朱亞文，陳 忠

1上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院心內(nèi)科，上海 201306

糖尿病性心肌病是一種獨立于冠心病和高血壓的心肌功能障礙，是糖尿病患者心力衰竭的主要原因之一［1］。心肌纖維化是糖尿病性心肌病的主要病理改變，會導(dǎo)致心功能不全，最終發(fā)展為心力衰竭甚至猝死［2-3］。糖尿病心肌病的發(fā)展與自噬、氧化應(yīng)激、炎癥、心肌纖維化和心肌凋亡等多種分子機制有關(guān)［4-6］。然而，糖尿病性心肌病確切的分子機制仍有待闡明。

自噬是一種高度保守的分解代謝過程，在維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用［7］。自噬也積極參與各種心臟疾病，包括糖尿病心肌?。?］。AMPK是生物能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，也是經(jīng)典的自噬上游調(diào)節(jié)因子，AMPK 的激活導(dǎo)致自噬上調(diào)［9］。相關(guān)研究表明，AMPK 對心臟的生存和功能至關(guān)重要，激活A(yù)MPK 介導(dǎo)的自噬可以減輕糖尿病心肌病［10-11］。

梔子苷是一種典型的環(huán)烯醚萜苷類化合物，具有多種傳統(tǒng)植物藥的生物學(xué)效應(yīng)［12］。在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化模型中，梔子苷可以改善模型小鼠的心肌纖維化和功能障礙［13］。梔子苷作為胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）受體激動劑，通過激活A(yù)MPK對多種心臟疾病都具有保護作用［14-16］。本研究通過建立1型糖尿病小鼠模型，擬驗證梔子苷對1 型糖尿病小鼠心肌損傷的保護作用，并進一步探討梔子苷是否通過激活A(yù)MPK 介導(dǎo)的自噬改善糖尿病心肌病心肌損傷，為臨床治療糖尿病心肌病提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

32 只體重20～25 g 的C57BL/6J 雄性小鼠（上海南方模式生物科技股份有限公司），動物實驗符合3R原則（倫理批文編號：2020-0328）。梔子苷（上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號：200403）；鏈脲佐菌素、戊巴比妥鈉、AMPK 抑制劑Compound C（Sigma 公司，美國）；Masson 染色試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司）；蘇木精-伊紅（HE）染色液（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）；BCA蛋白定量試劑盒、抗α-tublin 抗體（上海碧云天生物科技有限公司）；CCK-8 試劑盒（同仁公司，日本）；抗Beclin1、BCL2、BAX、Cleaved-caspase 3、Caspase3、p-AMPK、AMPK抗體（CST公司，美國）；抗P62、LC3B抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；抗Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、mTOR、p-mTOR 抗體（Abcam 公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 動物實驗分組及模型制備

32只雄性C57BL/6J小鼠隨機分為4組：對照組（Con組）、1型糖尿病模型組（STZ組）、25 mg/kg梔子苷給藥組（GE25 組）、50 mg/kg 梔子苷給藥組（GE50組），每組8 只。STZ組及梔子苷給藥組小鼠腹腔注射STZ［60 mg（kg·d）］連續(xù)6 d，制備1型糖尿病小鼠模型。正常飼養(yǎng)1周后，用血糖儀檢測空腹血糖，血糖值≥16.7 mmol/L即認(rèn)為建模成功。對照組小鼠腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。模型成功后，梔子苷給藥組連續(xù)灌胃給藥4 周，對照組和STZ 組灌胃等量生理鹽水。

1.2.2 HE和Masson染色

小鼠麻醉后，取出小鼠心臟沖洗后浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定過夜。取固定好的心臟組織石蠟包埋和切片。HE 染色：切片經(jīng)烤片，脫蠟水化，蘇木精染色5 min，伊紅染色10 min，自來水沖洗，脫水透明，中性樹脂封片。Masson 染色：根據(jù)Masson試劑盒說明書進行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理學(xué)的變化。用Image J 軟件測定膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fration，CVF）。

1.2.3 免疫組化分析

將石蠟包埋組織脫蠟，抗原修復(fù)，封閉液封閉30 min 后，分別與一抗Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、P62和LC3B 抗體在4 ℃孵育過夜。PBS 洗滌后，將切片與二抗在37 ℃孵育1 h，DAB 染色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察拍攝圖像。

