殷夢瑤 陳 功 羅海華 彭金劍 高 欣 袁長凱 湯飛宇

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點實驗室，江西南昌 330045)

我國是棉花主要生產(chǎn)國和消費國，且棉花是經(jīng)濟價值較高的作物，提高棉花的產(chǎn)量對增加棉農(nóng)收入、促進我國紡織業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有十分重要的意義[1]。植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(激素和生長調(diào)節(jié)劑)是調(diào)控棉花優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的主要技術(shù)手段。激素與棉花生長發(fā)育關(guān)系密切，植物激素影響棉花花芽分化[2]、葉片衰老[3]、側(cè)根形成[4]、纖維發(fā)育[5]等，從而廣泛參與到棉花的生長發(fā)育、形態(tài)建成、生理生化代謝和逆境響應(yīng)等各方面。研究發(fā)現(xiàn)較高的赤霉素(gibberellic acid，GA3)、脫落酸(abscisic acid，ABA) 含量及GA3/吲哚乙酸(indoleacetic acid，IAA)、ABA/IAA 比值，均有利于棉花的發(fā)芽分化[6－7]。水楊酸(salicylic acid，SA)、縮節(jié)胺(mepiquat chloride，DPC)、乙烯利等多種植物生長調(diào)節(jié)劑在棉花生產(chǎn)上也得到了廣泛的使用，如應(yīng)用于緩解非生物脅迫[8]、化學(xué)封頂[9－10]、催熟脫葉[11]、株型控制[12]等。

棉花是世界上最重要的纖維作物。棉纖維由胚珠外表皮細(xì)胞分化發(fā)育形成，其發(fā)育過程可分為起始、伸長、次生壁增厚和脫水成熟4 個時期[13]。研究表明，IAA 參與了棉纖維的早期發(fā)育，在開花當(dāng)天幼嫩的棉胚珠和纖維中IAA 水平高，而隨后8 d 急劇下降[14－15]；且IAA 在棉花開花當(dāng)天的纖維起始細(xì)胞中有高濃度的積累，在纖維細(xì)胞起始期提高胚珠外表皮內(nèi)源IAA 的水平能夠增加纖維細(xì)胞的數(shù)量[16]。棉纖維組分中纖維素的占比達(dá)90%以上，而蔗糖是纖維素合成的最初底物，蔗糖代謝是棉鈴發(fā)育的重要代謝過程[17－18]；另外，棉籽的成分以脂肪和蛋白質(zhì)為主，二者的合成均需要蔗糖代謝提供碳骨架和能量來源[19]。目前已有研究表明，蔗糖代謝關(guān)鍵酶可通過參與棉纖維發(fā)育進而影響纖維品質(zhì)的形成[20－22]，但有關(guān)其對棉胚珠發(fā)育的影響及與棉籽性狀形成關(guān)系的研究相對較少。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶可通過催化蔗糖分解產(chǎn)生的葡萄糖驅(qū)動種胚早期的核分裂，而蔗糖合成酶(sucrose synthase，SS)可通過提供尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose，UDPG)促進種胚細(xì)胞壁的合成[23－24]。適度晚播導(dǎo)致開花后5 d 棉胚珠酸性轉(zhuǎn)化酶活性和隨后己糖濃度的升高，促進細(xì)胞分裂，有利于棉籽增大[25]。盡管內(nèi)源IAA 參與了棉鈴或棉纖維早期的發(fā)育過程[16，26－27]，但有關(guān)外源IAA 處理對棉花重要產(chǎn)量因子單鈴重和衣分等的影響以及IAA 如何通過調(diào)控棉鈴蔗糖代謝而影響棉鈴產(chǎn)量性狀的機理尚不明確。本研究以陸地棉品系A(chǔ)201 為材料，利用IAA涂抹發(fā)育初期的棉鈴，研究對棉花胚珠纖維細(xì)胞的啟動、棉鈴蔗糖代謝及產(chǎn)量性狀的影響，旨在為IAA 調(diào)控棉花產(chǎn)量形成提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗地概況

