魏瑩瑩，胡翔宇，祖麗皮耶·艾爾肯，龔衛(wèi)娟，賈筱琴

揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，江蘇 揚州 225001

microRNA（miRNA）是一類內(nèi)生的、長度約為20～24個核苷酸的非編碼RNA，不僅參與細(xì)胞增殖、發(fā)育、分化、凋亡等基本生理過程，還和腫瘤、炎癥等病理過程有著密切關(guān)系［1］。miR-16和miR-15a基因復(fù)合體定位于人類基因組13q14，該位點基因的突變與慢性淋巴細(xì)胞性白血病以及黑色素瘤、結(jié)直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等多種實體腫瘤，有著密切的關(guān)系［2］。miR-16/miR-15a可以直接靶向多種致癌基因，也可以靶向抑制生長因子的分泌，從而發(fā)揮抗腫瘤活性［3-4］。

NKG2D 是表達(dá)于自然殺傷（natural killer，NK）和CD8+T細(xì)胞的重要活化性受體之一［5］。NKG2D轉(zhuǎn)錄后水平可受miRNA調(diào)控，如miR-182可與NKG2D的3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）結(jié)合下調(diào)NKG2D 表達(dá)［6］。通過生物信息學(xué)分析，我們在小鼠NKG2D 基因3′-UTR 區(qū)發(fā)現(xiàn)了miR-16 結(jié)合的互補(bǔ)基因區(qū)（圖1），然而miR-16 是否通過調(diào)節(jié)NK 細(xì)胞NKG2D 的表達(dá)進(jìn)而參與腫瘤的調(diào)控，目前尚不清楚。

圖1 miR-16與NKG2D 3′-UTR的互補(bǔ)序列Figure 1 Complementary sequence of miR-16 and NKG2D 3′-UTR

本研究觀察了MC38 結(jié)腸癌移植瘤在8 周齡miR-16/15a-/-小鼠體內(nèi)的生長情況，以及生理及荷瘤狀態(tài)下NKG2D+NK 細(xì)胞和NKG2D-NK 細(xì)胞內(nèi)miR-16表達(dá)的變化。同時利用miR-16/15a-/-小鼠研究生理及荷瘤后NK細(xì)胞的活性變化，為深入了解miR-16調(diào)節(jié)NK細(xì)胞生物學(xué)活性提供重要實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及細(xì)胞系

miR-16/15a-/-小鼠為本實驗室自美國Jackson實驗室引進(jìn)，并于揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心繁殖，C57BL/6 小鼠購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，所有使用實驗動物均為8 周齡。飼養(yǎng)環(huán)境為：溫度20～25 ℃，濕度50%左右，正常晝夜更替，12 h 光照/12 h無光照交替進(jìn)行的方式模擬，自由飲水進(jìn)食。所有動物實驗嚴(yán)格按照動物實驗規(guī)范執(zhí)行。飼養(yǎng)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系MC38 細(xì)胞株和小鼠淋巴瘤細(xì)胞（YAC-1細(xì)胞）由本實驗室常規(guī)保存。

1.1.2 主要試劑

RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit、DNA 合成酶SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa公司，日本）；APC-NK1.1抗體（PK136）、PENKG2D抗體（6d5）、FITC-CD3抗體（17A2）、PE-IFNγ抗體（XMG12）（BioLegend公司，美國）；PE-CD107a抗體（1D4B）（BD Biosciences 公司，美國）；佛波脂醇和離子霉素刺激劑（eBioscience公司，美國），DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國）；胰酶細(xì)胞消化液、紅細(xì)胞裂解液（上海碧云天）；胎牛血清（Biological Industries 公司，以色列）；DNase Ⅰ（上海生工）；DispaseⅡ（Roche Applied Science 公司，美國）；膠原酶Ⅳ（Sigma公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 觀察miR-16/15a-/-小鼠對結(jié)腸癌移植瘤的敏感性

收集對數(shù)期小鼠結(jié)腸癌MC-38細(xì)胞按2×106個/只皮下注射miR-16/15a-/-小鼠（KO）和同型對照C578L/6 小鼠（WT）。每天觀察移植瘤生長情況和小鼠狀態(tài)，體外測量移植瘤長、寬、高并計算體積。第21天時取出移植瘤和小鼠脾臟，進(jìn)行下一步分析。

