湯海燕，張 璐，陸 韜，邱 憬*

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院種植科，江蘇省口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省口腔轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)工程研究中心，江蘇 南京 210029；2東南大學(xué)江蘇省先進(jìn)金屬材料高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211189

在口腔種植學(xué)中，充足的骨量對種植成功率以及預(yù)后至關(guān)重要［1］。缺牙后的牙槽嵴往往存在不同程度的骨吸收。根據(jù)Seibert 分類，將牙槽骨缺損分為水平（Ⅰ型）、垂直（Ⅱ型）、水平-垂直聯(lián)合（Ⅲ型）3類［2］。在前牙美學(xué)區(qū)，種植治療除了需要恢復(fù)咀嚼功能，還要恢復(fù)軟硬組織的自然外形和色澤，獲得理想的美學(xué)效果。而功能和美學(xué)的恢復(fù)首先要對各類牙槽骨缺損進(jìn)行骨增量。引導(dǎo)骨再生（guided bone regeneration，GBR）是一種利用屏障膜和骨移植物重建種植體周圍局部骨缺損的外科手術(shù)，是種植術(shù)中處理骨量不足的常用技術(shù)［3-4］。GBR 能有效修復(fù)局部骨缺損，增強(qiáng)種植體的骨結(jié)合，有利于種植體的長期穩(wěn)定［5］。然而，當(dāng)牙槽骨缺損范圍較大時(shí)，如水平-垂直聯(lián)合（Ⅲ型）缺損，屏障膜容易出現(xiàn)移位、空間支撐力不足、塑形難等情況，使GBR無法滿足大范圍骨缺損修復(fù)的臨床需求［6］。針對這一點(diǎn)，1969 年Boyne 等［7］開始將鈦網(wǎng)應(yīng)用于大范圍不連續(xù)骨缺損的重建，預(yù)成鈦網(wǎng)或個(gè)性化鈦網(wǎng)可單獨(dú)應(yīng)用于水平或垂直骨缺損的骨增量手術(shù)。但鈦網(wǎng)存在不可降解、需要二次手術(shù)取出等弊端。其次，鈦的彈性模量（105～109 GPa）遠(yuǎn)高于人體松質(zhì)骨（10～30 GPa），產(chǎn)生的應(yīng)力遮擋效應(yīng)可引發(fā)鈦網(wǎng)松動(dòng)［8］。這些問題均會(huì)對鈦網(wǎng)在骨增量手術(shù)中應(yīng)用的臨床效果造成不良影響。

相比于傳統(tǒng)鈦網(wǎng)，鎂及鎂合金具有可降解性，且密度小、比強(qiáng)度高、生物相容性較好，在心臟支架等醫(yī)用金屬材料領(lǐng)域發(fā)揮重要作用［9］。鎂（1.738 g/cm3）和鎂合金（1.75～1.85 g/cm3）的密度近似人體皮質(zhì)骨（1.75 g/cm3），而醫(yī)用鈦合金Ti-6Al-4V 的密度高達(dá)4.47 g/cm3［10］。在生物相容性方面，鎂離子在人體中大量存在，參與多種代謝活動(dòng)和生理機(jī)制。人體的每70 kg 體重含有約35 g 鎂，每天對鎂的需求量約375 mg［11］。同時(shí)，鎂及鎂合金均有良好的骨誘導(dǎo)性，鎂離子可以促進(jìn)骨膜內(nèi)干細(xì)胞的成骨分化［12］。

三維打印技術(shù)是一種基于離散、堆積成形理念的先進(jìn)增材制造技術(shù)。將零件的3D 模型沿一定方向離散成一系列的有序薄層，利用激光束逐層掃描液態(tài)樹脂或金屬粉末，從而固化或熔融堆積制成任意形狀的實(shí)體零件［13］。三維打印技術(shù)可以根據(jù)骨缺損部位制備個(gè)性化支架，從而滿足復(fù)雜多變的臨床需求。三維打印鎂合金支架是將鎂合金粉鋪在基板上，通過激光束掃描使其融化，不斷重復(fù)該過程，最終按預(yù)先設(shè)計(jì)打印出鎂合金支架。由此可見，作為植入體內(nèi)的生物醫(yī)用材料，鎂合金具有良好的生物相容性以及足夠的機(jī)械性能，而三維打印技術(shù)能賦予鎂合金支架適配大范圍復(fù)雜骨缺損形態(tài)的能力。因此，本研究擬在三維打印制備鎂合金支架的基礎(chǔ)上，研究其顯微組織結(jié)構(gòu)，測試體外降解性能，并對表面包裹聚乳酸（polylactic acid，PLA）膜層控制其降解速率進(jìn)行初探。

