朱浩然，張 鑫，祁俊俠，閆麗紅，賴婭娜，李聚學*

1南京醫(yī)科大學生物化學與分子生物學系，2醫(yī)藥實驗動物中心，江蘇 南京 211166

Nudix 水解酶家族成員核苷二磷酸連接的部分X 基 序3［Nudix（nucleotide diphosphate linked moiety X）-type motif 3，NUDT3］屬于Nudix 水解酶家族成員，參與多種代謝調控過程［1-3］，目前已知該家族共有21個成員［4］，該家庭中的許多成員在代謝調控方面有重要作用。但是，NUDT3在肥胖發(fā)生和發(fā)展中的作用尚不清楚。一項關于日本肥胖人群的全基因組關聯(lián)分析（genome-wide associaotion study，GWAS）發(fā)現(xiàn)，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）rs206936 位點與肥胖密切相關，且NUDT3 基因位于該SNP 位點附近［5］。在果蠅上敲降Nudt3基因，導致果蠅的體重顯著改變［6］。另外一項研究顯示，NUDT3 與女性體脂率增加有關，而與男性體脂率無關［5］。NUDT3導致的脂肪積累可能與PI3K-AKT 信號有關［7-8］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Nudt3基因在小鼠下丘腦的弓狀核中有較高的表達水平，推測其可能在下丘腦介導的能量調控中發(fā)揮重要作用。然而，目前尚缺乏可進行相關研究的Nudt3 基因敲除小鼠。鑒于此，我們利用CRISPR/Cas9技術進行Nudt3基因編輯小鼠的構建［9-11］。

按照CRISPR/Cas9 的技術原理，我們設計了相應的引導RNA（guide RNA，gRNA），在南京醫(yī)科大學實驗動物中心進行了gRNA和Cas9 mRNA的胚胎顯微注射，并獲得了小鼠。小鼠的基因測序結果顯示，在Nudt3 基因第2 個外顯子有一段98 bp 長度的序列缺失；Western blot結果也顯示，Nudt3基因在多個組織（如肝臟、下丘腦等）中均不表達，表明基因敲除小鼠構建成功，可為我們后續(xù)肥胖機制研究提供理想的動物模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

CRISPR/Cas9 基因編輯技術構建Nudt3 基因敲除小鼠的設計和胚胎注射工作由南京醫(yī)科大學醫(yī)藥實驗動物中心完成［實驗動物生產許可證號：SYXK（蘇）2015-0015］。所有實驗小鼠均飼養(yǎng)于無特定病原體（specific pathogen free，SPF）屏障設施中，7：00—19：00 提供光照（光/暗循環(huán)12 h），溫度（22±3）℃，飼料與飲水隨意采食，全部動物實驗均嚴格按照南京醫(yī)科大學動物實驗福利倫理審查委員會（IACUC-1811031）批準的程序開展。

1.1.2 主要試劑

2×Taq Plus MasterMix、2×SYBR Green MasterMix（南京諾唯贊生物科技有限公司）；TRIzol（北京寶日醫(yī)生物技術有限公司）；蛋白酶K、RIPA 蛋白裂解液、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）電泳上樣緩沖液（上海翊圣生物科技有限公司）；DNA Maker DL2000（北京天根生化科技有限公司）；蛋白酶和磷酸酶抑制劑（MCE 公司，美國）；二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、Kinase-BeyoECL Plus 超敏ECL化學發(fā)光試劑盒、鼠抗小鼠GAPDH 抗體（上海碧云天生物技術有限公司）；兔抗小鼠NUDT3抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；聚偏氟乙烯（poly vinylidene fluoride，PVDF）膜（Millipore 公司，美國）。Nudt3 基因敲除小鼠DNA 鑒定引物序列信息及RT-PCR 引物序列見表1，所有引物合成以及測序結果均來自南京擎科生物技術有限公司。

表1 小鼠DNA鑒定及RT-PCR引物序列Table 1 The primer sequences for mice genotyping and RT-PCR

1.2 方法

1.2.1 基因編輯小鼠的構建

在C57BL/6 小鼠Nudt3 基因的第2 個外顯子上選擇gRNA 靶點，設計2 條gRNA，分別是gRNA-1：5′-GTAGCCGCCATCCAGACCGA-3′，gRNA-2：5′-GTTCTCAGTTACATTGCGGA-3′。合成相應的gRNA后，對收集到的受精卵進行顯微注射（Cas9 mRNA 注射濃度為20 ng/μL，gRNA注射濃度為50 ng/μL），得到的胚胎分別移植到假孕小鼠中，經過正常妊娠分娩后，得到F0 代小鼠，并進行基因突變分析。將F0代基因突變小鼠與野生型小鼠交配獲得后代F1，并對F1 代小鼠進行基因突變分析。選擇發(fā)生基因移碼突變的F1 代雜合雌鼠和雄鼠交配獲得F2 代小鼠，并對F2 代小鼠進行基因突變分析。對F2 代中純合小鼠進行配繁，獲得基因純合敲除小鼠品系。