試驗材料為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花課題組自育的陸地棉品系A(chǔ)201，長期自交保純，遺傳性狀穩(wěn)定。試驗于2017年在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)科技園進行，供試土壤為紅壤旱地，pH 值5.6、有機質(zhì)23.0 g·kg－1、水解氮85.8 g·kg－1、有效磷58.6 g·kg－1、速效鉀170.4 g·kg－1，冬季空閑。

1.2 試驗設(shè)計

參照Seagull 等[27]確定IAA 處理的濃度為0.1 mg·L－1。于棉花開花結(jié)鈴盛期掛牌標(biāo)記中部果枝內(nèi)圍果節(jié)開花前1 d 的花苞，在花萼處輕輕纏繞吸水紙以便液體被吸收，每朵花滴0.1 mg·L－1IAA 工作液10 滴，連續(xù)滴至開花后2 d(計4 d)，并以滴去離子水作為對照。每小區(qū)處理100 朵花。田間試驗隨機區(qū)組排列，小區(qū)面積30.8 m2，3 次重復(fù)，4 行區(qū)，行長7.7 m，行距1.0 m，株距0.3 m。四周設(shè)置保護行，試驗采用營養(yǎng)缽育苗移栽。全生育期施純N:276 kg·hm－2、P2O5:105 kg·hm－2、K2O:247.5 kg·hm－2。按常規(guī)高產(chǎn)栽培措施進行管理，合理灌溉和施肥，及時防除病蟲草害。

IAA 處理后，每小區(qū)分別于開花后10、20、30、40 d取無病蟲害且發(fā)育正常的棉鈴10 個，用冰盒帶回室內(nèi)，經(jīng)液氮速凍后在冰塊上將棉鈴迅速分離成鈴殼、纖維和種子，種皮和種胚的分離是從開花后20 d 開始。分離的纖維、種皮和種胚一部分作鮮樣及時保存于－80℃超低溫冰箱中，用于測定蔗糖代謝關(guān)鍵酶:SS、蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，SPS)、液泡轉(zhuǎn)化酶(vacuole invertase，VIN)和細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶(cell wall invertase，CWIN)的活性；另一部分將其殺青烘干至恒重，烘干樣品研磨后過20 目篩用于非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉)含量的測定。為了解IAA 處理對棉花胚珠外表皮細(xì)胞突起的影響，取開花當(dāng)天下午的棉花胚珠觀察球狀突起(纖維原始細(xì)胞)數(shù)量并計算其密度。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 葡萄糖、果糖和蔗糖含量測定 葡萄糖、果糖和蔗糖的提取采用陳功等[28]的方法。葡萄糖含量的測定采用酶比色法[29]，蔗糖、果糖含量的測定采用間苯二酚法[30]。

1.3.2 淀粉含量測定 將1.3.1 經(jīng)乙醇溶液提取后的殘渣烘干至恒重，用于淀粉提取[28]，采用蒽酮法測定淀粉含量[30]。

1.3.3 蔗糖代謝關(guān)鍵酶活性測定 粗酶液的提取參照陳功等[28]的方法。采用UDPG 和果糖比色法測定SS 和SPS 活性[30]，采用二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid，DNS)比色法測定VIN 和CWIN 活性[22]。

1.3.4 棉胚珠外表皮纖維細(xì)胞突起的觀察和計數(shù)參照Taliercio 等[31]和Romano 等[32]的方法并作改進。用鑷子小心取出棉鈴的完整胚珠，在解剖顯微鏡下沿種脊縱切成兩半，暫時放在含有0.01 mol·L－1磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS，pH 值7.2)的1.5 mL 離心管(4℃存放)中；統(tǒng)一將縱切后的胚珠轉(zhuǎn)移至含有12.5 μg·mL－13，3’－二己基含氧碳菁碘化物[3，3′-Dihexyloxacarbocyanin iodide，DiOC6(3)]的0.01 mol·L－1PBS 緩沖液中，搖勻后在室溫黑暗條件下染色30 min。之后使用PBS 緩沖液沖洗3 次，放置于載玻片上，滴加1 ∶1混合液(甘油∶PBS 緩沖液)沒過樣品，在熒光顯微鏡下觀察。取胚珠4 個代表性部位(脊突、合點端、胚珠中部、近珠孔1/4 處)截矩形圖框計數(shù)，重復(fù)3 次，以4 個部位纖維細(xì)胞密度的平均值作為胚珠表面纖維突起的平均密度:

