伍宜杰 孟 瑞 張秀林 王國棟 陳劍杰 曹謹玲

(1山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，山西太谷 030801；2安陽工學院，生物與食品工程學院，河南安陽 455000；3山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山西太谷 030801)

氟化物主要分為無機和有機氟化物，廣泛用于電子電器、醫(yī)藥、冶金、農(nóng)藥、化工等領(lǐng)域，但其相關(guān)產(chǎn)品的大量應(yīng)用也在一定程度上對生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生了負面影響[1－2]。近年來無機和有機氟化物對機體的毒性影響已引發(fā)越來越多的關(guān)注，如李俊駿等[3]研究發(fā)現(xiàn)低劑量氟化鈉暴露能夠引起斑馬魚(Danio rerio)胚胎骨質(zhì)硬化，而高劑量氟暴露會導致斑馬魚胚胎骨質(zhì)疏松，陳劍杰等[4]研究發(fā)現(xiàn)氟化鈉暴露會對鯉魚腎抗氧化酶和Na＋-K＋-ATPase 水平產(chǎn)生負面影響，張晶等[5]研究發(fā)現(xiàn)全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate，PFOS)能夠誘導劍尾魚肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)，姚丹等[6]研究表明PFOS 能夠通過影響物質(zhì)的代謝對斑馬魚肝臟產(chǎn)生毒性效應(yīng)。氟化物會通過各種途徑污染水環(huán)境，據(jù)統(tǒng)計，我國部分地區(qū)地下水中氟含量約是國家生活飲用水衛(wèi)生標準的2～10 倍[7]，長江三峽庫區(qū)江水和武漢地區(qū)地表水中廣泛存在PFOS 污染，個別地區(qū)水樣中PFOS含量大于10 ng·L－1[8]，高于不得檢出的要求。魚類等水生生物終身生活在水體環(huán)境中，比哺乳動物更易受到氟化物污染。有關(guān)氟化物對魚類的毒副作用國內(nèi)外已有一些報道[9－12]。但有關(guān)無機和有機氟化物暴露對水生生物單一及聯(lián)合毒性效應(yīng)比較的研究卻鮮有報道?；诖?，本研究以環(huán)境毒理學主要模式生物斑馬魚為對象，研究無機氟化物氟化鈉(NaF)和有機氟化物PFOS 單一及聯(lián)合暴露下對斑馬魚肝臟組織結(jié)構(gòu)、抗氧化功能及免疫功能的影響，以期為進一步深入研究氟化物對水生生物的毒性效應(yīng)機制提供基礎(chǔ)，并為氟化物的生態(tài)風險評估研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用斑馬魚為AB 品系，由山西農(nóng)業(yè)大學食品毒理學實驗室繁殖飼養(yǎng)，平均體長2.89±0.30 cm，平均體重0.18±0.06 g。PFOS 購自北京索萊寶科技有限公司，NaF 購自天津天大化工實驗廠。

1.2 試驗設(shè)計

雄性斑馬魚360 尾，隨機分為對照組(CK 組)、40 mg·L－1NaF 暴露組(F 組)、0.5 mg·L－1PFOS 暴露組(P 組)、40 mg·L－1NaF＋0.5 mg·L－1PFOS 聯(lián)合暴露組(F＋P 組)，每組30 尾，每個組設(shè)3 個平行。試驗期間充氧泵連續(xù)充氣，每天上、下午各飼喂1 次，投餌量約為體重的1%，每天更換1/2 試驗用水，水溫為25±1℃，溶解氧≥5 mg·L－1，pH 值為7.0～8.0，光照周期14 h(光照)/10 h(黑暗)。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 組織切片的制備 暴露15、30 d 后，各試驗組隨機取3 尾斑馬魚，解剖后取出肝臟組織放入Bouin氏液中固定過夜，常規(guī)石蠟切片方法制作切片后顯微鏡下分析切片并拍照。

