吳 春，張小梅，向 陽，冉 茜，李忠俊*，張克斌

1陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心（輸血科）放射生物學實驗室，2臨床醫(yī)學研究中心，重慶 400037

隨著放射技術(shù)在軍事、醫(yī)藥和其他行業(yè)的大量應用，急性放射綜合征（acute radiation syndrome，ARS）的研究也越來越受到人們的重視。放射造成造血系統(tǒng)損傷，導致骨髓造血功能障礙，嚴重時可危及生命。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）作為骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分，其自身及其后代子細胞可為造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）提供物理支撐。此外，BM-MSCs也可通過分泌多種造血/細胞因子，對HSCs 的自我更新、分化及骨髓定植均發(fā)揮重要作用［1-3］。目前認為，相較于HSCs，BM-MSCs具有較強的放射抗性，其相關(guān)的放射抗性機制主要包括：DNA損傷的有效識別，雙鏈斷裂修復及細胞凋亡逃逸等，但目前其具體機制尚未被完全闡明［4］。鑒于BM-MSCs的存活可為放射損傷后造血重建提供基質(zhì)干細胞基礎(chǔ)，因此，深入研究其放射抗性機制，對探索骨髓型急性放射病救治的新策略具有重大意義。

生長分化因子15（growth differentiation factor 15，GDF15）是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）超家族中的一員，在各種細胞和組織中廣泛分布，伴隨著不同的應激反應，如炎癥、心臟缺血再灌注、急性組織損傷、放射、癌癥等，GDF15的表達會大幅增加［5-9］。既往研究表明，GDF15在部分癌細胞中高表達，并且在癌癥的不同進展階段具有促凋亡和抗凋亡兩種效應［10-12］。本課題組前期研究結(jié)果顯示，BM-MSCs 放射后，GDF15 的表達顯著升高［13］，其是否在BM-MSCs的放射抗性中發(fā)揮關(guān)鍵作用，目前尚不清楚。本研究考察了放射后上調(diào)的GDF15表達在BM-MSCs放射抗性中的作用，并初步探討了其可能作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人BM-MSCs、人BM-MSCs 培養(yǎng)基（ScienCell 公司，美國），人GDF15 干擾片段（廣州銳博生物科技有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒（大連寶生物工程有限公司），Western blot轉(zhuǎn)膜液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、封閉液、RIPA 細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠電泳配制試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒JC-1（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），PCR 引物（上海生工生物工程股份有限公司），PI staining 檢測試劑盒、Annexin V-PE/7AAD 凋亡檢測試劑盒（BD 公司，美國），CCK-8（同仁化工，日本），Lipofectamine 3000試劑（Invitrogen 公司，美國），GDF15、p-ERK1/2、ERK1/2 抗體（Abcam 公司，美國），Caspase3、Cleaved caspase3 抗體（CST 公司，美國），Bcl-2、Bax、β-actin抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

BM-MSCs使用專用BM-MSCs培養(yǎng)基培養(yǎng)，原代細胞復蘇于T-75 細胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，視為P1代細胞。細胞融合度達到85%～90%，1∶3傳代為P2代細胞。本研究使用P6～P10代細胞進行后續(xù)細胞實驗。

1.2.2 細胞分組及放射處理

實驗分為3組：空白對照組、干擾對照組和干擾GDF15組。采用Co-60 γ射線對細胞進行放射處理，處理劑量為9 Gy，劑量率為0.65 Gy/min［14］。

1.2.3 GDF15 siRNA干擾片段轉(zhuǎn)染BM-MSCs

取對數(shù)生長期的細胞，接種于6孔板中，融合度在70%。按Lipofectamine 3000 試劑說明書的比例配比各試劑，室溫孵育15 min，加入6 孔板中，24 h后收集細胞檢測mRNA 的表達，72 h 后收集細胞檢測蛋白的表達。GDF15干擾片段靶序列如下：干擾片段1：5′-CCATGGTGCTCATTCAAAA-3′；干擾片段2：5′-GACTCCAGATTCCGAGAGT-3′；干擾片段3：5′-CCAACTGCTGGCAGAATCT-3′。