式中，F(xiàn)D 為纖維密度，個·mm－2，X 為矩形框內(nèi)纖維細(xì)胞數(shù)；Y 為矩形框面積；M 為比例尺代表的實際長度；N 為比例尺長度。

1.3.5 考種計產(chǎn) 棉鈴成熟吐絮后，于9月中下旬集中收獲剩余的處理和對照棉鈴30 個，將其曬干進行室內(nèi)考種。室內(nèi)考種主要考察單鈴重、衣分、衣指、子指、單鈴纖維重、單鈴鈴殼重等。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用獨立樣本t測驗檢測IAA 處理與對照各指標(biāo)平均值的差異。試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010 整理，采用SPSS 20.0 統(tǒng)計分析，使用Origin 8.5 進行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 IAA 處理對棉鈴產(chǎn)量性狀的影響

由表1可知，與對照(去離子水處理)相比，用0.1 mg·L－1IAA 處理陸地棉A201 后，顯著提高了單鈴重，處理組衣分、單鈴纖維重和單鈴種子重高于對照，子指和衣指略低于對照，但均未達(dá)到顯著差異水平。

表1 IAA 對棉鈴產(chǎn)量性狀的影響Table 1 The effect of IAA application on within-boll yield components

2.2 IAA 處理對棉鈴開花當(dāng)天纖維原始細(xì)胞突起密度的影響

如圖1所示，經(jīng)IAA 處理后，開花當(dāng)日棉鈴胚珠外表皮突起的纖維細(xì)胞密度為3 430.56 個·mm－2，而對照僅為3 133.89 個·mm－2，兩者差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。表明吲哚乙酸對纖維細(xì)胞的起始分化具有促進作用。

圖1 開花當(dāng)天棉花胚珠外表皮的纖維細(xì)胞突起Fig.1 Fiber initials on cotton ovule epidermis on the flowering day

2.3 IAA 處理對棉鈴不同部位的碳水化合物的影響

2.3.1 IAA 處理對纖維中碳水化合物的影響 IAA處理下纖維中蔗糖濃度隨棉鈴發(fā)育呈先下降后升高再下降的趨勢，且與對照均無顯著差異(圖2-A)。纖維中非結(jié)構(gòu)性碳水化合物以己糖為主，隨棉鈴發(fā)育其濃度呈下降趨勢，在開花后30 d 時IAA 處理極顯著高于對照，其他取樣時期無顯著差異(圖2-B)。IAA 處理下纖維中淀粉濃度隨棉鈴發(fā)育呈先上升后下降的趨勢，除開花后10 d，總體高于對照，并在開花后30 d 時極顯著高于對照(圖2-C)?？梢?，在開花后30 d 時，IAA 處理后纖維中蔗糖、己糖、淀粉濃度均高于對照，且己糖和淀粉濃度均極顯著高于對照。表明IAA 處理后增加了纖維中碳水化合物的濃度。

圖2 IAA 對纖維中蔗糖(A)、己糖(B)和淀粉(C)濃度的影響Fig.2 Effect of IAA application on the concentrations of sucrose (A)，hexose (B) and starch (C) in cotton fibers

2.3.2 IAA 處理對種胚中碳水化合物的影響 IAA處理后，種胚中蔗糖濃度隨棉鈴發(fā)育總體呈上升趨勢，20～40 d 時，IAA 處理高于對照，且開花后30 d 時達(dá)到顯著差異(圖3-A)。種胚中己糖濃度隨棉鈴發(fā)育總體呈下降趨勢，IAA 處理與對照無顯著差異(圖3-B)。種胚中淀粉濃度隨棉鈴發(fā)育呈先下降(開花后10～20 d)后上升(開花后30～40 d)的變化趨勢，且在開花后30 和40 d 時，IAA 處理顯著高于對照(圖3-C)。表明IAA 處理能夠促進種胚成熟時淀粉的積累。