1.2.4 H9C2細胞培養(yǎng)與處理

將H9C2 大鼠心肌細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素混合液的DMEM完全培養(yǎng)基中，并置于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中。將細胞分為5組，正常對照（NC）組：細胞在含5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)54 h；高糖（HG）組：細胞在含有33 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h；高糖+梔子苷（NC+GE）組：在NC 組的基礎(chǔ)上以100 μmol/L 的梔子苷處理54 h；HG+GE 組：以100 μmol/L 的梔子苷預(yù)處理6 h，在含有33 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)48 h；高糖+梔子苷+AMPK 抑制劑化合物C（HG+GE+CC）組：以100 μmol/L 的梔子苷預(yù)處理6 h，10 μmol/L 的化合物C 預(yù)處理30 min，在含有33 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)48 h。

1.2.5 CCK-8檢測細胞活力

待細胞長至80%左右，胰酶消化，細胞懸液以5×104個/mL的密度接種于6孔板中。為確定梔子苷對H9C2細胞活力的作用，以不同濃度的梔子苷（0、20、40、80、100、200 μmol/L）對H9C2 細胞干預(yù)處理54 h；為確定高糖對H9C2 細胞活力的抑制作用，以不同濃度的葡萄糖（12.5、25.0、33.0、44.0 mmol/L）對H9C2細胞干預(yù)處理48 h；為確定梔子苷可以改善高糖對H9C2細胞活力的抑制作用，以不同濃度梔子苷（0、20、40、80、100、200 μmol/L）+高糖（33 mmol/L）對H9C2 細胞干預(yù)處理。按上述分組處理后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀檢測其在490 nm處的吸光度值，再換算成細胞存活率進行比較。

1.2.6 Western blot 檢測

將心臟組織或H9C2 細胞用RIPA 裂解液處理后提取細胞蛋白。BCA蛋白定量后，用12%和6%的聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）進行電泳，轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上。5%的脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，4 ℃下與指定的一抗（抗LC3B、P62、Beclin1、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、BAX、BCL2、Caspase3 和Cleaved caspase3 抗體）孵育過夜，TBST 洗滌后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，用增強型化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑檢測蛋白質(zhì)條帶。α-tublin 作為內(nèi)參蛋白，用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

每組實驗均為3次以上獨立實驗。采用Graphpad Prism 7 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 梔子苷對1型糖尿病小鼠血糖和體重的影響

與對照組相比，STZ 組血糖水平顯著升高［（17.21±1.49）mmol/Lvs.（4.94±0.38）mmol/L，P＜0.001，圖1A］；與STZ組相比，GE50組能顯著降低小鼠血糖［（15.13±0.84）mmol/Lvs.（17.21±1.49）mmol/L，P＜0.01，圖1A］，但GE50組血糖水平仍明顯高于對照組（P＜0.001）。此外，與對照組相比，STZ組小鼠體重水平顯著降低［（18.09±1.25）gvs.（24.01±1.00）g，P＜0.001.圖1B］；與STZ 組相比，GE25 組、GE50組小鼠體重明顯增加（P＜0.01，圖1B），但仍明顯低于對照組（P＜0.001）。

圖1 梔子苷對1型糖尿病小鼠血糖和體重的影響Figure 1 The effect of geniposide on blood glucose and body weight in type 1 diabetic mice

2.2 梔子苷能夠抑制1型糖尿病小鼠的心肌纖維化

HE染色結(jié)果表明，STZ組小鼠表現(xiàn)出明顯的心肌結(jié)構(gòu)異常，包括心肌纖維斷裂，細胞結(jié)構(gòu)紊亂，細胞間隙增大。與STZ 組相比，GE25 組和GE50 組可以改善糖尿病引起心肌結(jié)構(gòu)損傷（圖2A）。Masson染色結(jié)果表明，STZ 組小鼠心肌間質(zhì)膠原沉積增加（P＜0.01）。與STZ組相比，GE25組和GE50組可以明顯減少膠原沉積（P＜0.01，圖2B、E）。免疫組化染色表明，與對照組相比，STZ組小鼠Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表達量增多。GE25 組和GE50 組Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表達量有所降低（圖2C、D）。

圖2 梔子苷對1型糖尿病小鼠心肌纖維化的影響（×400）Figure 2 The effect of geniposide on myocardial fibrosis of type 1 diabetic mice（×400）

2.3 梔子苷對凋亡相關(guān)蛋白BAX、BCL2、Cleavedcaspase 3和Caspase 3表達水平的影響

與對照組相比，STZ 組BAX/BCL2 和Cleavedcaspase 3/Caspase 3 蛋白表達水平顯著升高（8.90±1.75vs.0.45±0.03，P＜0.01；3.13±0.68vs.0.69±0.38，P＜0.05；圖3）。與STZ 組相比，GE25 組、GE50 組BAX/BCL2 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01，圖3B），Cleaved-caspase 3/Caspase 3蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05，圖3C）。