1.2.2 RT-PCR法檢測小鼠NK細(xì)胞miR-16的表達(dá)

分離C57BL/6 小鼠脾臟并制備淋巴單細(xì)胞懸液，通過BD流式細(xì)胞儀分選NK1.1+NKG2D+細(xì)胞和NK1.1+NKG2D-細(xì)胞，用TRIzol 分別提取各組細(xì)胞總RNA，分光光度計測量其純度及濃度，并取1 μg，采用Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃60 min，85 ℃5 min。然后，以cDNA 為模板，進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)條件為95 ℃10 s；95 ℃5 s，60 ℃20 s，40 個循環(huán)。熒光定量PCR 采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，設(shè)計上游引物miRNA-16-1 序列為5′-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3′，下游引物為試劑盒的通用引物。以snRNA 中的U6 作為內(nèi)參基因，其上下游通用PCR 引物均由試劑盒提供。結(jié)果采用相對定量方法對目的基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，實驗重復(fù)3 次。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-16/15a-/-小鼠NK 細(xì)胞的表型和功能

分離8 周齡的miR-16/15a-/-小鼠和同型對照小鼠的脾臟并制備淋巴單細(xì)胞懸液，通過流式細(xì)胞術(shù)分別檢測CD3-NK1.1+和CD3-NK1.1+NKG2D+細(xì)胞頻率。用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行胞內(nèi)染色時，用細(xì)胞刺激劑體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞4 h 后，Brefeldin A 阻斷轉(zhuǎn)運和釋放，標(biāo)記NK1.1 和IFN-γ抗體，檢測NK 細(xì)胞分泌的IFN-γ。另外，用脾臟單細(xì)胞懸液按3∶1、1∶1、1∶3 的效-靶比例，分別與小鼠淋巴瘤細(xì)胞（YAC-1細(xì)胞）共孵育后，以CD107a 標(biāo)記法檢測NK 細(xì)胞的脫顆?；钚浴?/p>

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析NK細(xì)胞在荷瘤小鼠組織中的分布

取脾臟淋巴單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞術(shù)分析脾臟中NK 細(xì)胞頻率和NK 細(xì)胞及其受體NKG2D 的表達(dá)。對于分離的腫瘤組織，充分研磨后用0.5 mg/mL的膠原酶Ⅳ、0.5 mg/mL的DnaseⅠ和3 mg/mL的DispaseⅡ消化腫瘤組織，梯度離心法獲得腫瘤浸潤樣淋巴細(xì)胞，流式分析腫瘤組織中NK 細(xì)胞頻率及NKG2D表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-16/15a-/-小鼠對結(jié)腸癌移植瘤的敏感性

miR-16/15a-/-小鼠（KO）和對照小鼠（WT）經(jīng)皮下注射MC38 細(xì)胞制備結(jié)腸癌移植瘤模型，觀察兩組小鼠皮下實體瘤生長情況。結(jié)果顯示，與WT 小鼠比較，移植瘤的生長在KO小鼠受到顯著抑制（圖2A、B），KO 組小鼠腫瘤重量明顯小于WT 小鼠（P＜0.05，圖2C）。

圖2 miR-16/15a-/-小鼠對結(jié)腸癌移植瘤敏感性的檢測Figure 2 Sensitivity of miR-16/15a-/-mice to colon cancer xenograft

2.2 生理及荷瘤狀態(tài)下miR-16在NK1.1+NKG2D+細(xì)胞的表達(dá)

已知miRNA［7］，包括miR-16/15a調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的分化與功能［8］，NK 細(xì)胞異常表達(dá)NKG2D 會影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［9］，于是課題組研究miR-16 水平與NK 細(xì)胞NKG2D 表達(dá)的關(guān)系。分別取生理狀態(tài)的C57BL/6 小鼠和荷瘤（MC38 皮下荷瘤）3 周的C57BL/6 小鼠的脾臟細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分選脾臟NK1.1+NKG2D+細(xì)胞和NK1.1+NKG2D-細(xì)胞，RT-PCR法檢測miR-16的表達(dá)。結(jié)果顯示，生理狀態(tài)小鼠脾臟NK1.1+NKG2D+細(xì)胞中miR-16表達(dá)水平較NK1.1+NKG2D-細(xì)胞顯著降低（P＜0.01，圖3A），荷瘤小鼠脾臟NK細(xì)胞miR-16的表達(dá)在NKG2D+和NKG2D-亞群中無明顯變化（P＞0.05，圖3B），提示荷瘤狀態(tài)下，miR-16對NK細(xì)胞NKG2D的表達(dá)無明顯調(diào)控作用。

圖3 生理或荷瘤小鼠NK1.1+NKG2D+和NK1.1+NKG2D-細(xì)胞miR-16的表達(dá)Figure 3 Expression of miR-16 in NK1.1+NKG2D+ and NK1.1+NKG2D- cells in physiological or tumorbearing conditions