圖3 IAA 對種胚中蔗糖(A)、己糖(B)和淀粉(C)濃度的影響Fig.3 Effect of IAA application on the concentrations of sucrose (A)，hexose (B) and starch (C) in cotton embryos

2.3.3 IAA 處理對種皮中碳水化合物的影響 由圖4可知，種皮中蔗糖、己糖、淀粉濃度總體均隨棉鈴發(fā)育呈下降趨勢。兩處理種皮中蔗糖、己糖濃度無顯著差異；而IAA 處理種皮中淀粉濃度則均顯著或極顯著高于對照(圖4-C)。表明IAA 處理能夠促進種皮中淀粉的積累。

圖4 IAA 處理對種皮中蔗糖(A)、己糖(B)和淀粉(C)濃度的影響Fig.4 Effect of IAA application on the concentrations of sucrose (A)，hexose (B) and starch (C) in cotton seed coats

2.4 IAA 處理對棉鈴不同部位的蔗糖代謝關(guān)鍵酶活性的影響

2.4.1 IAA 處理對棉鈴不同部位的蔗糖合成酶(SS)活性的影響 IAA 處理后，纖維中SS 活性在纖維發(fā)育早期(開花后10～20 d，纖維伸長階段)呈下降趨勢且明顯低于對照，在開花后20 d 時達(dá)到極顯著差異，此后與對照無顯著差異(圖5-A)。種胚中IAA 處理和對照的SS 活性均隨棉鈴發(fā)育呈上升趨勢，在開花后10 d時IAA 處理略低于對照，之后均高于對照，并在種胚臨近成熟階段(開花后30～40 d)顯著或極顯著高于對照(圖5-B)。種皮中的SS 活性隨棉鈴發(fā)育呈先上升后下降的趨勢，且IAA 處理高于對照，并在種皮生長早中期(開花后20～30 d)顯著或極顯著高于對照(圖5-C)。上述結(jié)果表明IAA 處理能夠提高種胚和種皮的SS 活性。

圖5 IAA 對棉花纖維(A)、種胚(B)和種皮(C)SS 活性的影響Fig.5 Effect of IAA application on sucrose synthase (SS) activities in cotton fibers (A)，embryos (B) and seed coats (C)

2.4.2 IAA 處理對棉鈴磷酸蔗糖合成酶(SPS)活性的影響 隨棉鈴發(fā)育，IAA 處理與對照纖維中SPS 活性無明顯變化，且兩者間無顯著差異(圖6-A)；種胚中的SPS 活性呈先下降后上升的趨勢，開花后30 d 時IAA 處理的SPS 活性顯著高于對照(圖6-B)；種皮中的SPS 活性總體呈下降趨勢，開花后30 d 時IAA 處理的SPS 活性顯著低于對照(圖6-C)。

圖6 IAA 處理對棉花纖維(A)、種胚(B)和種皮(C)SPS 活性的影響Fig.6 Effect of IAA application on sucrose phosphate synthase (SPS) activities in cotton fibers (A)，embryos (B) and seed coats (C)

2.4.3 IAA 處理對棉鈴液泡轉(zhuǎn)化酶(VIN)活性的影響 在棉鈴3 個組分中(纖維、種胚、種皮)，以纖維的VIN 活性最強，但隨纖維發(fā)育呈下降趨勢，在開花后30 d，IAA 處理的VIN 活性顯著低于對照(圖7-A)；兩處理種皮和種胚的VIN 活性隨棉鈴發(fā)育表現(xiàn)趨勢一致，無顯著差異(圖7-B、C)。

