馬 佩，方 圓，查全斌，束永前，田聲望*

1江蘇大學附屬金壇醫(yī)院腫瘤科，江蘇 常州 213200；2南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，江蘇 南京 210029

胃癌是當前嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一。2018 年全球胃癌新發(fā)病例1 810 萬，居惡性腫瘤第5 位；新發(fā)死亡病例960 萬，居惡性腫瘤第3位。東亞地區(qū)是全世界胃癌發(fā)病率最高的地區(qū)，遠遠超過第2 位。而我國作為東亞地區(qū)最大的國家，胃癌防控形勢嚴峻。據(jù)《中國腫瘤登記年報2018》報道，2014 年全國胃癌發(fā)病率為19.8/10 萬，居惡性腫瘤第2 位；死亡率為13.5/10 萬，居惡性腫瘤第3位。國家癌癥中心預測2020 年我國胃癌發(fā)病率將高達24.3/10萬［1］。

近年來，隨著分子生物學、消化內鏡和醫(yī)學影像、醫(yī)學病理等技術的發(fā)展和健康意識的提升，早期胃癌的診斷和治療有了很大的改善，但是，靶向藥物、免疫檢查點抑制劑等新型藥物的臨床應用并未明顯改善進展期胃癌的總體預后，進展期胃癌的診治仍是一個難點。侵襲和轉移是導致晚期胃癌患者死亡的主要原因［2］。因此，研究胃癌的發(fā)生及侵襲、轉移機制有助于胃癌的早期診斷、靶向治療及改善預后，從而提高患者生存率。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長度超過200 bp 的非編碼RNA。近來研究發(fā)現(xiàn)它們能通過調控基因轉錄、RNA的剪接等方式參與腫瘤等多種重大疾病進展［3-7］。LINC01197 是被發(fā)現(xiàn)的lncRNA 之一，其位于15q26.2，長度為1 445 個堿基。研究發(fā)現(xiàn)，LINC01197與胰腺癌進展相關，其低表達提示胰腺癌患者預后差，并且LINC01197 的低表達可通過Wnt/β-catenin 信號通路調控抑制胰腺癌細胞增殖［8-9］。那么，LINC001197 在胃癌等其他消化系統(tǒng)腫瘤中有什么作用？本研究通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)LINC01197 在胃癌組織中高表達，并通過敲低胃癌細胞中LINC01197 的表達，進一步探討LINC01197 對胃癌細胞增殖、侵襲與轉移能力的影響，并對可能的分子機制進行初步探究。

1 材料和方法

1.1 材料

BLAB/c 裸鼠購自北京維通利華。本研究經(jīng)江蘇大學附屬金壇醫(yī)院倫理委員會批準（編號2020001）。RPMI 1640細胞培養(yǎng)基、PBS、胰酶、青鏈霉素、胎牛血清（Gibco 公司，美國），二甲基亞砜、甲醇、吐溫-20、氯仿、異丙醇、無水乙醇（Sigma-Alrich公司，美國），Cell Counting Kit 8（CCK-8）細胞增殖檢測試劑盒、PMSF、BCA 蛋白定量試劑盒、結晶紫染液、DEPC水（上海Beyotime生物技術有限公司），ECL顯影液（蘇州新賽美生物科技有限公司），PAGE凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物科技有限公司），Lipofectamine 3000（Termo Fisher 公司，美國），LINC01197 干擾RNA（shLINC01197）及陰性對照（NC）序列由上海吉瑪公司合成。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析

GEPIA 數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，http：//gepia.cancer-pku.cn/）是一個研究人類各種類型腫瘤及正常組織RNA 測序數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫，其整合了TCGA（The Cancer Genome Atlas）和GTEx（The Genotype-Tissue Expression）等數(shù)據(jù)庫，可以對腫瘤的基因表達、病理類型、患者生存期等各方面進行高效、專業(yè)的分析［10］?；贕EPIA數(shù)據(jù)庫，我們選取408個胃癌組織樣本和211個正常胃部組織樣本，分析LINC01197在胃癌組織中的表達情況，同時，按照Kaplan-Meier Plotter（KM plotter）數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=gastric）中LINC00197的表達量中位數(shù)，將胃癌患者分為高表達組和低表達組，進行預后研究。