1.3.2 硝基藍四氮唑(nitrotetrazolium blue chloride，NBT)陽性細胞數(shù)的測定 暴露15、30 d 后，每個試驗組隨機取12 尾斑馬魚，將其在冰水混合物中麻醉數(shù)秒后，斷尾采血置于抗凝管中備用。按照文獻[13]的方法測定NBT 陽性細胞數(shù):取20 μL 血液滴在蓋玻片上，20℃濕盒內(nèi)放置30 min，然后用pH 值6.4 的磷酸緩沖液(0.067 mol·L－1)緩慢地漂洗蓋玻片以除去紅細胞，隨后滴加20 μL 0.2 g·L－1NBT，將蓋玻片反扣于載玻片上，再次于濕盒內(nèi)放置25 min，然后于顯微鏡下隨機分析6 個視野并計數(shù)，鏡下淺黑色細胞即為NBT陽性細胞。

1.3.3 抗氧化和免疫相關(guān)指標的測定 暴露15、30 d后，各試驗組隨機選取12 尾斑馬魚，于冰塊上解剖取肝臟組織，用4℃生理鹽水清洗后拭去水分，按照1 ∶10(質(zhì)量體積比) 加入4℃磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)后勻漿，3 000 r·min－1離心15 min，取上清液進行抗氧化指標超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、過氧化物酶(peroxidase，POD)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的測定，以及免疫相關(guān)指標酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)活性和溶菌酶(lysozyme，LZM)含量的測定，具體操作步驟依照試劑盒說明書進行，檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 進行單因素ANOVA 分析，如存在顯著差異則采用Duncan’s 法進行多重比較，試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaF 和PFOS 暴露對斑馬魚NBT 陽性細胞的影響

由圖1可知，暴露15 d 后，NaF 暴露組(F 組)、PFOS 暴露組(P 組)和NaF 與PFOS 聯(lián)合暴露組(F＋P組) 的NBT 陽性細胞數(shù)分別較CK 組顯著降低25.58%、22.48%、41.86%，且F＋P 組較F 組和P 組顯著降低，但F 組與P 組之間無顯著差異。暴露30 d后，F(xiàn) 組、P 組和F＋P 組的NBT 陽性細胞數(shù)分別較CK組顯著降低33.91%、37.5%、52.59%，且F＋P 組較F組顯著下降。

圖1 NaF 和PFOS 暴露對斑馬魚血液中NBT 陽性細胞的影響Fig.1 Effects of NaF and PFOS exposure on NBT positive cells in zebrafish blood

2.2 NaF 和PFOS 暴露對斑馬魚肝組織顯微結(jié)構(gòu)的影響

如圖2-a、A 所示，CK 組斑馬魚肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，肝細胞多呈卵圓形，肝細胞界限清晰，肝竇在肝板之間呈網(wǎng)狀分布。暴露15 d 后，F(xiàn) 組和P 組中，斑馬魚肝臟組織出現(xiàn)病理變化，肝細胞排列紊亂，細胞間界限不清晰，結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出異常，肝細胞出現(xiàn)核萎縮現(xiàn)象(圖2-b、c)；F＋P 組中，斑馬魚肝臟組織結(jié)構(gòu)損傷較嚴重，細胞結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出異常，細胞核出現(xiàn)變形萎縮甚至消失，可見肝竇增寬的情況(圖2-d)。暴露30 d 后，F(xiàn) 組和P 組中，斑馬魚肝臟組織出現(xiàn)肝細胞排列紊亂，細胞間界限不清晰且肝竇增寬，細胞核變形萎縮現(xiàn)象較嚴重，甚至消失(圖2-B、C)；F＋P 組中，斑馬魚肝臟組織結(jié)構(gòu)損傷較嚴重，細胞排列紊亂結(jié)構(gòu)異常，細胞核變形萎縮現(xiàn)象增多，核消失的現(xiàn)象較嚴重(圖2-D)。

圖2 NaF 和PFOS 暴露對斑馬魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effects of NaF and PFOS exposure on the liver structure of zebrafish