圖7 IAA 處理對棉花纖維(A)、種胚(B)和種皮(C)VIN 活性的影響Fig.7 Effect of IAA application on vacuole invertase (VIN) activities in cotton fibers (A)，embryos (B) and seed coats (C)

2.4.4 IAA 處理對棉鈴細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶(CWIN)活性的影響 棉鈴發(fā)育初期CWIN 活性以纖維最高，并隨纖維發(fā)育呈下降趨勢，兩處理間無顯著差異(圖8-A)；種胚中的CWIN 活性隨棉鈴發(fā)育呈先下降后上升的趨勢，且開花后30 d 時IAA 處理極顯著高于對照(圖8-B)；而種皮中兩處理CWIN 活性無顯著差異(圖8-C)。

圖8 IAA 處理對棉花纖維(A)、種胚(B)和種皮(C)CWIN 活性的影響Fig.8 The effect of IAA application on CWIN activities in cotton fibers (A)，embryos (B) and seed coats (C)b

3 討論

3.1 IAA 處理棉鈴對胚珠外表皮纖維原始細(xì)胞突起的影響

單個胚珠著生纖維數(shù)因棉花不同亞種和品種而異，受遺傳和生理因素的影響。棉花纖維由胚珠外珠被上的部分表皮細(xì)胞經(jīng)分化發(fā)育而成，可分化發(fā)育的表皮細(xì)胞比例約為10%至25%[33－34]，因而，增加胚珠外表皮細(xì)胞分化為纖維細(xì)胞的比例，是提高棉花衣分和纖維產(chǎn)量的重要途徑[35]。前人觀察到陸地棉胚珠外表皮纖維細(xì)胞的啟動發(fā)育始于開花當(dāng)天[32，36－37]，但Graves 等[38]發(fā)現(xiàn)在開花前若干日內(nèi)部相關(guān)的生化變化就已發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)施加IAA 使纖維原始細(xì)胞啟動密度在開花當(dāng)天顯著增加(圖1)。Gialvalis 等[26]觀察到IAA 可以促進開花前后胚珠外表皮細(xì)胞分化為纖維細(xì)胞的數(shù)量，其中開花前施用的提高效果好于開花后。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IAA 處理后棉鈴衣分略有提高，可能與IAA 促進胚珠外表皮纖維原始細(xì)胞的啟動有關(guān)。Zhang 等[16]將IAA 生物合成基因iaaM與纖維特異性表達(dá)啟動子FBP7 相連轉(zhuǎn)入棉花后，引起胚珠表皮細(xì)胞IAA 水平的升高，促進纖維原始細(xì)胞的啟動，轉(zhuǎn)基因株系衣分顯著提高，同時子指下降。Li等[39]報道開花當(dāng)天單位面積胚珠纖維細(xì)胞突起的密度和開花后1 d 纖維伸長的密度與衣分呈高度正相關(guān)。但Romano 等[32]認(rèn)為纖維啟動密度不宜用于預(yù)測未來衣分的高低。

3.2 IAA 處理棉鈴對胚珠和纖維蔗糖代謝關(guān)鍵酶活性和非結(jié)構(gòu)性碳水化合物濃度的影響

蔗糖作為植物體內(nèi)碳水化合物運輸?shù)闹饕问?，在棉鈴種皮維管束末端卸載后，被分解成己糖分子或其衍生物，用于合成大分子貯藏物質(zhì)，如纖維中的纖維素，種皮的淀粉及種胚的脂肪等[40]。因此，庫器官蔗糖濃度高，表明大分子物質(zhì)合成的底物豐富，有利于庫器官物質(zhì)合成。本研究檢測到棉鈴開花后20～40 d，相對于對照，IAA 處理的種胚含有更多的蔗糖，其中在開花后30 d 差異達(dá)到顯著水平(圖3-A)；同時，IAA 處理種胚中SPS 活性在開花后30 d 也顯著高于對照(圖6-B)，該酶主要催化UDPG 和6－磷酸果糖合成蔗糖，蔗糖濃度的升高對于種胚脂肪的合成有利。SS 是反映棉花種子庫和纖維庫強度一個重要的生化標(biāo)記，酶活性高意味著庫器官貯藏物質(zhì)合成活性強[40－41]。SS作為庫器官物質(zhì)合成階段催化蔗糖分解的主要酶，活性強有利于庫端蔗糖的卸載，加強蔗糖向庫端的輸出[23，42－43]。Xu 等[43]報道增加棉花胚珠SS 活性可促進早期種子發(fā)育，提高結(jié)子率。本研究表明，開花后30～40 d，IAA 處理種胚SS 活性顯著高于對照(圖5-B)。與SS 和SPS 活性在開花后30 d 的表現(xiàn)相同，IAA 處理的種胚CWIN 活性也顯著提高(圖8-B)。CWIN 能夠促進種子充實，可能通過調(diào)控蔗糖卸載，建立和維持庫強起作用[24]。