1.2.4 蛋白免疫印跡分析（Western blot）檢測蛋白表達

收集細胞，PBS洗1次，加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白；冰上裂解30 min，10 000g4 ℃離心15 min，收上清；BCA 蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度測定，加入1/5體積蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min，使蛋白變性。根據(jù)目的蛋白分子量配制濃度為12%的SDS-PAGE凝膠，按照30 μg總蛋白上樣，100 V 電泳，200 mA 轉(zhuǎn)膜；5%BSA 室溫封閉1 h，一抗孵育4 ℃過夜，抗體使用濃度：GDF15抗體（1∶1 500）、p-ERK1/2、ERK1/2、Caspase3、Cleaved caspase3、Bcl-2、Bax、β-actin 抗體（1∶1 000），TBST 洗膜3 次，二抗室溫孵育2 h，洗膜3次，ECL顯影曝光并拍照，實驗重復3次。

1.2.5 RT-qPCR檢測mRNA水平

收集細胞，每管加入1 mL TRIzol試劑提取細胞總RNA，移液槍反復吹打直至無明顯沉淀，室溫裂解30 min；加入上述裂解液體積1/5 的氯仿，渦旋室溫靜置15 min，10 000g4 ℃離心15 min；取上層無色液體轉(zhuǎn)移至新的無酶EP管中，向上述無色液體中加入同等體積異丙醇，混勻室溫靜置10 min，10 000g4 ℃離心10 min，棄上清；加入800 μL 75%乙醇清洗沉淀，7 500g4 ℃離心10 min，棄上清，室溫干燥沉淀；加入20 μL DEPC 水，溶解RNA，測RNA 濃度。按照TaKaRa 的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作步驟反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進行RT-qPCR。引物序列：GDF15上游：5′-GACCCTCAGAGTTGCACTCC-3′，下游：5′-GCCTGGTTAGCAGGTCCTC-3′；β-actin 上游：5′-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3′，下游：5′-CTGGTGCCTGGGGCG-3′，每組3個復孔，實驗重復3次。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

取對數(shù)生長期細胞，1.5×105個/孔接種于6孔板中，接種24 h后轉(zhuǎn)染各組細胞；9 Gy放射處理，24 h后收集細胞，1 000 r/min 離心5 min，冰PBS 清洗3 次；根據(jù)凋亡檢測試劑操作說明書，按照每孔100 μL 結(jié)合液，5 μL Annexin V-PE 和5 μL 7-AAD 配制檢測液，分別加入各組細胞中，重懸混勻，室溫避光孵育15～30 min，流式細胞儀檢測，每組3個復孔，實驗重復3次。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞周期

取對數(shù)生長期細胞，接種于25 cm2細胞瓶中，細胞融合度達60%轉(zhuǎn)染各組細胞；9 Gy放射處理，24 h后收集細胞，1 000 r/min 離心5 min，PBS 清洗3 次，75%冰乙醇固定，4 ℃冰箱過夜；PBS 洗3 次，PI 染色，重懸混勻，室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測，每組3個復孔，實驗重復3次。

1.2.8 CCK-8檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期細胞，2 000 個/孔接種于96 孔板中，24 h 后轉(zhuǎn)染各組細胞，9 Gy 放射處理；72 h 后棄培養(yǎng)基，按照每孔100 μL培養(yǎng)基，10 μL CCK-8試劑配制檢測液，分別加入96 孔板中，37 ℃避光孵育2 h，酶標儀450 nm 檢測吸光度，每組5 個復孔，實驗重復3次。

1.2.9 免疫熒光染色

取對數(shù)生長期細胞2×104個/孔接種于激光共聚焦皿中，24 h 后轉(zhuǎn)染各組細胞，9 Gy 放射處理；分別收取未放射、放射后8 h和放射后24 h 3個時間點細胞；棄培養(yǎng)基，PBS洗1次，37 ℃4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗3次；0.2%Triton X-100破膜30 min，PBS 洗3 次：5% BSA 封閉1 h；GDF15 一抗（1∶200）4 ℃孵育過夜，PBS 洗3 次；二抗37 ℃避光孵育3 h，PBS 洗3 次；DAPI 染色10 min，室溫避光，PBS 洗3次；抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察拍照，實驗重復3次。

