周柳芳 黃達(dá) 黃照河 劉燕 周柳平 何斌 劉文靜

右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣西百色市 533000

冠心病(Coronary Heart Disease，CHD)尤其是急性冠脈綜合征(Acute Coronary Syndrome，ACS)是目前危害人類健康的最主要疾病之一，而后者是心血管疾病的急危重癥之一。目前認(rèn)為，CHD慢性炎癥是導(dǎo)致患者冠狀動(dòng)脈粥樣硬化最重要的機(jī)制，其中Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)[1]、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)[2]、白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)[3]等介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在CHD的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體蛋白家族中的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點(diǎn)的多態(tài)性與CHD的發(fā)病密切相關(guān)，但在不同區(qū)域、不同種族人群間存在巨大差別。本研究就廣西壯族CHD患者的TLR4蛋白表達(dá)水平及其rs4986790A/G、rs4986791C/T位點(diǎn)的基因多態(tài)性與CHD發(fā)病的關(guān)系進(jìn)行研究，旨為評(píng)估不同人群CHD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及患者的靶向治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月至2018年1月在我院行冠狀動(dòng)脈造影(CAG)檢查被確診為CHD的壯族患者245例為CHD組，選取同期在我院住院治療的非CHD壯族患者245例為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)CHD組患者經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影(CAG)檢查確診，對(duì)照組患者根據(jù)臨床表現(xiàn)及B超等相關(guān)檢查確診(其中高血壓患者98例、糖尿病患者103例、其他疾病44例)；(2)壯族，患者及其三代及以上直系親屬均出生并長(zhǎng)期居住于廣西地區(qū)，三代及以上無(wú)與外族通婚情況；(3)患者彼此間無(wú)血緣關(guān)系；(4)患者及其家屬簽署檢測(cè)研究知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)[6-7]：(1)嚴(yán)重感染、惡性腫瘤、罹患嚴(yán)重肝腎疾??；(2)合并其他心臟疾病如先天性心臟病、酒精性心肌病、心臟瓣膜病及擴(kuò)張型心肌病等；(3)曾接受再灌注治療。兩組患者的性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。本研究嚴(yán)格按照國(guó)家人類基因組研究倫理學(xué)準(zhǔn)則和赫爾辛基宣言進(jìn)行，并得到右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

表1 兩組患者的一般資料比較 [ n(%)，x±s ]

1.2 外周血血清TLR4蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 于早晨6:00至7:00抽取研究對(duì)象空腹靜脈血5～10 mL，離心后留取上層血清，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫捎妹嘎?lián)免疫吸附法(ELISA)(試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司)檢測(cè)兩組患者外周血血清TLR4蛋白表達(dá)水平。

1.3 外周血TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè) 研究對(duì)象采血前夜22:00后禁食，次日早晨6:00至7:00抽取空腹靜脈血約2 mL置于EDTA抗凝管內(nèi)。(1)采用DNA血液提取試劑盒提取外周血DNA，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司)。(2) 采用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因片段，TLR4基因rs4986790A/G和rs4986791C/T序列來自NCBI GenBank，引物采用Primer3軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程股份有限公司合成。TLR4基因rs4986790A/G上游引物：5′-TCCATCGTTTGGTTCTGGGAGA-3′，下游引物：5′-TCACACTCACCAGGGAAAATGAAGA-3′；rs4986791C/T上游引物：5′-CCAACAAAGGTGGGAATGCTTTT-3′，下游引物：5′- TGCTGGAAATCCAGATGTTCTAGTTG-3′。10 μL PCR反應(yīng)體系：1GC-I buffer，3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP，1 U HotStarTaq polymerase，1 μL樣本DNA和1 μL多重PCR引物。PCR循環(huán)程序：95℃預(yù)變性 2 min，94℃變性20 s，65℃退火40 s，72℃延伸1.5 min，重復(fù)11個(gè)循環(huán)；之后94℃變性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，重復(fù)24個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min，產(chǎn)物置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?0 μL PCR產(chǎn)物，加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶純化后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(3)取0.5 μL純化后的延伸產(chǎn)物上ABI3730XL測(cè)序儀，采用GeneMapper 4.1 (AppliedBiosystems Co.，Ltd.，USA) 分析軟件進(jìn)行分析(由上海天昊生物科技有限公司協(xié)助完成)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料用%表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；正態(tài)分布的計(jì)量資料用x±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者的血清TLR4蛋白表達(dá)水平比較 CHD組患者、對(duì)照組患者的血清TLR4蛋白平表達(dá)水平分別為(4.24±1.54)ng/mL和(1.07±0.43)ng/mL，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t′=31.033，P<0.05)。見圖1。

圖1 CHD組患者和對(duì)照組患者血清TLR4蛋白表達(dá)水平的散點(diǎn)柱狀圖

2.2 兩組患者外周血TLR4基因rs4986790A/G位點(diǎn)的多態(tài)性分布情況比較 CHD組患者、對(duì)照組患者TLR4基因rs4986790A/G位點(diǎn)的等位基因均為野生型A，未見突變型G；兩組患者TLR4基因rs4986790A/G位點(diǎn)的基因型均為 AA純合子。見圖2。CHD組患者與對(duì)照組患者TLR4基因rs4986790A/G位點(diǎn)的等位基因及基因型頻率分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