1.2.2 基因敲除小鼠的篩選

提取鼠尾基因組DNA，通過PCR 檢測目的片段。反應體系：2×Taq Plus MasterMix 10 μL、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、DNA 模板2 μL、無菌水6.4 μL。反應條件：95 ℃變性5 min；95 ℃30 s、60 ℃30 s、72 ℃30 s，循環(huán)35 次；72 ℃延伸10 min。根據(jù)PCR 擴增數(shù)據(jù)進行測序分析，選擇非3 的倍數(shù)缺失堿基的個體作為突變的陽性小鼠。

1.2.3 基因敲除脫靶位點預測與脫靶效應檢測

利用在線軟件https：//cm.jefferson.edu/Off -Spotter/進行脫靶位點預測，篩選出與gRNA 序列同源性較高的脫靶位點，隨后在美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的C57BL/6 小鼠基因組（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv/browser/genome/?

id=GCF_000001635.27，物種taxid：10090）中找到該位點附近的核酸序列，設計測序引物（表2）以測定預測脫靶位點的基因組。

表2 脫靶預測位點測序引物序列Table 2 The primer sequences for the predicted off -target site sequences

1.2.4 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）檢測小鼠Nudt3基因mRNA表達

采用TRIzol 法提取組織總RNA，根據(jù)PrimeScriptTMRT Reagent Kit 逆轉錄試劑盒說明制備cDNA 樣品。按如下步驟進行qPCR，反應體系如下（20 μL）：2×SYBR Green MasterMix 10 μL、cDNA模板2 μL、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、無菌水6.4 μL。反應條件：50 ℃2 min，1 個循環(huán)；95 ℃10 min，1 個循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 個循環(huán)。每個樣品均做3 個重復反應，以Actb為內參基因根據(jù)公式2-ΔΔCT計算Nudt3 mRNA 在各組織中的表達量。

1.2.5 PCR檢測Nudt3-/-小鼠Nudt3基因mRNA表達

按上述方法提取組織總RNA 并制備cDNA 樣品。按如下步驟進行PCR。反應體系如下（20 μL）：2×Taq Plus MasterMix 10 μL、cDNA 模板3 μL、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、無菌水5.4 μL。反應條件：50 ℃2 min，1 個循環(huán)；95 ℃10 min，1 個循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 個循環(huán)。PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳，分析檢測mRNA 的表達情況。

1.2.6 Western blot 檢測Nudt3-/-小鼠各組織蛋白水平的表達

脫臼法處死F2 代純合Nudt3 基因敲除小鼠和對照組野生型小鼠，依次取各部分組織，加預冷的適量蛋白裂解液（內含蛋白酶和磷酸酶抑制劑）。用組織勻漿機將組織充分研磨后，冰浴1 h，13 000 r/min 4 ℃離心30 min，取上清。用BCA 試劑盒測定組織蛋白質濃度，并按照測定的濃度適當稀釋蛋白質樣品。加入蛋白上樣緩沖液混合，95 ℃煮沸5 min后，-20 ℃保存。取40 μg 蛋白樣本進行10%SDSPAGE 凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，加入一抗（兔抗小鼠NUDT3，鼠抗小鼠GAPDH，均1∶1 000 稀釋），4 ℃孵育過夜，次日TBST 洗滌3 次，每次5 min，加入山羊抗兔二抗及山羊抗鼠二抗（1∶1 000 稀釋）室溫孵育1 h，TBST 洗滌5 min，共洗3 次。根據(jù)ECL說明書顯影，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 9.0、SPSS22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤（）表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Nudt3基因在各組織中的表達以及在高脂飼料飼喂下的表達變化

用定量PCR 檢測Nudt3 基因的mRNA 表達譜，結果顯示，Nudt3在中樞神經系統(tǒng)高表達（圖1A）。

為了進一步探究NUDT3與代謝的關系，我們檢測了在60%高脂飼料誘導下Nudt3 基因表達的變化。結果顯示，在高脂飼料的誘導下，下丘腦、腎、肝的Nudt3基因表達顯著下調，白色脂肪、棕色脂肪中Nudt3基因表達顯著上調（P＜0.05，圖1B）。從這些結果中可以看出，Nudt3 基因在重要代謝調控組織中的表達會受到高脂飼料誘導的調控，提示NUDT3在能量代謝中可能發(fā)揮重要作用。