1.2.10 線粒體膜電位檢測

取對數(shù)生長期細胞，2×104個/孔接種于24 孔板中，24 h 后轉(zhuǎn)染各組細胞，9 Gy 放射處理；分別收取未放射、放射后8 h 細胞。陽性對照設置：陽性對照孔中加入碳酰氰基-對-氯苯腙（CCCP，使用濃度為10 μmol/L）處理細胞20 min。吸除培養(yǎng)基，PBS洗1 次，加入500 μL JC-1 染色工作液，細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min；吸除上清，PBS 洗2 次，加入1 mL 細胞培養(yǎng)液，熒光顯微鏡觀察拍照，實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示。同一測量值在不同的時間比較采用重復測量的方差分析；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，方差不齊數(shù)據(jù)采用Tamhane’s T2檢驗進行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 放射誘導BM-MSCs中GDF15表達上調(diào)

為明確放射后BM-MSCs中GDF15的表達情況，分別通過RT-qPCR、Western blot和免疫熒光檢測細胞經(jīng)放射處理后不同時間點GDF15 的mRNA 和蛋白表達水平。結(jié)果顯示，GDF15 的mRNA 和蛋白水平在放射后顯著升高（圖1A、B）。同時，免疫熒光的結(jié)果也證實，放射可誘導GDF15 的表達增加（圖1C）。綜上，在BM-MSCs 細胞經(jīng)放射誘導后GDF15的表達上調(diào)。

圖1 BM-MSCs經(jīng)放射后GDF15的表達情況Figure 1 The expression of GDF15 in BM-MSCs after irradiation

2.2 GDF15干擾效果驗證

為明確放射后高表達的GDF15 在BM-MSCs 放射抗性中的作用，我們采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA 片段干擾GDF15 的表達，并于細胞轉(zhuǎn)染24 h 后，進行mRNA 檢測。結(jié)果顯示，與干擾對照組相比，3個干擾片段均能有效降低GDF15 的mRNA 表達水平（P＜0.05，圖2A），其中干擾片段1 的mRNA 抑制效率達到75%；細胞轉(zhuǎn)染72 h后，進行蛋白檢測，結(jié)果顯示，與干擾對照組相比，3個干擾片段均能有效降低GDF15 蛋白表達（P＜0.05，圖3B、C）。綜合上述結(jié)果，干擾片段1的抑制效果最好，并擬采用此片段進行后續(xù)的干擾實驗。

圖2 RT-qPCR和Western blot驗證GDF15干擾效果Figure 2 The interference effect of GDF15 in BM-MSCs were detected by RT-qPCR and Western blot

2.3 干擾GDF15的表達可降低BM-MSCs放射后細胞增殖

為明確GDF15 表達水平對放射前后細胞增殖的影響，我們檢測了細胞周期和細胞增殖活力。收取未放射和放射后24 h 的BM-MSCs 細胞，通過PI染色檢測細胞周期，結(jié)果顯示，未放射條件下，干擾GDF15 對BM-MSCs 周期無明顯影響；放射后24 h時，干擾GDF15 組G2 期比例顯著增加（P＜0.05，圖3A、B）。收取放射3 d后的細胞，CCK-8法檢測細胞增殖活力，結(jié)果顯示與細胞周期結(jié)果相符，干擾GDF15幾乎不影響未放射時的細胞增殖活力，卻可導致放射后BM-MSCs 細胞增殖活力顯著降低（P＜0.01，圖3C）。綜上所述，干擾GDF15基因表達可導致放射后BM-MSCs細胞G2期阻滯并且降低細胞增殖活力。

圖3 干擾GDF15抑制BM-MSCs放射后細胞周期及增殖Figure 3 GDF15 interference inhibited the cell cycle and proliferation of BM-MSCs after irradiation

