARSCoV、MERS-CoV等冠狀病毒的活性[38-39]。然而，目前瑞德西韋對(duì)COVID-19的療效仍存在爭議。有研究對(duì)53例采用瑞德西韋治療的重癥COVID-19患者進(jìn)行隨訪，發(fā)現(xiàn)在平均18 d的隨訪中，大部分患者的臨床癥狀有緩解或出院，僅有7例死亡，表明瑞德西韋治療COVID-19是有希望的[40]。但另一項(xiàng)涉及237例的研究則顯示，與安慰劑相比，瑞德西韋治療的COVID-19重癥患者在臨床癥狀消失時(shí)間、病死率及病毒清除時(shí)間等方面無明顯改善[41]。

2.5.2 法匹拉韋(favipiravir) 法匹拉韋具有廣泛的抗病毒活性，可通過抑制病毒RdRp而干擾病毒基因組的復(fù)制。研究發(fā)現(xiàn)，無論是采用定量RTPCR法還是免疫熒光法，法匹拉韋均可明顯抑制SARS-CoV-2在Vero E6細(xì)胞中的復(fù)制，其EC50為61.88 μmol/L[16]。此外，一項(xiàng)回顧性研究也表明法匹拉韋治療COVID-19中度感染患者在7 d恢復(fù)率及癥狀緩解時(shí)間方面優(yōu)于阿比朵爾[42]。但法匹拉韋單藥治療大樣本病例的有效性及安全性還需進(jìn)一步研究。

2.5.3 EIDD-2801 EIDD-2801是基于核苷酸類似物EIDD-1931而設(shè)計(jì)的新藥，該藥通過模擬核糖核酸結(jié)合到病毒RNA中，導(dǎo)致病毒在RNA合成過程中出現(xiàn)致死性突變，抑制病毒復(fù)制所需的RdRp。體外實(shí)驗(yàn)顯示，EIDD-2801不僅對(duì)SARS-CoV、MERSCoV及SARS-CoV-2具有抑制作用，對(duì)其他冠狀病毒甚至瑞德西韋耐藥毒株也同樣具有較強(qiáng)的抗病毒活性，其對(duì)SARS-CoV-2的IC50為0.3 μmol/L[43-44]。

3 宿主靶向藥物

3.1 絲氨酸蛋白酶TMPRSS2抑制劑 SARS-CoV-2進(jìn)入細(xì)胞需要宿主TMPRSS2活化S蛋白。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，甲磺酸卡莫司他(camostat mesilate)可通過抑制TMPRSS2降低SARS-CoV-2對(duì)Calu-3細(xì)胞的感染[7]。另外，TMPRSS2抑制劑甲磺酸萘莫司他(nafamostat mesilate)對(duì)SARS-CoV-2感染也有抑制作用，其EC50為22.50 μmol/L[16]。

3.2 二氫乳清酸脫氫酶(dihydroorotate dehydrogenase，DHODH)抑制劑 S312與S416是兩個(gè)靶向宿主細(xì)胞DHODH的抑制劑，可通過抑制病毒基因組復(fù)制與免疫調(diào)節(jié)作用而發(fā)揮廣譜抗病毒活性。有研究將S312、S416與病毒在Vero細(xì)胞上共培養(yǎng)24 h，然后用定量RT-PCR法對(duì)細(xì)胞上清中的病毒RNA進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示S312、S416均具有高效抗SARSCoV-2活性，其EC50分別為1.56、0.017 μmol/L[45]，其中S416的選擇指數(shù)大于5882。

PTC299也是一種DHODH抑制劑。有研究用不同濃度的PTC299預(yù)處理Vero細(xì)胞24 h，然后再用感染復(fù)數(shù)(MOI)=0.05的SARS-CoV-2感染細(xì)胞48 h，最后用免疫熒光法定量檢測細(xì)胞內(nèi)的病毒蛋白，結(jié)果顯示，PTC299可使細(xì)胞內(nèi)的病毒載量明顯降低，呈劑量依賴關(guān)系，其EC50為1.96 nmol/L[46]。