圖3 梔子苷對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響Figure 3 The effect of geniposide on the expression of apoptosis-related proteins

2.4 梔子苷對自噬相關(guān)蛋白LC3B、P62 和Beclin1表達水平的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與對照組相比，STZ 組Beclin1蛋白表達水平和LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達水平明顯降低（0.45±0.13vs.1.76±0.07，P＜0.01；0.38±0.06vs.1.24±0.21，P＜0.001，圖4），P62 水平升高（P＜0.01，圖4）。與STZ 組相比，GE50 組Beclin1 蛋白表達水平升高（P＜0.01），GE25 組和GE50 組LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達水平升高（P＜0.01，P＜0.05），而P62蛋白的表達量明顯降低（P＜0.01，圖4）。免疫組化結(jié)果顯示，LC3B 蛋白表達量在STZ 組降低，梔子苷給藥后升高，而P62蛋白的表達趨勢相反（圖4A）。

圖4 梔子苷對自噬相關(guān)蛋白表達的影響Figure 4 The effect of geniposide on the expression of autophagy-related proteins

2.5 梔子苷對AMPK/mTOR 信號通路關(guān)鍵蛋白的影響

用Western blot 方法檢測p-AMPK、AMPK、pmTOR 和mTOR 蛋白的表達水平。與對照組相比，STZ 組小鼠的p-AMPK/AMPK 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），而p-mTOR/mTOR 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）。與STZ 組相比，GE25 組、GE50 組小鼠的p-AMPK/AMPK 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），而p-mTOR/mTOR 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01，圖5）。

圖5 梔子苷對p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR蛋白表達水平的影響Figure 5 The effect of geniposide on the expression of p-AMPK，AMPK，p-mTOR and mTOR

2.6 不同濃度梔子苷及葡萄糖對H9C2細胞活力的影響

不同濃度的葡萄糖處理H9C2 心肌細胞，與正常組相比，33 mmol/L和44 mmol/L葡萄糖處理組的細胞活力顯著降低（P＜0.001，圖6A）。本研究中，選擇高葡萄糖（33 mmol/L）模擬體內(nèi)高血糖環(huán)境。單獨用不同濃度梔子苷處理H9C2 細胞54 h 后，細胞活力未受到明顯影響（圖6B）。用不同濃度的梔子苷預(yù)處理6 h，之后與高葡萄糖（33 mmol/L）共同孵育48 h。與高葡萄糖（33 mmol/L）處理的細胞相比，100 μmol/L與200 μmol/L的梔子苷預(yù)處理的細胞活力均明顯增加（P＜0.05，圖6C），100 μmol/L的梔子苷預(yù)處理的細胞活力略高于200 μmol/L的梔子苷預(yù)處理的細胞活力，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），本實驗選用100 μmol/L梔子苷用于后續(xù)實驗研究。

圖6 不同濃度梔子苷及葡萄糖對H9C2細胞活力的影響Figure 6 The effects of HG and GE on the cell viability of H9C2 cells

2.7 梔子苷能夠激活H9C2細胞中AMPK介導(dǎo)的自噬

進一步研究梔子苷減輕糖尿病小鼠心肌自噬的機制。Western blot 結(jié)果顯示，與NC 組相比，HG組p-AMPK/AMPK 比值明顯降低（P＜0.01），LC3BⅡ/Ⅰ比值明顯降低（P＜0.05），Beclin1 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），而P62 水平升高（P＜0.001）。與HG 組相比，HG+GE 組p-AMPK/AMPK、LC3BⅡ/Ⅰ、Beclin1表達明顯升高（P＜0.05），而P62水平降低（P＜0.001）。AMPK 抑制劑Compound C逆轉(zhuǎn)了梔子苷的作用，HG+GE+CC 組p-AMPK/AMPK、LC3B Ⅱ/Ⅰ和Beclin1 表達水平明顯降低（P＜0.05），P62表達水平明顯升高（P＜0.05，圖7）。

圖7 梔子苷能夠激活H9C2細胞中AMPK介導(dǎo)的自噬Figure 7 Geniposide can activate AMPK-mediated autophagy in H9C2 cells