1.2.2 細胞培養(yǎng)

人胃癌細胞株SGC-7901、BGC-823、MGC-803、AGS及人胃黏膜上皮細胞GES-1均購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，傳代培養(yǎng)于低糖生長液RPMI1640中，生長于提供37 ℃和5%CO2環(huán)境的培養(yǎng)箱。取對數(shù)生長的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 RNA提取和實時熒光定量PCR（qPCR）

用TRIzol 提取RNA，使用Prime Script RT Master Mix 反轉錄試劑盒將RNA 逆轉成cDNA，并按照qPCR反應體系配制反應溶液，加入熒光定量用384孔板中，ABI 7900HT Real-Time PCR System 7900 高通量快速實時熒光定量PCR 儀收納384 板進行PCR。程序包括預變性和循環(huán)。收集并處理數(shù)據(jù)，結果用2-ΔΔCt法計算。qPCR引物見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

1.2.4 細胞轉染

取生長活躍的細胞2×105～4×105個接種至6 孔板中，生長24 h。按照Lipofectamine 3000 說明書進行轉染，6 h 后換液。干擾片段序列如下：陰性對照（NC）5′-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3′，干擾片段1（shLINC01197-1）5′-GGTCGTACTTCTCCATGTTCT-3′，干 擾 片 段2（shLINC01197-2）5′-GGACATAAAGTTCCTGGTTGA-3′。

1.2.5 細胞增殖實驗

取對數(shù)生長期細胞1×105個，制成單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL細胞懸液，分別置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～120 h 后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入提前配制的10% CCK-8 溶液100 μL，1～2 h 后于波長450 nm 測各孔吸光度值（每組設5 個平行孔，獨立重復3 次）。每日加CCK-8 和加液后測吸光度時間相同，重復5 d后繪制增殖曲線。

1.2.6 Transwell侵襲實驗

取出Transwell侵襲小室置于24孔板中，小室上層加入無血清RPMI1640 200 μL，下層加入有血清RPMI1640 600 μL。消化目的細胞后計數(shù)，取4×104個細胞滴入小室上層，置于培養(yǎng)箱孵育24 h，取出小室，4%多聚甲醛固定20 min，用棉簽擦去上層細胞，結晶紫染色15 min，蒸餾水輕輕沖洗，在顯微鏡下計數(shù)5 個高倍鏡視野下的穿膜細胞數(shù)，計算穿膜細胞平均值，評估細胞侵襲能力。

1.2.7 克隆形成實驗

取對數(shù)生長期1×105個細胞，制成單細胞懸液，每孔100 μL加入6孔板，3 d換1次液，培養(yǎng)10～14 d后，用結晶紫粉末和甲醛配成0.5%結晶紫染色液染色15～30 min，PBS沖洗后拍照。

1.2.8 裸鼠皮下成瘤實驗

于4周BALB/C裸鼠皮下分別注射BGC-823 NC和BGC-823 shLINC01197細胞，每只接種細胞5×106個，每3 d觀察腫瘤大小，2周后取出腫瘤并稱重、測量大小。包埋腫瘤并做免疫組化切片。

1.2.9 蛋白免疫印跡實驗

當胃癌細胞狀態(tài)良好時，吸取培養(yǎng)液，PBS漂洗2遍。加入細胞裂解液，低溫離心5 min，取上清，并進行蛋白定量。蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），濕轉法轉膜，并用5%脫脂奶粉溶液封閉后，分別孵育β-actin、SERPINA1 抗體過夜，次日用PBST 洗膜，常溫孵育二抗2 h，PBST 漂洗后用ECL法顯影并拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）描述，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組計量資料比較先采用單因素方差分析再以LSD檢驗進行兩兩比較，CCK-8實驗結果采用重復測量的方差分析，生存數(shù)據(jù)采用Kaplan-Meier 方法分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LINC01197 在胃癌組織中表達增高且與胃癌患者預后差相關