圖1 Nudt3 mRNA的轉錄水平Figure 1 The relative expression of Nudt3 mRNA

2.2 針對Nudt3基因的gRNA序列設計

為了進一步研究Nudt3基因在能量調控中的作用機制，我們擬利用CRISPR/Cas9 技術構建Nudt3基因敲除小鼠。使用CRISPR/Cas9 技術進行基因敲除時，合理的gRNA設計十分重要。根據(jù)經驗，一般將gRNA 設計在目的基因編碼區(qū)域的2 號外顯子（Exon 2），或編碼區(qū)域的前1/3 處，在此區(qū)域切割使DNA 雙鏈斷裂，通過非同源性末端結合（nonhomologous end joining，NHEJ）修復，產生移碼突變。本研究將2 條gRNA 分別設計在Nudt3 基因Exon 2（gRNA1）與Exon 2和Exon 3間的區(qū)域（gRNA2）（圖2），使用在線設計軟件（http：//crispr.mit.edu/）進行設計。序列分別為gRNA-1：5′-GTAGCCGCCATCCAGACCGA-3′，gRNA-2：5′-GTTCTCAGTTACATTGCGGA-3′。

2.3 Nudt3基因敲除小鼠的測序鑒定結果

合成相應的gRNA后，對116枚受精卵進行顯微注射，隨后將得到的112 枚胚胎分別移植到5 只假孕小鼠中，經過正常妊娠分娩后，共獲得17只F0 代小鼠，DNA測序鑒定結果顯示14只小鼠均為敲除嵌合體。

獲得F0 代嵌合體小鼠后，將F0 代小鼠與C57BL/6 野生型小鼠雜交配繁，獲取F1 代雜合小鼠。針對Nudt3基因的敲除靶點兩端設計PCR鑒定引物，經PCR擴增測序，鑒定出3種基因型，分別為：①Nudt3-KO1：394 bp堿基片段缺失，末端堿基G突變?yōu)镃；②Nudt3-KO2：在2號外顯子區(qū)域出現(xiàn)4 bp堿基片段缺失；③Nudt3-KO3：383 bp 堿基片段缺失（圖2）。后續(xù)實驗選取敲除片段最多（394 bp 的序列缺失）且突變位點靠近5′端的Nudt3-KO1小鼠進行鑒定，發(fā)現(xiàn)在Nudt3基因蛋白編碼區(qū)出現(xiàn)98 bp堿基缺失。

圖2 Nudt3基因敲除小鼠的CRISPR/Cas9 gRNA靶點設計示意圖Figure 2 The design of CRISPR/Cas9 gRNA for the generation of Nudt3-knockout mice

使用該基因型（Nudt3-KO1）F1代雜合小鼠進行交配，建立穩(wěn)定的Nudt3 基因敲除小鼠品系。根據(jù)我們設計的引物，基因型鑒定標準為：電泳結果只出現(xiàn)672 bp 條帶的樣本為野生型，電泳結果同時出現(xiàn)672 bp和279 bp 條帶的樣本為雜合子，電泳結果只出現(xiàn)279 bp 條帶的樣本為敲除鼠（圖3A、B）。

圖3 部分F2代小鼠基因鑒定結果Figure 3 The genotyping results of F2-generation mice

2.4 Nudt3基因敲除小鼠的預測脫靶位點檢測

由于gRNA 可能會有一定的脫靶效應，與基因組同源序列形成非特異結合，可能最終導致Cas9錯誤切割［12-13，15］。因此我們通過在線軟件Off-Spotter進行脫靶位點預測，分別選取2 個脫靶概率最大的位點進行后續(xù)檢測（表3）。隨后我們針對篩選后的脫靶預測位點設計引物以進行測序分析，結果顯示所有預測位點測序結果正確（圖4），未發(fā)生脫靶效應造成的基因突變。

圖4 脫靶預測位點測序結果Figure 4 The sequencing results of the predicted off-target sites

表3 小鼠基因組脫靶預測位點序列Table 3 The predicted off-target site DNA sequences in mice

2.5 Nudt3基因敲除小鼠的NUDT3表達水平檢測

為了進一步確認Nudt3 基因敲除小鼠的可靠性，選取經PCR 鑒定獲得的野生型和基因敲除純合小鼠，用RT-PCR 和Western blot 檢測其mRNA 和蛋白水平的表達情況。提取野生型和敲除小鼠不同組織（嗅球、下丘腦、海馬、丘腦、中腦、小腦、腦橋、胰腺、腎、睪丸、肌肉、棕色脂肪和白色脂肪等）的總RNA，在敲除位點兩側設計引物（表1），通過RTPCR 鑒定不同組織中的基因表達情況。Nudt3基因敲除小鼠各組織的mRNA RT-PCR 產物電泳條帶顯示，Nudt3 基因敲除小鼠電泳條帶與野生型電泳條帶相比缺失100 bp 左右，測序比對后發(fā)現(xiàn)Nudt3基因敲除小鼠mRNA RT-PCR 產物比野生型缺失112 bp，表明Nudt3 基因在多個組織敲除成功（圖5A）。