3 討論

本研究利用1 型糖尿病小鼠模型，觀察到梔子苷通過減輕心肌纖維化及減輕心肌結(jié)構(gòu)異常從而減輕糖尿病所致的心肌損傷。本研究還顯示，梔子苷治療激活心肌自噬至少部分是通過AMPK信號通路實現(xiàn)的。心肌纖維化是糖尿病心肌病的主要病理改變［17］。在本研究中，HE 染色顯示，STZ 組小鼠表現(xiàn)出明顯的心肌結(jié)構(gòu)異常，包括心肌纖維斷裂，細胞結(jié)構(gòu)紊亂等，GE25 組和GE50 組可以改善糖尿病引起心肌結(jié)構(gòu)損傷。Masson染色顯示STZ組小鼠觀察到明顯的膠原沉積增加，GE25 組和GE50 組可以明顯減少膠原沉積。免疫組化證實GE25 組和GE50 組Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的沉積減少。由此可見，梔子苷干預(yù)后可以減輕1 型糖尿病小鼠心肌纖維化，減輕心肌損傷。

在心臟中，自噬不僅是維持心臟結(jié)構(gòu)和功能的一種穩(wěn)態(tài)機制，而且對維持心肌細胞的完整性也非常重要。高糖環(huán)境下，自噬水平的下調(diào)會破壞心肌細胞的生理穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致大量受損和老化的線粒體積聚，最終導(dǎo)致心肌纖維化［18］。研究表明，LC3B、P62、Beclin1 可以用來衡量自噬的程度［19-22］。在本研究中，與STZ 組相比，GE25 組和GE50 組可以上調(diào)LC3BⅡ/Ⅰ和Beclin1 的蛋白表達水平，下調(diào)P62 蛋白的表達水平，表明梔子苷改善1 型糖尿病小鼠心肌損傷可能與促進心肌自噬有關(guān)。

本課題組之前的研究表明，通過活化AMPK 途徑可以增加心肌自噬進而保護心肌細胞［23］。作為自噬進程的關(guān)鍵啟動者，AMPK對心臟的生存和功能至關(guān)重要。AMPK 活化后可以負(fù)向調(diào)控mTOR［24］。通過調(diào)控AMPK/mTOR 信號通路促進自噬，改善糖尿病大鼠的心肌纖維化［6］。本研究中，GE25 組和GE50 組p-AMPK/AMPK 的蛋白表達水平升高，pmTOR/mTOR 的蛋白表達水平降低，表明梔子苷可能通過AMPK/mTOR信號通路調(diào)控自噬進而改善糖尿病心肌損傷。為進一步探討梔子苷對AMPK的激活作用及AMPK 對自噬的直接抑制作用，本研究在細胞實驗中使用了AMPK 抑制劑Compound C。研究結(jié)果表明，與HG組相比，梔子苷預(yù)處理后，AMPK被激活，同時上調(diào)自噬，而使用AMPK 抑制劑處理后，可以阻斷AMPK 激活，LC3B、Beclin1 的表達降低，P62 表達升高，同時阻斷對自噬的激活作用，表明梔子苷可能通過激活A(yù)MPK介導(dǎo)的自噬減輕1型糖尿病小鼠的心肌損傷。王振等［25］研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)控AMPK/mTOR通路能夠抑制大鼠髓核細胞的凋亡。Sun等［26］研究也表明通過激活A(yù)MPK 可以抑制心肌細胞凋亡。梔子苷調(diào)控AMPK與心肌細胞凋亡的確切關(guān)系值得進一步研究。

凋亡信號的刺激致使BAX/BCL2 表達比例升高，造成線粒體膜電位下降，進而啟動細胞的凋亡執(zhí)行通路，激活Caspase3 級聯(lián)通路，導(dǎo)致細胞凋亡的 發(fā) 生［27］。本 研 究 顯 示STZ 組BAX/BCL2 和Cleaved caspase3/Caspase3 比值明顯升高，表明在1 型糖尿病小鼠中凋亡增強，而梔子苷處理后減輕了細胞凋亡程度，張偉萍等［28］研究顯示梔子苷預(yù)處理可以減輕2 型糖尿病心肌病大鼠的心肌細胞凋亡，提示梔子苷可能通過抑制心肌細胞凋亡改善1型和2型糖尿病心肌損傷。

綜上所述，本研究提示梔子苷能改善1 型糖尿病心肌病的心肌損傷，減輕心肌纖維化，其機制可能與激活A(yù)MPK介導(dǎo)的自噬有關(guān)。本研究還對梔子苷的心肌保護作用與細胞凋亡的相關(guān)性進行了初步探索。但本研究仍然存在一些不足，如未探討梔子苷的最佳劑量和治療時間等。梔子苷改善糖尿病心肌病的確切分子機制和特異性靶點還有待進一步研究。