對GEPIA 數(shù)據(jù)庫中408 個胃癌組織樣本和211個正常胃部組織樣本的分析結果表明，LINC01197在胃癌組織中的表達量明顯增高（圖1A）。分析發(fā)現(xiàn)LINC01197低表達的患者總生存期（中位時間：低表達組75.5個月，高表達組40.0個月）、首次進展時間（中位時間：低表達組50.0 個月，高表達組24.3 個月）和進展后生存期（中位時間：低表達組13.8 個月，高表達組9.7 個月）均顯著長于高表達患者，且差異均具有統(tǒng)計學意義（圖1B～D）。選取21對胃癌和匹配的癌旁組織，通過qPCR實驗證實LINC01197在胃癌組織中的表達量明顯高于癌旁組織（圖1E）。最后，我們分析了LINC01197 在胃癌細胞內的表達水平，結果顯示LINC01197在人胃黏膜上皮細胞GES-1中的表達顯著低于人胃癌細胞株SGC-7901、BGC-823、MGC-803和AGS（圖1F）。

圖1 lncRNA LIN01197的表達與胃癌預后的關聯(lián)分析Figure 1 Analysis of the association between lncRNA LIN01197 and prognosis in gastric cancer

2.2 在體外和體內實驗中敲減LINC01197 能抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移

為了研究LINC01197 在胃癌細胞中的作用，我們在SGC-7901 和BGC-823 細胞系中通過短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）敲減了LINC01197的表達（圖2A）。相比較NC 組，shLINC01197 組胃癌細胞增殖減緩（圖2B）?？寺⌒纬蓪嶒灥慕Y果進一步證明了這一現(xiàn)象（圖2C）。與此同時，Transwell實驗的結果表明敲減LINC01197也抑制了胃癌細胞SGC-7901和BGC-823的侵襲及遷移能力（圖2D）。

圖2 體外敲減LINC01197抑制胃癌細胞增殖和侵襲、遷移Figure 2 Knockdown of LINC01197 inhibits cell proliferation，invasion and migration in vitro in gastric cancer cells

為了進一步驗證LINC01197 在胃癌中的功能，我們研究了LINC01197在動物體內腫瘤形成中的作用。敲減了LINC01197 后的BGC-823 shLINC01197細胞及陰性對照BGC-823 NC 細胞分別被注射到裸鼠皮下，定期測量腫瘤生長變化，2周后將皮下腫瘤取出測量并進行了Ki-67 免疫組化分析。結果顯示，相比較NC 組，shLINC01197 組胃癌細胞體內增殖速度減緩（圖3A、B），在皮下荷瘤15 d后最終成瘤的體積和重量也較小（圖3C）。免疫組化結果也顯示，實驗組Ki-67 的表達水平顯著下降（圖3D）。這些結果都證實了敲減LINC01197在體內和體外均可以抑制胃癌的發(fā)生和發(fā)展。

圖3 體內敲減LINC01197抑制胃癌細胞增殖Figure 3 Knockdown of LINC01197 inhibits cell proliferation in vivo in gastric cancer cells

2.3 LINC01197 在胃癌細胞中促進下游分子SERPINA1的表達

為了深入探索LINC01197促進胃癌發(fā)生發(fā)展的機制，首先我們對LINC01197 的亞細胞定位進行了檢測，發(fā)現(xiàn)LINC01197在SGC-7901和BGC-823兩株胃癌細胞中均主要分布于細胞核內（圖4A），提示其可能通過轉錄水平調控發(fā)揮功能。對敲減了LINC01197 后的BGC-823 shLINC01197 細胞及陰性對照BGC-823 NC細胞進行轉錄組高通量測序（highthroughout transcriptome sequencing of mRNA，mRNA-seq）以尋找差異表達基因。差異基因結果分析表明，在敲減LINC01197 后，5 個基因表達上調，95 個基因表達下調。qPCR 實驗驗證了在敲減LINC01197 后，SERPINA1、APOA2、IGF2 的表達水平明顯下降，其中SERPINA1 最為明顯（圖4B）。蛋白免疫印跡實驗也證明了在SGC-7901 和BGC-823兩個細胞系中，敲減LINC01197 后會降低SERPINA1 蛋白的表達（圖4C）。這些結果表明，LINC01197 有可能是通過影響SERPINA1 的表達水平，從而進一步影響胃癌的進展。

圖4 敲減LINC01197降低SERPINA1的表達Figure 4 Knockdown of LINC01197 decreased the expression of SERPINA1

