周小蓉，陸 霞，李建濤，闕玲琍，李躍華

南京醫(yī)科大學(xué)心血管病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 211166

基因表達(dá)的調(diào)控大多數(shù)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄過程中，mRNA 的穩(wěn)定性、定位和可翻譯性在這一過程發(fā)揮重要作用［1］。3′非翻譯區(qū)（3′-untranslated region，3′-UTR）是mRNA非編碼區(qū)的一部分，其堿基長度從編碼區(qū)末端的終止密碼子延伸至多聚A尾巴（poly A）的前端［2］，3′-UTR 包含大量的調(diào)控元件，具有調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性、定位、翻譯以及介導(dǎo)蛋白與蛋白的相互作用等功能［3-4］，通過3′-UTR 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)對維持細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)非常重要。

Toll 途徑進(jìn)化保守信號介導(dǎo)因子ECSIT（evolutionarily conserved signaling intermediate in Toll pathways，ECSIT）是Toll 樣受體/白介素-1 受體（Toll-like receptors/interleukin-1 receptor，TLRs/IL-1R）信號通路中高度保守的信號分子，在先天免疫、胚胎發(fā)育和線粒體相關(guān)功能中發(fā)揮重要作用［5-7］。Toll 樣受體識別病原體相關(guān)分子模式并通過轉(zhuǎn)化生長因子激酶1（TGF beta-activated kinase 1，TAK1）或有絲分裂原/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶激酶1（mitogen/extracellular signal-regulated kinase kinase 1，MEKK-1）激活NF-κB和AP-1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)炎癥信號的激活，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）是這兩個級聯(lián)下游信號分子。在應(yīng)激條件下，ECSIT 與TRAF6結(jié)合，參與NF-κB 信號與MEKK-1 的信號通路調(diào)控［5］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）超家族的成員。在BMP 通路中，ECSIT 可以作為Smad1 和Smad4 的輔助因子，并與特定BMP靶基因（如Tlx2）的啟動子結(jié)合，在小鼠的胚胎發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用，且ECSIT 敲除小鼠具有胚胎致死性［6］。此外，ECIST 與分子伴侶NDUFAF1 相互作用并參與線粒體復(fù)合物Ⅰ的組裝，沉默ECSIT 的表達(dá)可導(dǎo)致線粒體復(fù)合物Ⅰ組裝嚴(yán)重?fù)p傷，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體功能紊亂［7］。已有研究報道，ECSIT在成年小鼠骨骼肌、肝臟、腎臟和心臟中均有表達(dá)［5］。但是，ECSIT 的表達(dá)受哪些因素調(diào)控，尤其是在翻譯水平上的調(diào)控尚不清楚。

在真核生物中，長為20～30 個核苷酸的非編碼RNA 分子已成為基因組表達(dá)和功能的關(guān)鍵調(diào)控因子，根據(jù)其作用模式不同，其主要被分為兩類，即微小RNA（microRNA，miRNA）和小干擾RNA（siRNA）［8］。miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度為20～24個核苷酸的非編碼單鏈RNA，可在多種生物過程中調(diào)控基因表達(dá)，包括發(fā)育、細(xì)胞分化、脂肪代謝和生長控制［9］。轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的抑制方法包括抑制翻譯和mRNA 的剪切，miRNA 可直接與靶mRNA的3′-UTR序列互補結(jié)合，通過去烯化作用對靶mRNA 進(jìn)行非切割降解，起到翻譯抑制作用［10-11］。RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是一種內(nèi)源性RNA 干擾途徑，通過精確調(diào)控基因表達(dá)，為調(diào)控細(xì)胞信號通路提供了強大的機(jī)制，作為RNAi 復(fù)合物的一個組成部分，siRNA 能夠沉默具有互補序列的特定基因的表達(dá)［12］。ECSIT mRNA 的3′-UTR 作為其mRNA的重要組成部分，可能與miRNA 或siRNA 結(jié)合，引導(dǎo)ECSIT mRNA 發(fā)生翻譯受阻或降解，從而引起下游信號通路的改變。目前，通過干預(yù)ECSIT 3′-UTR從而調(diào)節(jié)ECSIT 的表達(dá)尚無文獻(xiàn)報道。因此，本研究使用3′RACE 技術(shù)克隆得到ECSIT 3′-UTR 的序列，并觀察miRNA 和siRNA 對細(xì)胞中ECSIT 表達(dá)的影響，以驗證調(diào)控ECSIT mRNA 翻譯表達(dá)的序列區(qū)域，為后續(xù)從分子水平探明ECSIT 的作用機(jī)制及其在心血管疾病等防治方面的開發(fā)應(yīng)用奠定良好的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