棉花種皮富含的淀粉是種皮中非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的主要存在形式[40]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)IAA 處理后，種皮在開花后20～40 d(圖4-C)，種胚在開花后30～40 d(圖3-C)，淀粉濃度均顯著或極顯著高于對照，表明IAA 處理顯著增強了種胚和種皮合成淀粉的能力。種皮中的淀粉可以被分解成己糖，轉(zhuǎn)運到胚中，在棉花胚珠發(fā)育中期階段是一種重要的碳代謝中間產(chǎn)物，可以用于種胚脂肪和蛋白質(zhì)的合成[42]。IAA 處理的種皮SS 活性在開花后20～30 d 呈顯著或極顯著提高(圖5-C)，進一步證實IAA 處理可增強種皮的物質(zhì)合成能力。

IAA 處理后，在開花后30 d 檢測到纖維中己糖和淀粉濃度較對照有極顯著提高(圖2-B、C)。己糖是棉纖維含量最高的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物形式[44]，也是最重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，對驅(qū)動纖維伸長具有重要作用[21]。纖維伸長主要發(fā)生在棉鈴開花后20 d內(nèi)[19]。因此開花后30 d 檢測到的高濃度己糖對纖維伸長可能沒有貢獻(xiàn)。本研究也觀察到經(jīng)IAA 處理的棉鈴纖維長度與對照無顯著差異(數(shù)據(jù)未列出)。與纖維中碳水化合物的表現(xiàn)不同，IAA 處理的棉纖維蔗糖代謝關(guān)鍵酶活性與對照相似或低于對照，如開花后20 d 的SS 活性(圖5-A)和開花后30 d 的VIN(圖6-A)活性，均顯著或極顯著低于對照。VIN 催化蔗糖不可逆分解為葡萄糖和果糖(己糖)，SS 負(fù)責(zé)催化蔗糖可逆分解為UDPG 和磷酸果糖[23－24]。經(jīng)IAA 處理的棉纖維在開花后20～30 d 表現(xiàn)出較低的VIN 和SS 活性，預(yù)計會產(chǎn)生較少的己糖分子，而這與開花后30 d棉纖維較高的己糖濃度相悖。其原因還需要進一步探討。

4 結(jié)論

結(jié)果表明，IAA 涂抹棉鈴后，可促進開花當(dāng)日棉花胚珠外表皮產(chǎn)生更多的纖維細(xì)胞突起，其可能是導(dǎo)致IAA 處理衣分更高的原因。與對照相比，IAA 處理提高了種胚開花后30～40 d 蔗糖合成酶活性，開花后30 d 磷酸蔗糖合成酶活性及種皮開花后20～30 d 蔗糖合成酶活性，相應(yīng)增加了蔗糖和淀粉等非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的濃度，增強了種子庫的物質(zhì)合成能力，有利于種子增大。這可能是導(dǎo)致單鈴重增加的一個重要原因。本研究初步揭示了IAA 影響棉鈴產(chǎn)量性狀形成的蔗糖代謝機理，為IAA 在棉花生產(chǎn)上的應(yīng)用，促進棉花高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)提供了技術(shù)思路。