2.3 miR-16/15a-/-小鼠NK 細(xì)胞頻率及受體NKG2D的表達(dá)

接下來課題組研究miR-16/15a敲除后，NK細(xì)胞頻率及NK細(xì)胞NKG2D的表達(dá)是否發(fā)生改變。流式細(xì)胞術(shù)分析生理狀態(tài)下miR-16/15a-/-小鼠和對照小鼠脾臟NK細(xì)胞百分率，同時檢測NK細(xì)胞NKG2D的表達(dá)情況。結(jié)果顯示兩組小鼠脾臟中NK細(xì)胞百分率和NK細(xì)胞NKG2D的表達(dá)均無顯著差異（P＞0.05，圖4A、B）。進(jìn)一步用IL-2（20 ng/mL）+IL-15（20 ng/mL）聯(lián)合刺激NK 細(xì)胞活化72 h 后，兩組小鼠NK 細(xì)胞NKG2D的表達(dá)亦無明顯變化（P＞0.05，圖4C）。

圖4 miR-16/15a-/-小鼠脾臟NK細(xì)胞頻率及NKG2D的表達(dá)Figure 4 NK cell frequency and expression of NKG2D in the spleen of miR-16/15a-/-mice

2.4 miR-16/15a-/-小鼠NK細(xì)胞IFN-γ分泌和細(xì)胞毒活性的檢測

流式細(xì)胞術(shù)分析生理狀態(tài)的miR-16/15a-/-小鼠和同型對照小鼠脾臟NK細(xì)胞IFN-γ的產(chǎn)生能力，以及與靶細(xì)胞共孵育后的脫顆?；钚裕栽u估NK 細(xì)胞殺傷活性。結(jié)果表明，與WT 小鼠相比，KO 小鼠NK 細(xì)胞分泌IFN-γ的能力無顯著變化（P＞0.05，圖5A）；同時兩組小鼠NK細(xì)胞脫顆粒能力（CD107a表達(dá)）無明顯差異（P＞0.05，圖5B）。

圖5 miR-16/15a-/-小鼠脾臟NK細(xì)胞IFN-γ產(chǎn)生和脫顆?；钚缘臋z測Figure 5 IFN-γ production and degranulation activity of NK cells in the spleen of miR-16/15a-/-mice

2.5 miR-16/15a-/-小鼠荷瘤后體內(nèi)NK 細(xì)胞活性的檢測

以MC38 細(xì)胞皮下注射miR-16/15a-/-小鼠和C57BL/6小鼠，建立小鼠結(jié)腸癌移植瘤模型，對兩組荷瘤小鼠用流式細(xì)胞術(shù)分析脾臟和移植瘤中NK細(xì)胞及NK1.1+NKG2D+細(xì)胞的百分率。結(jié)果表明，無論是NK 細(xì)胞的百分率，還是NK1.1+NKG2D+的百分率，在兩組荷瘤小鼠的脾臟（P＞0.05，圖6A、B）和移植瘤中都沒有明顯的差異（P＞0.05，圖6C、D），提示荷瘤狀態(tài)下miR-16對NK細(xì)胞表達(dá)NKG2D及NK細(xì)胞的生物學(xué)功能無明顯調(diào)節(jié)作用。

圖6 荷瘤小鼠脾臟和移植瘤組織NK細(xì)胞的檢測Figure 6 Detection of NK cells in spleen and transplanted tumor of mice