C57BL/6J 小鼠為SPF 級（購自南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實驗動物基地并飼養(yǎng)于此基地），研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：IACUC 2008005）。

反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimerScriptTMRT、pMD-18T 載體、DL1000 Marker（TaKaRa 公司，日本）；氨芐青霉素（上海生光公司）；凝膠回收試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞（北京天根生化）；Taq 酶（NEB 公司，美國）；LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司，美國）；ECSIT 抗體（Abcam 公司，美國）；GAPDH抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG（上海碧云天生物有限公司）；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國）；胎牛血清（BI 公司，以色列）。PCR 儀、mini PROTEAN 3cell 電泳儀（Bio-Rad 公司，美國）；SSC-24P 空氣恒溫?fù)u床（江蘇太倉實驗設(shè)備廠）；AE-100電子分析天平（METTLER公司，瑞士）；臺式離心機(jī)（Heraeus公司，德國）。

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫里的小鼠ECSIT 基因序列設(shè)計合成引物，測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。引物序列為3′Adaptor：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTT -TTTTT-3′，3′Adaptor MN：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTT -TTTMN-3′，3′musECSIT-F：5′-ATGAGTTTGACGTGGATGAA-3′，3′Nested-primer：5′-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3′。

1.2 方法

1.2.1 3′RACE實驗

使用TRIzol 法提取小鼠總RNA，再參照Prime-ScriptTMRT 試劑盒說明書方法將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。具體步驟為：①去除基因組DNA。5 × gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，Total RNA（1 000 ng），RNase Free dH2O 補齊，42 ℃2 min。②反 轉(zhuǎn) 錄。PrimeScriptRT Enzyme Mix I 2 μL，5×PrimeScript Buffer（for real time）4 μL，步驟①的反應(yīng)液10 μL，3′Adaptor、3′Adaptor MN 各1 μL，RNase Free dH2O 3 μL，反應(yīng)條件為42 ℃30 min，85 ℃5 s，4 ℃保存。③PCR及其產(chǎn)物鑒定回收。使用逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 為模板，以musECSIT F 作為外側(cè)上游引物，3′Nested-Primer 為下游引物和Taq 酶進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

1.2.2 目的片段T載體克隆及序列分析

3′RACE 擴(kuò)增條帶切膠回收，連接于pMD18-T載體（具體操作參照產(chǎn)品說明書），轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，菌落PCR 鑒定的陽性克隆樣品送測序。經(jīng)過以上步驟，獲得ECSIT 3′下游未知序列，將堿基序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫做BLAST比對。

1.2.3 miRNA和siRNA的設(shè)計和合成

使用TargetScan 軟件預(yù)測ECSIT 基因潛在結(jié)合的miRNA，其中miR-7-5p（序列為3′-UGUUGUUUUAGUGAUCAGAAGGU-5′）和miR-296-5p（序列3′-UGUCCUAACUCCCCCCCGGGU-5′）預(yù)測可能與ECSIT 3′-UTR的序列結(jié)合，因此將2種miRNA序列交由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成。根據(jù)3′RACE 實驗結(jié)果及NCBI 數(shù)據(jù)庫中ECSIT 的序列設(shè)計4個干擾不同序列的siRNA，它們干擾ECSIT靶基因段為siRNA1：5′-GCCACGTGGACTTCATCTA-3′，位于第601～619 個堿基；siRNA2：5′-GCCTGATCTCAGTGCTAAA-3′，位于第992～1 009 個堿基；siRNA3：5′-GGAAGATGATGAGGCCATT-3′，位 于 第1 547～1 565 個堿基；siRNA4：5′-GTAATAAGTGCGTCTATTA-3′，位于第1 547～1 565 個堿基，siRNA均交由廣州銳博生物技術(shù)有限公司設(shè)計并合成。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮中取出RAW264.7細(xì)胞和Hepa1-6細(xì)胞，迅速在37 ℃水浴鍋中搖晃，融化后轉(zhuǎn)移至預(yù)先裝好培養(yǎng)基的離心管內(nèi)，500 r/min 4 ℃離心5 min，棄上清，加入含有10%血清的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行重懸后種板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿皿底80%～90%時，進(jìn)行傳代，每48 h換1次完全培養(yǎng)基。