提取野生型和敲除小鼠不同組織（下丘腦、大腦皮層、肝臟和心臟）的蛋白后，通過Western blot鑒定不同組織中的表達情況。結果顯示，基因敲除小鼠的多個組織中無NUDT3蛋白表達（圖5B）。該結果與RT-PCR的結果一致，驗證了Nudt3基因的敲除效果，證明Nudt3基因全身敲除小鼠模型構建成功。

圖5 小鼠Nudt3 mRNA和NUDT3蛋白表達水平Figure 5 The expression of Nudt3 mRNA and NUDT3 in mice

3 討論

本研究對Nudt3基因在小鼠腦組織和外周代謝器官的表達進行了檢測，結果顯示該基因在機體各組織中廣泛表達，提示Nudt3 基因可能在多個組織中發(fā)揮作用。中樞神經系統(tǒng)中的下丘腦是調控全身能量代謝的總中樞，因此是本研究重點關注的對象。相對于其他腦組織，Nudt3 基因的表達在下丘腦中的表達并不是最高。但是在高脂飲食誘導下，Nudt3基因的表達顯著下降，提示Nudt3基因在下丘腦中可能發(fā)揮著重要作用。此外，我們在腎臟、肝臟和脂肪組中，均發(fā)現(xiàn)Nudt3 基因在高脂肪誘導下有顯著的表達差異，提示其可能在能量代謝中發(fā)揮重要作用，值得進一步研究。因此，構建Nudt3基因敲除小鼠具有重要的學術研究價值。

CRISPR/Cas9 技術是目前發(fā)展迅速，并廣泛應用的基因編輯技術［10］。相對于鋅指核酸酶（zincfinger nucleases，ZFN）和轉錄激活因子樣效應物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN），CRISPR/Cas9技術設計簡單且脫靶效應相對較?。?1］，已經成為了最常用的基因編輯技術，目前已被廣泛應用于構建基因編輯小鼠模型［16-19］。本研究利用CRISPR/Cas9 技術設計原理，在Nudt3 基因的第2個外顯子區(qū)域設計了2對gRNA，該設計有利于增加基因的編輯效率。通過向小鼠受精卵中顯微注射Cas9蛋白和gRNA，并進行胚胎移植后，我們獲得了多個新生小鼠?；驕y序結果顯示靶位點有多個缺失或者插入等基因編輯現(xiàn)象。該結果是典型的基因編輯后多種基因型細胞嵌合的現(xiàn)象。由于基因編輯發(fā)生在胚胎發(fā)育的早期，生殖細胞有類似的嵌合現(xiàn)象，通過進一步育種可以獲得單一基因型的基因編輯動物。后續(xù)的檢測證實了這一點，本研究獲得了單個基因編輯型的小鼠。CRISPR/Cas9技術存在的一個問題是脫靶效應導致的錯誤位置基因編輯［12-15］，我們對可能的2 個脫靶區(qū)域進行了測序分析，沒有發(fā)現(xiàn)脫靶現(xiàn)象，表明脫靶效應在本研究構建的小鼠中概率較低。按照遺傳學理論，移碼突變可以導致蛋白質氨基酸序列改變，氨基酸序列錯誤的蛋白可以導致蛋白功能喪失。因此，我們選擇發(fā)生移碼突變的基因編輯動物作為基因敲除小鼠模型，并在后續(xù)實驗中，對Nudt3基因移碼突變的基因敲除小鼠進行Nudt3基因表達檢測。結果顯示，Nudt3 基因敲除鼠的多個組織中Nudt3 基因的mRNA 轉錄和剪切產生了變異，Western blot結果顯示Nudt3基因敲除鼠的多個組織中均檢測不到NUDT3 表達，表明Nudt3 基因已被成功敲除。目前國內外對該基因在肥胖中的作用以及調控機制研究較少，本研究成功構建的Nudt3 基因敲除小鼠為后續(xù)的Nudt3基因在肥胖發(fā)生中的功能和機制研究提供了理想的動物模型。