1 材料和方法

1.1 材料

AZ91 鎂合金粉、AZ31 鎂合金（河北金鑫），PLA（NatureWorks，美國），砂紙（香港鷹牌），金剛石拋光噴劑（浙江恒宇），無水乙醇（上海滬試），三氯甲烷（北京國藥），Hank’s 模擬體液（Sigma，美國），打磨拋光機(jī)（濟(jì)南方圓），三維打印機(jī)（M2150T，江蘇三維智能制造研究院），金相顯微鏡（MeF3，奧地利），X射線能量色散光譜儀（OXFORD ULTIM MAX，英國），X射線衍射儀（Smartlab9，日本理學(xué)），顯微維氏硬度計(jì)（FUTURE-TFCH，日本），場發(fā)射掃描電子顯微鏡（TESCAN MAIA3 RISE，捷克）。

1.2 方法

1.2.1 試件制備

應(yīng)用Magics 軟件設(shè)計(jì)直徑3 cm 的圓柱三維模型，經(jīng)數(shù)據(jù)導(dǎo)入、基板打磨和調(diào)平等步驟，將AZ91鎂合金粉均勻鋪開，激光掃描后再次鋪粉并不斷重復(fù)該過程，進(jìn)行三維打印。打印獲得圓柱體后，均勻切割為厚2 mm 的三維打印鎂合金圓片試件（3DAZ91），以直徑3 cm、厚2 mm 的鑄造鎂合金圓片試件（AZ31）為對照組。將20 g PLA 溶解于180 mL 三氯甲烷中，采用浸漬提拉法將3D-AZ91試件表面均勻包裹1層聚乳酸膜（PLA-3D-AZ91）。制備完成的3組鎂合金試件見圖1。

圖1 3組鎂合金試件Figure 1 Magnesium alloy specimens of three groups

1.2.2 金相結(jié)構(gòu)觀察

環(huán)氧樹脂包埋3D-AZ91和AZ31兩組試件，先后采用400#、600#、800#、1000#、1500#砂紙逐級打磨，打磨過程中使用水或酒精降溫防止試件氧化。再采用W1.0 級金剛石拋光噴劑拋光，依次置于雙蒸水、無水乙醇、雙蒸水中超聲清洗后，烘干備用。使用配制的侵蝕劑（1 g 草酸、1 mL 硝酸、1 mL 醋酸、150 mL去離子水）侵蝕8～10 s，無水乙醇超聲清洗后烘干，在金相顯微鏡下觀察各組試件的金相結(jié)構(gòu)。

1.2.3 表面元素分析

采用X 射線能量色散光譜儀（energy dispersive X-ray spectroscopy，EDX）分析3D-AZ91和AZ31兩組試件的表面元素組成。

1.2.4 晶相分析

采用X 射線衍射儀（（X-ray diffraction，XRD）對3D-AZ91 和AZ31 兩組試件的表層相結(jié)構(gòu)進(jìn)行衍射分析，選用銅靶，掃描角度范圍20°～80°，掃描步長0.02 s。

1.2.5 維氏硬度測試

3D-AZ91和AZ31兩組各選3枚試件，采用顯微維氏硬度計(jì)測試試件的維氏硬度值。

1.2.6 體外降解實(shí)驗(yàn)

3D-AZ91、AZ31、PLA-3D-AZ91每組各選3枚試件，置于6 孔培養(yǎng)板中，每孔加入3 mL Hank’s 模擬體液，觀察3組試件表面產(chǎn)生的氣泡大小和數(shù)量，評價(jià)析氫反應(yīng)程度。將6孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）中，24 h后取出浸泡試件，去離子水沖洗后，放入烘箱，干燥后天平稱重。通過浸泡前后試件的質(zhì)量損失計(jì)算失重率（wt%）。計(jì)算公式：wt%=（m1-m2）/m1×100%，m1：初始質(zhì)量；m2：浸泡后的質(zhì)量。

1.2.7 降解后表面微形貌觀察和元素分析

按上述方法將3D-AZ91 和AZ31 兩組試件在Hank’s模擬體液中浸泡24 h，取出后無水乙醇超聲清洗、烘干，采用場發(fā)射掃描電鏡觀察降解后試件的表面微形貌，采用EDX分析試件表面降解產(chǎn)物的元素組成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對各組試件的維氏硬度值和失重率進(jìn)行Levene方差齊性檢驗(yàn)，顯示數(shù)據(jù)方差齊，對維氏硬度值進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，對失重率進(jìn)行單因素方差分析和SNK 多重比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金相結(jié)構(gòu)