1.2.5 miRNA和siRNA轉(zhuǎn)染

將siRNA 和miRNA 配成濃度為20 μmol/L 的儲液，并分裝凍存于-80 ℃冰箱。密度為30%～50%的細(xì)胞換新鮮無血清和不含雙抗的DMEM培養(yǎng)基，使用LipofectamineTM2000，按照說明將50 nmol/L 的siRNA 和miRNA 轉(zhuǎn)染至RAW264.7 細(xì)胞和Hepa1-6細(xì)胞，4 h 后換完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)36 h 后進(jìn)行下一步實驗。

1.2.6 蛋白免疫印跡（Western blot）

提取細(xì)胞總蛋白并使用BCA法測定其濃度，加5×加樣緩沖液后99 ℃煮5 min 使蛋白變性，再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后使用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，將膜置于TBS-T 配制的5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1 h，TBS-T 清洗膜3 次，加入一抗置于4 ℃搖床孵育過夜，次日回收一抗，TBST清洗膜3次，二抗室溫孵育1.5 h，清洗膜3次后，使用ECL顯色液曝片，采用Image Lab圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism5軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。使用單因素方差分析（one-way ANOVA）方法分析組間變異度，組內(nèi)的兩兩比較采用Tukey 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ECSIT mRNA 3′-UTR的鑒定及測序

ECSIT 的3′RACE-PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測可見陽性條帶（圖1A），凝膠回收擴(kuò)增的片段，克隆于pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，菌落PCR鑒定陽性克?。▓D1B），測序結(jié)果顯示有效序列的長度為346 bp（圖1C）。將序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中ECSIT的mRNA序列進(jìn)行比對，一致率達(dá)到99%。

圖1 3′RACE的克隆鑒定和序列Figure 1 Clone identification and sequence of 3′RACE

2.2 miR-7-5p調(diào)節(jié)小鼠細(xì)胞中ECSIT蛋白的表達(dá)

圖2A 為預(yù)測軟件識別的ECSIT 與miRNA 的互補序列。Western blot 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC 組相比，Hepa1-6細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-7-5p可以明顯抑制ECSIT 的蛋白表達(dá)（P＜0.05，n=3），而轉(zhuǎn)染miR-296-5p對ECSIT的表達(dá)沒有明顯影響（P＞0.05，圖2B），并且在RAW264.7 中觀察到相同的變化趨勢（P＜0.01，圖2C）。以上結(jié)果提示miR-7-5p可能是ECSIT的潛在調(diào)節(jié)因子。

圖2 miR-7-5p抑制Hepa1-6細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞中ECSIT的表達(dá)Figure 2 MiR-7-5p inhibits ECSIT expression in Hepa1-6 cells and RAW264.7 cells

2.3 siRNA干擾小鼠細(xì)胞系中ECSIT蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與NC組相比，在Hepa1-6 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA 1、2 后ECSIT 的表達(dá)顯著下降（P＜0.01，n=3），但siRNA 3、4對其表達(dá)沒有明顯影響（P＞0.05，圖3A）；此外，在RAW264.7中觀察到相同的變化趨勢（P＜0.05，圖3B）。

圖3 siRNA干擾RAW264.7和Hepa1-6細(xì)胞中ECSIT的表達(dá)Figure 3 siRNAs in RAW264.7 and Hepa1-6 cells interfere with the expression of ECSIT

3 討論

本研究采用3′RACE實驗獲得ECSIT 3′-UTR區(qū)域的堿基序列；通過miRNA 及siRNA 干擾實驗發(fā)現(xiàn)，ECSIT 3′-UTR區(qū)域可被miR-7-5p調(diào)控，但siRNA作用于ECSIT 編碼區(qū)更有效率，這可能是由于siRNA 識別靶序列具有高度特異性，而降解首先發(fā)生在相對于siRNA 來說的中間位置，所以這些中央位置的堿基位點就顯得極為重要，一旦發(fā)生錯配就會嚴(yán)重抑制RNAi 的效應(yīng)，相對而言，3′末端的核苷酸序列并不要求與靶mRNA完全匹配［13］。

基因mRNA 3′-UTR 區(qū)域作為轉(zhuǎn)錄后控制的樞紐，是miRNA 和RNA 結(jié)合蛋白（RBPs）的靶點，3′-UTR 介導(dǎo)的信息傳遞可以調(diào)控氨基酸序列中未編碼的蛋白質(zhì)特征，在調(diào)節(jié)生物復(fù)雜性中發(fā)揮重要作用［14-15］。ECSIT 是多個信號通路的關(guān)鍵蛋白，參與先天免疫、炎癥和線粒體功能等多方面的調(diào)節(jié)，ECSIT的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控對研究其分子作用機(jī)制是非常重要的?；驇熘蠩CSIT的序列是預(yù)測的，其3′-UTR 區(qū)域是未知的，這給后續(xù)的一些研究帶來困難。本研究測序所得ECSIT 3′-UTR 長度為346 bp，與基因庫中ECSIT mRNA（XM_011242538.4）的第2 231～2 576堿基序列一致率達(dá)99%。