圖2 患者外周血TLR4基因rs4986790A/G位點(diǎn)測(cè)序圖

表2 兩組患者外周血TLR4基因rs4986790A/G位點(diǎn)的多態(tài)性分布情況比較

2.3 兩組患者外周血TLR4基因rs4986791C/T位點(diǎn)的多態(tài)性分布比較 在CHD組和對(duì)照組490例患者中，在TLR4基因rs4986791C/T位點(diǎn)僅檢測(cè)到1例突變型T，基因型為CT雜合子(對(duì)照組患者)，其余489例患者的基因型均為野生型C。見圖3。CHD組患者與對(duì)照組患者TLR4基因rs4986791C/T位點(diǎn)的等位基因及基因型頻率分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

圖3 患者外周血TLR4基因rs4986791C/T位點(diǎn)測(cè)序圖

表3 兩組患者外周血TLR4基因rs4986791C/T位點(diǎn)的多態(tài)性分布情況比較

2.4 不同地區(qū)人群TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點(diǎn)的多態(tài)性分布情況比較 與人類基因組計(jì)劃(Hapmap)公布的非洲人、歐洲人、日本人、印度人、北京人的TLR4基因多態(tài)性頻率分布的數(shù)據(jù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)比較發(fā)現(xiàn)，中國(guó)廣西壯族、中國(guó)北京、日本、歐洲、非洲、印度人群TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點(diǎn)的基因型及等位基因的分布情況比較。見表4、表5。

表4 不同地區(qū)人群TLR4基因rs4986790A/G位點(diǎn)的基因型及等位基因分布情況比較 [n(%)]

表5 不同地區(qū)人群TLR4基因rs4986791C/T位點(diǎn)的基因型及等位基因分布情況比較 [ n(%)]

3 討 論

TLRs是模式識(shí)別受體家族的重要成員之一，能特異性識(shí)別病原相關(guān)的分子模式 (PAMPs)，誘導(dǎo)炎性介質(zhì)、趨化細(xì)胞因子、刺激分子的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)炎癥介質(zhì)的合成和釋放等一系列級(jí)聯(lián)免疫炎性反應(yīng)，參與感染、內(nèi)分泌代謝疾病、自身免疫性疾病、腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程[8-10]。動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎性疾病，TLR4作為機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)中重要的一環(huán)，可通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IL、TNF等多種生物活性因子，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管平滑肌細(xì)胞增生及成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)，介導(dǎo)及加速動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的形成及發(fā)展，導(dǎo)致冠心病(CHD)發(fā)生[11-12]。

TLR4基因有多個(gè)位點(diǎn)(如rs11536889、rs1927911、rs4986790、rs4986791、rs752998、rs2149356等)，與感染、腫瘤、炎癥性腸病、心血管疾病等多種疾病的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)[13-16]。Guven等[17]報(bào)道，土耳其人TLR4基因rs4986790、rs4986791位點(diǎn)的多態(tài)性與CHD的發(fā)病無(wú)明顯關(guān)系；Ameziane等[18-19]研究發(fā)現(xiàn)，rs4986790位點(diǎn)的多態(tài)性與AS、急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)等缺血性心血管病的發(fā)病相關(guān)，突變型G等位基因能降低缺血性心血管病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。李順東等[20-21]報(bào)道，rs4986791位點(diǎn)的多態(tài)性與CHD的發(fā)病易感性相關(guān)，在CHD患者中野生型C等位基因頻率較高。Di Nisio等[22]報(bào)道，TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點(diǎn)突變等位基因攜帶者的膽固醇水平低于不攜帶者，AS、CHD等心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較低，可能是AS、CHD發(fā)生發(fā)展的保護(hù)因素。

本研究結(jié)果顯示，CHD組患者的血清TLR4蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，提示TLR4基因與廣西壯族人群CHD發(fā)病有明顯相關(guān)性。本研究中490例患者TLR4基因rs4986790A/G位點(diǎn)的等位基因均為野生型A，未見突變型G，基因型均為AA純合子；在TLR4基因rs4986791C/T位點(diǎn)僅檢測(cè)到1例突變型T等位基因，基因型為CT雜合子(對(duì)照組患者)，其余489例患者的基因型均為CC純合子，兩組患者的rs4986790A/G、rs4986791C/T位點(diǎn)的基因型和等位基因分布情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示廣西地區(qū)壯族人群TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點(diǎn)突變的可能較為罕見，TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點(diǎn)與壯族人群CHD發(fā)病易感性的相關(guān)性可能較弱。通過對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，中國(guó)廣西、中國(guó)北京、日本、歐洲、非洲、印度人群的TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點(diǎn)的基因型及等位基因分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點(diǎn)的多態(tài)性分布情況在不同地區(qū)及不同人群中存在較大的差異。

綜上所述，廣西壯族人群外周血TLR4的表達(dá)水平與CHD患者的發(fā)病存在關(guān)聯(lián)，但TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點(diǎn)的多態(tài)性可能與壯族人群CHD發(fā)病無(wú)明顯的相關(guān)性。不同地區(qū)、不同種族人群TLR4基因rs4986790A/G、rs4986791C/T位點(diǎn)的多態(tài)性分布情況存在顯著差異。