3.3 免疫調(diào)節(jié)劑 巴瑞替尼(baricitinib)是一種酪氨酸激酶抑制劑，不僅可通過劫持細(xì)胞因子信號(hào)通路來阻止過度的免疫反應(yīng)，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)吞作用，阻止SARS-CoV-2進(jìn)入宿主細(xì)胞[8,47-48]。托西珠單抗(tocilizumab)則可通過抑制白細(xì)胞介素-6，防止SARS-CoV-2導(dǎo)致的細(xì)胞因子風(fēng)暴引起過度免疫反應(yīng)[49-50]。回顧性研究表明，托西珠單抗可緩解COVID-19患者發(fā)熱、低氧血癥等臨床癥狀及CT影像學(xué)表現(xiàn)，且未見明顯的不良反應(yīng)[51]。

3.4 輔助治療藥物

3.4.1 皮質(zhì)類固醇 皮質(zhì)類固醇可降低毛細(xì)血管通透性并抑制炎性細(xì)胞水平，從而減輕肺部炎癥反應(yīng)。一項(xiàng)回顧性研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于發(fā)生了ARDS的COVID-19患者，用甲潑尼龍治療可降低死亡風(fēng)險(xiǎn)[52]。另一項(xiàng)大規(guī)模臨床試驗(yàn)也顯示，地塞米松使COVID-19重癥患者的病死率降低了1/3[53]。然而，高劑量皮質(zhì)類固醇可能會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)性感染、病毒清除延遲及病毒耐藥性的出現(xiàn)，因此必須謹(jǐn)慎使用。3.4.2 肝素 有研究發(fā)現(xiàn)，接受肝素抗凝治療的COVID-19重癥患者的預(yù)后更佳[54-55]，因此新型肝素類化合物的開發(fā)具有重要意義，但未來仍需要大樣本的臨床研究證實(shí)肝素對(duì)COVID-19的治療作用。

3.4.3 維生素 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，維生素C可保護(hù)肺屏障功能，并通過減輕炎癥反應(yīng)及凝固性改變來減輕肺血管損傷[56-57]；維生素D則通過誘導(dǎo)抗菌肽的產(chǎn)生、降低病毒復(fù)制速度從而阻止促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[58]。目前，維生素D治療COVID-19患者的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。

4 總結(jié)與展望

COVID-19大流行是21世紀(jì)以來人類面臨的最大全球公共衛(wèi)生危機(jī)，但目前仍無安全有效的藥物應(yīng)用于臨床治療。當(dāng)前面臨的主要挑戰(zhàn)包括：(1)缺乏能夠完全模擬人類COVID-19患者疾病特征的動(dòng)物模型，導(dǎo)致許多藥物的臨床前研究受限；(2)許多藥物雖在臨床前實(shí)驗(yàn)中顯示出良好的抗病毒活性，但缺乏有說服力的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)；(3)老藥新用策略未在臨床試驗(yàn)中顯示出明顯優(yōu)勢，沒有確切證據(jù)證實(shí)哪種現(xiàn)有藥物可提高病毒清除率；(4)由于不同地區(qū)的疫情嚴(yán)重程度不同，病例分散且數(shù)量較少的地區(qū)開展臨床試驗(yàn)的可行性相對(duì)較低；(5)新型冠狀病毒易發(fā)生突變，增加了特異性藥物的研發(fā)難度。

就現(xiàn)有的抗新型冠狀病毒藥物研究結(jié)果而言，病毒靶向的中和抗體最有希望成為緩解COVID-19疫情的藥物，雖然SARS-CoV-2中和逃逸株的出現(xiàn)可能會(huì)限制抗體療效，但針對(duì)刺突蛋白不同位點(diǎn)的抗體雞尾酒療法有助于防止病毒產(chǎn)生耐藥性(表2)。

表2 抗新型冠狀病毒藥物研究現(xiàn)況Tab.2 Research status of candidate drugs against SARS-CoV-2

此外，研發(fā)宿主靶向藥物也是未來突破病毒耐藥問題不可或缺的方向。同時(shí)，高通量篩選、人工智能及計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)等多學(xué)科新興技術(shù)的結(jié)合運(yùn)用，也將成為未來新藥研發(fā)的主流趨勢。