2.3 NaF 和PFOS 暴露對斑馬魚肝臟抗氧化能力的影響

由圖3可知，與CK 組相比，暴露15、30 d 后，F(xiàn)組、P 組和F＋P 組SOD、CAT 和POD 活性呈下降趨勢，而MDA 含量呈上升趨勢，且與CK 組比較差異均顯著；暴露15 d 后，與F 組相比，F(xiàn)＋P 組CAT 活性顯著下降28.41%，F(xiàn)＋P 組MDA 含量顯著上升35.71%；與P 組相比，F(xiàn)＋P 組SOD 和CAT 活性分別顯著下降11.87%和24.09%，MDA 活性顯著上升38.35%。暴露30 d 后，與F 組相比，P 組和F＋P 組SOD 活性分別顯著下降10.29%和12.31%，MDA 含量分別顯著上升22.94%和15.03%；與P 組相比，F(xiàn)＋P 組CAT 活性顯著下降24.26%。NaF 和PFOS 單一暴露可使肝臟的抗氧化能力下降，而NaF 和PFOS 聯(lián)合暴露具有疊加效應(yīng)。

圖3 NaF 和PFOS 暴露對斑馬魚肝臟抗氧化能力影響Fig.3 Effects of NaF and PFOS expoure on capacity of antioxidant in the liver of the zebrafish

2.4 NaF 和PFOS 對斑馬魚肝臟非特異性免疫力的影響

由圖4可知，與CK 組相比，暴露15 d 后，F(xiàn) 組和P 組的LZM 含量均顯著下降，而AKP 活性均無顯著變化，F(xiàn)＋P 組ACP、AKP 活性以及LZM 含量均顯著下降；與F 組相比，F(xiàn)＋P 組AKP 活性顯著下降16.27%；與P 組相比，F(xiàn)＋P 組AKP 活性、LZM 含量分別顯著下降24.34% 和13.05%。

圖4 NaF 和PFOS 暴露對斑馬魚肝臟非特異性免疫力的影響Fig.4 Effects of NaF and PFOS expoure on capacity of non-specific immunity in the liver of the zebrafish

與CK 組相比，暴露30 d 后，F(xiàn) 組、P 組和F＋P 組的ACP 活性、AKP 活性、LZM 含量均顯著下降，且F＋P 組的下降趨勢加大；與F 組相比，F(xiàn)＋P 組AKP 活性顯著下降10.87%、P 組LZM 含量顯著下降12.85%；與P 組相比，F(xiàn)＋P 組ACP 活性和AKP 活性分別顯著下降10.72%和12.01%。NaF 和PFOS 單一暴露使肝臟的非特異性免疫力降低，且NaF 和PFOS 聯(lián)合暴露具有疊加效應(yīng)。

3 討論

外源污染物的暴露會使機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。生物體在正常情況下自由基的生成和消除處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，但當其受到外源化合物脅迫時，這種平衡可能會被破壞，從而導致體內(nèi)自由基水平增加，產(chǎn)生氧化應(yīng)激造成機體損傷[14－16]。SOD、CAT 和POD 等抗氧化酶具有清除氧自由基的作用，而MDA 是自由基作用于脂質(zhì)引起過氧化反應(yīng)而產(chǎn)生的終產(chǎn)物，均可作為生物受到外源化合物脅迫的指標[4，17－21]。已有研究發(fā)現(xiàn)NaF 和PFOS 暴露可以影響生物體內(nèi)自由基的動態(tài)平衡，從而對抗氧化功能產(chǎn)生負面作用[4，22]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，NaF 和PFOS 單一暴露均會使斑馬魚肝臟SOD、CAT、POD 活性下降，而MDA 含量上升，且存在一定的時間效應(yīng)關(guān)系，這與陳劍杰等[9]和劉征[23]的研究結(jié)果基本相似。這可能是NaF 和PFOS 侵襲機體后擾亂了其氧代謝導致自由基增多，而機體內(nèi)的SOD 要分解增多的超氧化物陰離子自由基轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2和O2，CAT 和POD 分解增多的H2O2，使這些酶活性下降，引起機體清除自由基的能力減弱，導致體內(nèi)自由基積累，脂質(zhì)過氧化增強，MDA 含量升高，且隨暴露時間的延長有加強趨勢，提示NaF 和PFOS 暴露會對斑馬魚肝臟抗氧化功能產(chǎn)生負面效應(yīng)。另外，二者聯(lián)合暴露比單一暴露對斑馬魚肝臟抗氧化功能造成的負面影響更為嚴重，提示二者聯(lián)合暴露對抗氧化功能的毒性影響存在疊加效應(yīng)，但其機理還需要進一步研究。