2.4 干擾GDF15表達可增加BM-MSCs放射后細胞凋亡

為進一步明確GDF15 表達對BM-MSCs 放射抗性的影響，我們通過Annexin V-PE/7AAD 染色及檢測Cleaved caspase3 和JC-1 變化水平，明確干擾GDF15 表達對BM-MSCs 放射后細胞凋亡的影響。檢測結(jié)果如圖4A、B 所示，未放射條件下，干擾GDF15 表達對細胞的凋亡無顯著性影響。而放射后，干擾GDF15 可導致細胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）。與之相應，Cleaved caspase3 的Western blot結(jié)果證實，干擾GDF15可使放射后Caspase3的剪切水平增加（圖4C）。同時，檢測JC-1細胞線粒體膜電位的變化情況發(fā)現(xiàn)，在未放射條件下，對照組與干擾GDF15 紅/綠熒光強度比值無統(tǒng)計差異（P＞0.05）。而放射后，干擾GDF15組與其干擾對照組相比，紅/綠熒光強度比值顯著降低，提示線粒體膜電位下降（P＜0.001，圖5）。上述結(jié)果表明，干擾GDF15表達可顯著增加BM-MSCs細胞放射后凋亡。

圖4 干擾GDF15對BM-MSCs放射前后細胞凋亡的影響Figure 4 The effects of GDF15 interference on the apoptosis of BM-MSCs before and after irradiation

圖5 干擾GDF15后BM-MSCs放射前后線粒體膜電位變化Figure 5 The effect of GDF15 interference on mitochondrial membrane potential of BM-MSCs before and after irradiation

2.5 干擾GDF15表達可抑制BM-MSCs 的ERK/Bcl-2信號通路活化

為進一步明確干擾GDF15 表達增加BM-MSCs放射敏感性的分子機制，我們檢測了GDF15下游與細胞凋亡密切相關(guān)的關(guān)鍵通路ERK/Bcl-2的活化情況［15］。Western blot檢測結(jié)果表明：與空白對照組和干擾對照組相比，干擾GDF15 后，ERK1/2 磷酸化水平明顯降低，表明GDF15 可以通過增加ERK1/2 的磷酸化調(diào)節(jié)其下游蛋白的表達。與對照組相比，干擾GDF15導致抗凋亡關(guān)鍵分子Bcl-2蛋白水平明顯降低，而促凋亡分子Bax 蛋白水平明顯升高（圖6）。綜上所述，干擾GDF15表達可通過抑制ERK信號通路活化，調(diào)節(jié)下游Bcl-2 和Bax 蛋白表達，進而增加BM-MSCs放射后凋亡。

圖6 干擾GDF15后BM-MSCs放射后ERK及其下游蛋白的表達Figure 6 The effect of GDF15 interference on ERK and its downstream proteins of BM-MSCs after irradiation

3 討論

在ARS的研究中，骨髓造血損傷是各種放射病最基本和最致命的表現(xiàn)之一，并貫穿各型ARS的始終［16］。因此，對于骨髓造血功能損傷的防治是ARS防治的關(guān)鍵和重要研究領(lǐng)域。BM-MSCs 是一類具有自我更新和多向分化潛能的干細胞，可以分化為包括成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞在內(nèi)的骨髓基質(zhì)細胞，以形成HSCs 骨髓內(nèi)定植的龕位，也可分泌多種造血因子、細胞因子和趨化因子建立細胞因子網(wǎng)絡，對于正常造血功能的維持和損傷后造血重建都至關(guān)重要［17］。因此研究BMMSCs的放射抗性，對于造血重建具有重大意義。

凋亡是放射誘導細胞死亡的主要原因之一，而BM-MSCs 對凋亡的抗性被認為是放射耐受的關(guān)鍵機制。已有研究表明，放射后BM-MSCs的抗凋亡作用與較強的DNA 損傷修復能力和較快的活性氧清除有關(guān)［18］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，GDF15 升幅高的BM-MSCs凋亡率較低［13］，提示GDF15可能參與BMMSCs的放射抗性，但具體機制未明。本研究發(fā)現(xiàn)放射可誘導BM-MSCs中GDF15表達顯著上調(diào)，而干擾其表達可導致放射后細胞凋亡率增加，證實GDF15可促進細胞的放射抵抗。細胞對放射的敏感性與所處的周期密切相關(guān)，處于G1/S期的細胞放射敏感性低，處于G2期的細胞放射敏感性高［19］。已有文獻報道，GDF15參與細胞周期的調(diào)控。如在宮頸癌細胞中，GDF15 誘導c-Myc 的表達，c-Myc 作為調(diào)節(jié)細胞周期的經(jīng)典轉(zhuǎn)錄因子，可誘導CDK1和cyclinB1的上調(diào)，CDK1-cyclinB1 形成復合物促進細胞通過G2期［7，20］。本研究也證實干擾GDF15，放射后BMMSCs 的G2期阻滯增加。但是否GDF15通過該機制參與放射后BM-MSCs的G2期調(diào)控有待進一步研究。