已有研究報道，當(dāng)miRNA 與mRNA 3′-UTR 序列不完全互補結(jié)合時，主要影響翻譯過程，對mRNA穩(wěn)定性沒有明顯影響；當(dāng)miRNA 與mRNA 3′-UTR序列完全互補結(jié)合時，可能通過特異性切割mRNA抑制翻譯或者導(dǎo)致mRNA 降解［16］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-7-5p 可能在ECSIT 的表達(dá)調(diào)節(jié)中起重要作用，預(yù)測軟件提示miR-7-5p與ECSIT 3′-UTR為不完全序列互補，因此miR-7-5p可能通過影響翻譯過程從而影響ECSIT的表達(dá)。

哺乳動物細(xì)胞中內(nèi)源性RNA干擾通路的存在，使其能夠精確地調(diào)控基因表達(dá)，使用siRNA 療法在治療各種疾病方面取得了重大進(jìn)展［17］。siRNA治療的序列可以根據(jù)編碼靶蛋白的mRNA 序列來確定，一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，siRNA 分子將被并入RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）［18］，siRNA 雙鏈將在RISC 復(fù)合體中分離，5′端更穩(wěn)定的鏈被整合到活性的RISC復(fù)合體中，然后siRNA 通過啟動催化性RISC 蛋白，引導(dǎo)RISC 復(fù)合物尋找和剪切目的分子，從而達(dá)到抑制mRNA 表達(dá)的目的［19］。本研究結(jié)果顯示，siRNA1、2 號干擾序列分別為第601～619和第992～1 009堿基，這些區(qū)域可能是調(diào)節(jié)ECSIT mRNA表達(dá)的功能序列。

已有研究報道，脂多糖刺激巨噬細(xì)胞TLR4 受體后，ECSIT 與TAK1、TRAF6 結(jié)合形成內(nèi)源性高分子復(fù)合體，調(diào)節(jié)TAK1的活性，通過影響下游的級聯(lián)信號，促進(jìn)炎癥信號NF-κB的激活［20］。在巨噬細(xì)胞中，Toll樣受體的激活促進(jìn)TRAF6易位至線粒體，在線粒體外周與ECSIT 相互作用，ECSIT 發(fā)生泛素化并在線粒體外周富集，導(dǎo)致線粒體和細(xì)胞活性氧生成增加，有助于巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的清除［21］。此外，ECSIT的缺失導(dǎo)致巨噬細(xì)胞代謝由有氧呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒?，線粒體復(fù)合物Ⅰ的組裝受損、活性下降。線粒體功能障礙時，ECSIT 通過與自噬調(diào)節(jié)因子Parkin結(jié)合并發(fā)生泛素化，導(dǎo)致線粒體自噬受損［22］。以上研究表明ECSIT在炎癥相關(guān)Toll樣受體信號級聯(lián)和線粒體功能中發(fā)揮重要作用。

心力衰竭的機(jī)制是復(fù)雜和多樣的，研究發(fā)現(xiàn)，TLR4 受體信號的激活通過促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生和基質(zhì)降解，促進(jìn)心肌梗死后左室不良心室重構(gòu)發(fā)生發(fā)展［23］。健康小鼠心臟駐留的巨噬細(xì)胞約占心肌非心肌細(xì)胞群的6%～8%，抑制巨噬細(xì)胞招募并中和巨噬細(xì)胞破壞性的促炎功能，可以促進(jìn)衰竭心臟的恢復(fù)［24］。線粒體功能障礙是心力衰竭發(fā)展的一個關(guān)鍵因素，線粒體通過氧化磷酸化維持心肌收縮所必需的能量，心力衰竭時期線粒體功能障礙，導(dǎo)致能量代謝障礙，活性氧釋放增加，加重心力衰竭后的心臟損傷［25］。這些結(jié)果提示ECSIT在心力衰竭中可能發(fā)揮重要作用，需要進(jìn)一步的研究證實。本研究獲得了ECSIT 3′-UTR堿基序列，并驗證了miR-7-5p 作為ECSIT 3′-UTR 潛在結(jié)合分子調(diào)控ECSIT 表達(dá)，這可為后續(xù)ECSIT的研究提供分子基礎(chǔ)。