3 討論

miR-16/miR-15a功能下降和缺失不僅與慢性B淋巴細(xì)胞性白血?。s55%）密切相關(guān)，還與黑色素瘤、結(jié)直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等多種實體腫瘤有關(guān)［2］。miR-16/miR-15a 主要靶向抑制Bcl-2、WT-1、WNT3A、MCA1、MCL1、CCDN1等致癌基因的活性，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡［3］。同時研究證實敲除miR-16/miR-15a 抑制肝癌（H22）移植瘤的生長［10］，過表達(dá)miR-16/miR-15a會促進(jìn)結(jié)腸癌（MC38）移植瘤的生長［11］，miR-16或miR-15a在淋巴細(xì)胞中的表達(dá)以及其對淋巴細(xì)胞活性的影響還有待進(jìn)一步研究。Sullivan等［8］發(fā)現(xiàn)在小鼠NK細(xì)胞中miR-16/15a可以直接靶向轉(zhuǎn)錄因子c-myb的3′-UTR區(qū)，從而影響NK 細(xì)胞的成熟和分化。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)NKG2D基因的3′-UTR區(qū)也存在miR-16的互補(bǔ)結(jié)合序列，而NKG2D是NK細(xì)胞表面重要的活化性受體，那么miR-16 是否參與調(diào)控NK 細(xì)胞NKG2D 的表達(dá)，以及其對NK 細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫活性的影響如何，這對了解miR-16在不同狀態(tài)NK細(xì)胞的表達(dá)特點及其活性調(diào)節(jié)具有重要意義，值得進(jìn)一步研究。NKG2D 不僅是NK 細(xì)胞表面重要的活化性受體，也是CD4+T、CD8+、NKT、?δT以及部分巨噬細(xì)胞表面的活化性受體。當(dāng)NKG2D與其配體MHC Ⅰ類相關(guān)分子（MICA 或MICB）結(jié)合后，激活NK 和CD8+T 淋巴細(xì)胞，成為機(jī)體發(fā)揮抗腫瘤和抗感染活性的關(guān)鍵免疫分子［5，12］。NKG2D+CD8+T、NKG2D+CD4+T細(xì)胞通常聚集腫瘤部位，發(fā)揮抗腫瘤作用［13］，而miR-16/15a 能夠影響NKG2D+CD8+T［14］、NKG2D+CD4+T［11］細(xì)胞的頻率。提示miR-16/15a也可能通過影響CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞等NKG2D的表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用。

為了進(jìn)一步研究miR-16/15a 的生物學(xué)功能，課題組從美國Jackson 實驗室引進(jìn)了miR-16/15a 基因敲除小鼠。對比WT小鼠，miR-16/15a-/-小鼠的肝癌（H22）移植瘤生長速度變慢［11］。課題組對miR-16/15a-/-小鼠皮下注射MC38細(xì)胞，miR-16/15a-/-小鼠結(jié)腸癌移植瘤的生長速度較野生小鼠明顯降低，提示miR-16/15a-/-小鼠抗腫瘤活性增強(qiáng)。生理狀態(tài)下，與NK1.1+NKG2D-細(xì)胞相比，C57BL/6 小鼠NK1.1+NKG2D+細(xì)胞miR-16 表達(dá)明顯下降，提示miR-16 可能調(diào)節(jié)NK 細(xì)胞NKG2D 的表達(dá)。然而在荷瘤小鼠中，miR-16 在小鼠脾臟2 組NK 細(xì)胞亞群間的表達(dá)差異消失，提示對于荷瘤小鼠的NK細(xì)胞，miR-16對其NKG2D表達(dá)沒有核心調(diào)控作用。另外，生理狀態(tài)的miR-16/15a-/-小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞百分率、活性和細(xì)胞毒性與對照小鼠無顯著差異，與NK 細(xì)胞特異性缺乏miR-16/15a 的報道相一致。以上結(jié)果均提示盡管miR-16可能參與NK細(xì)胞NKG2D表達(dá)的調(diào)控，但對NK細(xì)胞的生物學(xué)活性無明顯調(diào)節(jié)作用。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，NK 細(xì)胞及NK1.1+NKG2D+細(xì)胞的百分率在荷瘤組織和脾臟內(nèi)均無明顯變化，說明NK細(xì)胞在miR-16/15a基因敲除小鼠體內(nèi)的腫瘤監(jiān)視作用改變不明顯，可能是其他免疫細(xì)胞介導(dǎo)了抗腫瘤活性。課題組前期研究提示，miR-16/15a-/-小鼠荷瘤后，其腫瘤微環(huán)境中M1 型巨噬細(xì)胞的百分率明顯增加，其M1 細(xì)胞的分化主要依賴NF-κB 和STAT3通路的共同激活［10］。另外，活化的小鼠CD8+T細(xì)胞表達(dá)NKG2D，且miR-16在初始CD8+T細(xì)胞中高表達(dá)，CD8+T細(xì)胞活化后表達(dá)下調(diào)［15］。因此，miR-16缺陷是否直接導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞活性上調(diào)，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用，需要后續(xù)進(jìn)一步的實驗證實。

綜上所述，miR-16/15a-/-小鼠抑制MC38 結(jié)腸癌移植瘤生長。盡管生理狀態(tài)下miR-16在NKG2D+和NKG2D-NK 細(xì)胞表達(dá)存在明顯差異，但是正常和荷瘤狀態(tài)下miR-16/15a-/-小鼠的NK 細(xì)胞卻無明顯區(qū)別。因此miR-16/15a-/-小鼠抑制MC38 結(jié)腸癌移植瘤生長，并非通過NK 細(xì)胞發(fā)揮作用，miR-16/15a-/-抑制MC38結(jié)腸癌移植瘤生長的機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。