2.4 LINC01197通過調節(jié)SERPINA1表達促進胃癌進展

為進一步探究LINC01197促進胃癌進展是否是通過調節(jié)SERPINA1 實現(xiàn)的，我們在已經(jīng)穩(wěn)定轉染shLINC01197 的SGC-7901 和BGC-823 兩株胃癌細胞株中再轉染SERPINA1 過表達質粒。相較于NC組和shLINC01197組，CCK-8實驗表明shLINC01197組胃癌細胞再過表達SERPINA1 可恢復胃癌細胞部分增殖能力（圖5A）。Transwell 實驗也表明穩(wěn)轉shLINC01197 的胃癌細胞再過表達SERPINA1 可恢復部分胃癌細胞侵襲遷移能力（圖5B）。上述結果表明，LINC01197 促進胃癌細胞增殖和侵襲轉移的實現(xiàn)部分是通過調節(jié)SERPINA1表達而實現(xiàn)的。

圖5 LIN01197通過調節(jié)SERPINA1表達促進胃癌細胞增殖和侵襲遷移Figure 5 LINC01197 promotes cell proliferation and invasion via regulating SERPINA1 expression

3 討論

越來越多的實驗表明，lncRNA在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮了很多作用，然而造成它們在腫瘤細胞中異常表達的靶標和通路機制還未完全闡明［11-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，LINC01197在胃癌細胞中呈高表達，且與胃癌的不良預后正相關。體外和體內實驗均證實，敲減LINC01197 基因后，胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移均會受到抑制，這說明LINC01197 能促進胃癌的發(fā)生發(fā)展。然而，Ling［8］和Jia［9］的研究證實了LINC01197 在胰腺癌細胞和組織中呈低表達，會抑制胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。這些實驗結果提示了LINC01197在特定種類的腫瘤細胞中可以發(fā)揮不同的功能。本研究首次明確了LINC01197在胃癌中的作用，其腫瘤異質性還有待進一步研究。

絲氨酸蛋白酶抑制劑（SERPINS）屬于蛋白酶抑制劑家族，可被分類為位于細胞外的SERPINA和位于細胞內的SERPINB［15］。SERPINA1也被稱為1-蛋白酶抑制劑或1-抗胰蛋白酶（AAT）。SERPINA1 主要在肝臟合成，也在某些細胞，如胃癌、結腸癌以及肺癌細胞［16］中產(chǎn)生。腫瘤細胞不僅能合成和釋放原生形式的SERPINA1，也能生成各種裂解或降解形式的SERPINA1［17］。這些蛋白酶抑制劑在生理和病理過程均能起重要作用，如血管生成、血管內纖維蛋白溶解、傷口愈合和腫瘤侵襲和轉移等［18］。據(jù)報道，SERPINA1的表達在肺癌、結腸癌和鱗狀細胞癌中與腫瘤轉移和預后不良相關［16］。SERPINA1在胃癌中也被發(fā)現(xiàn)表達增高，以及與高分化腺癌預后差密切相關［19］。然而，SERPINA1 在胃癌進展和轉移中的作用機制仍然未知，與胃癌各種臨床特征之間的相關性也沒有清晰闡明。本研究證實了長非編碼RNA LINC01197 可能通過促進下游分子SERPINA1 的表達促進胃癌的發(fā)生發(fā)展。今后將通過實驗進一步研究和證實LINC01197調控SERPINA1表達的具體機制。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)lncRNA LINC01197在胃癌組織和細胞中表達增高，并與胃癌患者的預后不良相關。我們在胃癌細胞系中進行了體外實驗，并構建了裸鼠成瘤模型進行體內實驗，結果均證實LINC01197可以促進胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移，從而促進胃癌的發(fā)生發(fā)展。通過mRNA-seq 測序、后續(xù)的qPCR 和蛋白免疫印跡實驗，我們發(fā)現(xiàn)LINC01197 通過影響下游分子SERPINA1 的表達促進胃癌進展，提示了胃癌發(fā)生中可能存在新的信號機制。本實驗結果表明，LINC01197可能成為全新的胃癌診斷標志物，并且也將成為胃癌治療的新靶標。