3D-AZ91 和AZ31 兩組試件的金相結(jié)構(gòu)如圖2所示。3D-AZ91 的金相結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為均勻分布的熔池，熔池呈短棒狀，長250～300 μm，寬50～100 μm，相鄰熔池之間可發(fā)生堆疊。AZ31 的金相結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為固溶態(tài)合金的等軸晶結(jié)構(gòu)，在晶界處存在少量未完全固溶的顆粒狀細(xì)小第二相。1 000 倍金相顯微圖顯示，3D-AZ91 鎂合金中可見細(xì)小且均勻分布的晶粒組織，晶粒尺寸遠(yuǎn)小于AZ31鎂合金。

圖2 3D-AZ91和AZ31試件的金相結(jié)構(gòu)Figure 2 Metallographic structures of 3D-AZ91 and AZ31 specimens

2.2 表面元素組成

EDX 分析3D-AZ91 和AZ31 兩組試件的表面元素組成見表1。降解前，3D-AZ91 和AZ31表面存在Mg、O、C、Al等元素，均以Mg元素為主，但占比略有差異，3D-AZ91 的Mg 元素含量為65.4%，略低于AZ31 的75.3%。此外，AZ31 還含有微量的Zn、Mn等元素。

表1 3D-AZ91和AZ31試件的表面元素組成Table 1 Surface elemental composition of 3D-AZ91 and AZ31 specimens（%）

2.3 晶相分析

3D-AZ91 和AZ31 兩組試件的XRD 分析結(jié)果如圖3 所示。3D-AZ91 和AZ31 的晶相結(jié)構(gòu)均以α-Mg基體為主，3D-AZ91 中存在少量Al86Fe14，而AZ31 中存在較多的Al12Mg17和少量Al86Fe14。

圖3 3D-AZ91和AZ31試件的晶相分析（XRD）Figure 3 Crystal phase analysis of 3D-AZ91 and AZ31 specimens（XRD）

2.4 維氏硬度

3D-AZ91 和AZ31 兩組試件的維氏硬度測試結(jié)果如圖4 所示，3D-AZ91 的硬度值顯著高于AZ31（P＜0.05），這與本研究中金相顯微鏡的觀察結(jié)果相符，即3D-AZ91具有更細(xì)小的晶粒組織。根據(jù)Hall-Petch公式，材料的硬度值與其晶粒尺寸的平方根呈反比，晶粒尺寸越小，硬度值越大，晶粒細(xì)化能夠顯著提高材料的硬度［14］。

圖4 3D-AZ91和AZ31試件的維氏硬度值Figure 4 Vicker’s hardness values of 3D-AZ91 and AZ31 specimens

2.5 體外降解性能

3D-AZ91 和AZ31 兩組試件分別浸泡于模擬體液后，均出現(xiàn)析氫現(xiàn)象，產(chǎn)生大量細(xì)密的氣泡（圖5）。3D-AZ91表面由銀白色變?yōu)榛液谏?，而AZ31表面未見明顯顏色變化。兩者的模擬體液中均出現(xiàn)灰黑色降解產(chǎn)物，并附著于試件表面。PLA-3DAZ91試件浸泡于模擬體液后，因其表面覆蓋的PLA膜層，未見明顯析氫反應(yīng)（圖5）。3組試件浸泡后的失重率大小依次為：3D-AZ91＞AZ31＞PLA-3D-AZ91（P＜0.05，圖5）。由析氫反應(yīng)程度和失重率可知，3D-AZ91 的降解速率最快，其次為AZ31，PLA-3DAZ91的降解速率最慢。

圖5 3D-AZ91、AZ31、PLA-3D-AZ91試件的析氫現(xiàn)象和失重率Figure 5 Hydrogen evolution and weight loss ratio of 3D-AZ91，AZ31，PLA-3D-AZ91 specimens

2.6 降解后表面微形貌和產(chǎn)物元素分析

采用掃描電鏡觀察體外降解實(shí)驗(yàn)后的試件表面可見，3D-AZ91 和AZ31 表面覆蓋了一層降解產(chǎn)物，為不規(guī)則團(tuán)狀結(jié)構(gòu)（圖6）。采用EDX 進(jìn)行元素組成分析可知，兩組試件表面的降解產(chǎn)物均以Mg元素為主，并含有O、C、Al、P、S等元素（表1）。與降解前試件的表面元素組成進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，兩組試件表面降解產(chǎn)物中O元素含量均上升至50%左右，故推測降解產(chǎn)物可能為碳酸鎂、氧化鎂、氫氧化鎂等。