非特異性免疫在魚類免疫系統(tǒng)中具有舉足輕重的作用，血液中NBT 陽性細胞數(shù)量多少是反映魚類非特異性免疫功能強弱的重要指標之一[24－25]。陳家長等[13]研究發(fā)現(xiàn)水體中污染物能夠降低魚類NBT 陽性細胞數(shù)。本研究也發(fā)現(xiàn)NaF 和PFOS 單一及聯(lián)合暴露處理組的NBT 陽性細胞數(shù)均低于CK 組，且有一定的時間效應(yīng)關(guān)系，二者聯(lián)合組暴露的NBT 陽性細胞數(shù)低于單一暴露組，這表明NaF 和PFOS 單一及聯(lián)合暴露均能影響斑馬魚中性粒細胞和巨噬細胞的吞噬能力，導致其非特異性免疫能力下降，且提示聯(lián)合暴露對NBT 陽性細胞的毒性效應(yīng)存在一定的疊加作用。ACP在體內(nèi)直接參與磷酸基團的代謝，其活性升高有利于促進機體細胞中的物質(zhì)代謝，從而提高其非特異性免疫能力，而AKP 可以催化磷酸單脂的水解及磷酸基團的轉(zhuǎn)化過程，在生物機體免疫防御反應(yīng)中具有重要意義[26－27]。LZM 能夠破壞及消除侵入機體的異物，其含量也是衡量機體免疫狀態(tài)的指標之一[28－29]。本研究也發(fā)現(xiàn)NaF 和PFOS 單一及聯(lián)合暴露對ACP、AKP 活性和LZM 含量均產(chǎn)生負面影響，這與潘若雷[30]研究發(fā)現(xiàn)PFOS 暴露4 d 對三角帆蚌鰓組織AKP 產(chǎn)生毒性效應(yīng)、Guo 等[31]發(fā)現(xiàn)PFOS 能夠?qū)Π唏R魚肝臟免疫相關(guān)酶產(chǎn)生負面影響、王天玉等[32]研究發(fā)現(xiàn)NaF 暴露會導致斑馬魚頭部免疫相關(guān)酶活性受到抑制的研究結(jié)果基本相似。這可能是NaF 和PFOS 暴露對斑馬魚肝臟非特異性免疫功能造成了毒性效應(yīng)，魚體的免疫機能被不斷消耗，導致相關(guān)免疫酶水平的降低；且隨著暴露時間的延長，NaF 和PFOS 暴露時造成的組織細胞損傷大于其免疫能力，使ACP、AKP 活性和LZM 的含量進一步受到抑制。此外，聯(lián)合暴露的抑制作用要強于單一暴露，提示聯(lián)合暴露對斑馬魚肝臟非特異性免疫功能存在疊加抑制作用。肝臟是動物機體重要的解毒和免疫器官，也是容易遭到外源化合物侵襲的組織[33]。陳劍杰等[34]研究表明NaF 短期暴露可對草魚肝臟組織造成損傷，且損傷程度存在劑量依賴效應(yīng)，黨紅蕾等[35]研究發(fā)現(xiàn)PFOS 能對半滑舌鰨肝臟細胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)并使其出現(xiàn)損傷。本研究也發(fā)現(xiàn)NaF 和PFOS 暴露均能構(gòu)成斑馬魚肝臟組織的損傷，且二者聯(lián)合暴露對肝臟組織的損傷程度高于單一暴露。

綜上所述，水體中NaF 和PFOS 單一及聯(lián)合暴露對斑馬魚肝臟組織的抗氧化功能、非特性免疫力及組織結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生了毒性效應(yīng)，且聯(lián)合暴露強于單一暴露，但其機理還需進一步探討。

4 結(jié)論

本研究分析了NaF 和PFOS 單一及聯(lián)合暴露對斑馬魚肝臟組織的抗氧化功能、非特性免疫力及組織結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明水體中NaF 和PFOS 單一暴露能夠?qū)Π唏R魚肝臟組織構(gòu)產(chǎn)生損傷，導致抗氧化指標SOD、CAT、POD 等抗氧化酶活性增高而MDA 含量降低，同時也降低了非特性免疫酶ACP、AKP 和LZM 的能力，且聯(lián)合暴露在一定程度上存在疊加效應(yīng)。