線粒體是放射損傷的重要靶點。放射可直接作用于線粒體DNA，也可間接通過輻解產(chǎn)生的活性氧損傷線粒體的蛋白及細胞膜系統(tǒng)，破壞電子傳遞鏈（ETC）復合物Ⅰ、Ⅱ等，從而導致線粒體膜通透性改變、融合-分裂動態(tài)平衡失衡、線粒體膜電位下降等一系列結(jié)構(gòu)和功能損害［21］。此外，GDF15也是線粒體功能損傷的標志物［22］。因此，我們檢測了干擾GDF15 對放射前后線粒體膜電位以及Caspase3 剪切情況的影響。正常的線粒體膜電位是維持線粒體功能的關(guān)鍵，而其膜電位的降低是細胞凋亡早期的一個標志性事件［23］。本研究結(jié)果顯示干擾GDF15對正常BM-MSCs線粒體膜電位無顯著影響，但放射后卻可以顯著降低線粒體膜電位。此外，干擾GDF15 的BM-MSCs 放射后Cleaved caspase3 水平最高。綜上所述，干擾GDF15誘導BM-MSCs放射敏感性增加可能與線粒體凋亡途徑增強有關(guān)。

ERK信號通路在BM-MSCs的增殖、分化和凋亡中具有重要作用。抑制ERK1/2 磷酸化可通過調(diào)控Bax 和Bcl-2 表達水平，激活Caspase3，導致細胞凋亡［24］。在多種腫瘤細胞中，已有研究證實GDF15可結(jié)合酪氨酸激酶受體ErbB2，激活ErbB2 的激酶活性，進而磷酸化ERK1/2 調(diào)控細胞增殖［7，25］。因此，我們檢測了在BM-MSCs 中GDF15 對ERK1/2 磷酸化的影響，結(jié)果顯示干擾GDF15 抑制了ERK1/2的磷酸化水平。ERK1/2 對細胞凋亡的調(diào)控主要通過對Bcl-2和Bax蛋白調(diào)節(jié)實現(xiàn)。研究表明，ERK1/2依賴性磷酸化可以激活cAMP反應性元素結(jié)合蛋白（CREB），磷酸化的CREB 入核并與Bcl-2 的啟動子結(jié)合，從而促進Bcl-2 轉(zhuǎn)錄［24］。當Bcl-2 表達較Bax多時，兩者可以結(jié)合形成異源二聚體，抑制細胞的凋亡，而Bcl-2表達較Bax少時，Bax自身會形成同源二聚體，促進細胞的凋亡［27］。既往研究表明，與放射敏感性細胞相比，MSCs高表達抗凋亡蛋白Bcl-2，低表達促凋亡蛋白Bax［1］。因此，本研究檢測了干擾GDF15之后，Bcl-2和Bax在BM-MSCs中的表達。干擾GDF15 后Bcl-2 蛋白水平降低，Bax 蛋白水平升高，表明GDF15對BM-MSCs放射抗性的調(diào)控可能通過ERK/Bcl-2通路實現(xiàn)。

綜上所述，本研究證明了GDF15作為放射應激分子，通過激活ERK/Bcl-2通路活性，參與BM-MSCs的放射抗性調(diào)控，為放射后造血微環(huán)境的重建提供了調(diào)控靶分子。然而，BM-MSCs細胞中GDF15影響ERK磷酸化的具體機制尚不清楚，有待進一步的研究探索。