圖6 3D-AZ91和AZ31試件降解后的表面微形貌Figure 6 Surface micromorphology of AZ91 and AZ31 specimens after degradation

3 討論

對于臨床上較為棘手的種植位點(diǎn)大范圍骨缺損，可應(yīng)用軟件預(yù)先設(shè)計(jì)出匹配骨缺損腔的個(gè)性化支架模型，再通過三維打印技術(shù)制備所需的可降解鎂合金支架，實(shí)現(xiàn)數(shù)字化技術(shù)與先進(jìn)金屬材料的結(jié)合。從外觀上看，3D打印鎂合金支架與傳統(tǒng)鑄造鎂合金的顏色和重量并無明顯差別，但是二者的制作工藝、顯微結(jié)構(gòu)和性能卻有所不同。

由于3D-AZ91 在加工過程中快速冷卻，其在金相結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出較AZ31更為細(xì)小的晶粒組織，稱為晶粒細(xì)化現(xiàn)象。而晶粒越細(xì)，材料的硬度越高［14］。本研究中的維氏硬度測量結(jié)果也印證了這一點(diǎn)，晶粒細(xì)化大大提高了鎂合金的硬度，3D-AZ91 的維氏硬度值幾乎是AZ31的2倍。由凝固理論可知，越高的溫度梯度與越快的冷卻速率可以使材料具有更高的形核率，從而產(chǎn)生更細(xì)小的顯微組織結(jié)構(gòu)，且隨著三維打印激光密度的增加，鎂合金的晶粒會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榈容S晶。在增材制造過程中，晶體的生長方向受傳熱控制，熔池向散熱的相反方向擇優(yōu)生長形成局部有序的棒狀晶粒。上述特性使三維打印鎂合金支架在力學(xué)性能上比傳統(tǒng)鑄造鎂合金更具優(yōu)勢，表現(xiàn)為三維打印鎂合金的硬度更高，而硬度越高，材料抵抗局部變形，尤其是抵抗壓痕、劃痕和塑性形變的能力越強(qiáng)。激光增材制造鎂合金支架在工藝參數(shù)、孔隙結(jié)構(gòu)上仍有廣闊的研究空間。

3D-AZ91 和AZ31 的表面元素組成略有差別。盡管二者均以鎂元素為主，但AZ31 的Mg 元素含量更高一些，并含有微量的Zn、Mn等元素。有研究證實(shí)，在鎂合金中添加微量元素可有效改善鎂合金的性能。例如，添加Zr元素的鎂合金抗拉強(qiáng)度得以提升，添加Nd元素的鎂合金能提高其耐蝕性［15］。這提示在對三維打印鎂合金支架性能的進(jìn)一步探索中可對其元素組成加以調(diào)整，改進(jìn)其在體內(nèi)的抗腐蝕能力。XRD分析顯示，3D-AZ91和AZ31的晶相均以α-Mg 基體為主，AZ31中還存在較多Al12Mg17和少量Al86Fe14，表明Al和Mg、Al和Fe在鑄造過程中發(fā)生反應(yīng)，形成了化合物。

作為一種醫(yī)用金屬材料，鎂合金降解后會(huì)影響局部微環(huán)境，包括pH值變化和鎂離子濃度改變，發(fā)揮促進(jìn)成骨的作用［16］。鎂合金的降解溶液呈堿性，而pH值維持在8.0～8.5范圍有利于成骨細(xì)胞的增殖和分化［17］。Witte 等［18］研究了4 種鎂合金的體內(nèi)腐蝕行為，發(fā)現(xiàn)所有鎂合金的腐蝕層均有生物磷酸鈣的累積，這些產(chǎn)物有助于新骨生成。本研究通過體外降解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3D-AZ91 浸泡于模擬體液后迅速變色并產(chǎn)生細(xì)密的氣泡，AZ31產(chǎn)生氣泡的速度則慢一些，這些氣體是鎂與水發(fā)生置換反應(yīng)析出的氫氣。而在3D-AZ91表面包裹PLA 膜之后，膜層隔絕了鎂合金與水的接觸，故未出現(xiàn)明顯的析氫反應(yīng)。降解后鎂合金的表面微形貌觀察顯示，無論是三維打印鎂合金還是傳統(tǒng)鑄造鎂合金，產(chǎn)生的降解產(chǎn)物中一部分會(huì)黏附在材料表面，另一部分會(huì)進(jìn)入周圍環(huán)境中。本研究中，鎂合金降解產(chǎn)物不僅含有Mg、O、C等主要元素，還有少量P、Zn、Ca等元素。鋅離子能促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附、增殖以及成骨功能基因表達(dá)［19］，鈣離子則有助于促進(jìn)鈣鹽沉積和成骨［20-21］。將來，在三維打印鎂合金支架中進(jìn)一步添加Zn、Ca等元素，會(huì)有利于骨量不足部位的骨再生。目前，對于醫(yī)用鎂合金，常見合金體系包括Mg-Zn系、Mg-Ca系、Mg-Si系、Mg-Re系，不同合金體系鎂合金的性能特點(diǎn)不一。由此可見，適當(dāng)改變鎂合金的元素組成，可以在諸多方面提升其性能，更好地滿足作為人體植入物的需求［21］。

醫(yī)用鎂合金材料植入人體后，不僅面臨復(fù)雜的體液環(huán)境，而且作為支撐固定材料，會(huì)受到不同程度生理應(yīng)力的影響。Gu 等［22］通過AZ91 和WE43 兩種醫(yī)用鎂合金的降解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鎂合金受應(yīng)力時(shí)的腐蝕速率明顯高于不受力情況。而為了控制鎂合金的降解速率，通常有兩種處理方法：合金化和表面改性［23］。合金化是指改變合金的化學(xué)成分、相組成和微觀結(jié)構(gòu)，從而提高其耐蝕性能；表面改性是指對鎂合金進(jìn)行表面處理或者在其表面涂覆涂層，保護(hù)鎂合金基體，延緩降解液對材料的侵蝕。在該方面研究中，表面改性較為多見，其中，羥基磷灰石涂層和微弧氧化是兩種能有效延緩鎂合金降解速率的表面處理技術(shù)。羥基磷灰石的化學(xué)成分與人體骨骼中的無機(jī)鹽相似，具有良好的生物活性和生物相容性［24］。微弧氧化能制備具有較高的耐蝕性和耐磨性的涂層，而且可以調(diào)控涂層的物相組成［25］。與以往報(bào)道不同，本研究選擇PLA來調(diào)控三維打印鎂合金的降解速率。PLA 作為一種高分子材料，具有良好的生物相容性，在人體內(nèi)經(jīng)過酶的分解后轉(zhuǎn)變?yōu)槎趸己退懦鲶w外［26］，無需二次手術(shù)取出，但力學(xué)性能較差，故將PLA 包裹在三維打印鎂合金表面能更好地發(fā)揮優(yōu)勢。近年來，生物可降解聚合物PLA在醫(yī)學(xué)，尤其是骨科、心內(nèi)科等領(lǐng)域，有著越來越廣泛的應(yīng)用。有研究表明，PLA 與鎂合金的復(fù)合材料不僅能緩解鎂合金降解過快的問題，并且酸性的PLA 降解產(chǎn)物能中和堿性的鎂合金降解產(chǎn)物［27］。本研究結(jié)果也證實(shí)，PLA 膜層顯著降低了三維打印鎂合金支架的降解速率。與之相比，其余兩組無PLA 膜層的鎂合金試件與Hank’s 模擬體液接觸后很快發(fā)生析氫反應(yīng)和降解，該現(xiàn)象不利于成骨細(xì)胞在鎂合金體內(nèi)植入物上的黏附，影響骨愈合過程。因此，PLA 膜層包裹對醫(yī)學(xué)鎂合金的臨床應(yīng)用至關(guān)重要。PLA-鎂合金復(fù)合材料的性能與二者之間的結(jié)合處理工藝密切相關(guān)［27］。本研究采用了提拉浸漬法在三維打印鎂合金表面制備PLA 膜層。此外，有研究報(bào)道了一種熱壓結(jié)合熱拉拔技術(shù)，該工藝可顯著提高復(fù)合材料中PLA 的結(jié)晶度，改善熱壓制備復(fù)合材料的力學(xué)性能［28］。

綜上所述，本研究以AZ91 鎂合金粉為材料，通過激光增材制造技術(shù)，制備了新型三維打印鎂合金支架。與傳統(tǒng)鑄造鎂合金相比，三維打印鎂合金在力學(xué)性能方面更有優(yōu)勢，并且三維打印技術(shù)賦予了鎂合金多變的形態(tài)，能適應(yīng)復(fù)雜的臨床需求。雖然該新型支架在降解速度方面仍然存在不足，但本研究初步探索了PLA 膜層有效緩解其降解速率的作用，為后續(xù)的進(jìn)一步研究提供了方向。