李 娟，馬 麗，張小晴，童 也，李玉云

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一種以未成熟血液細(xì)胞分化障礙且浸潤(rùn)其他器官或組織從而抑制骨髓造血功能為特點(diǎn)的造血祖細(xì)胞惡性增殖性疾病。目前臨床上仍是以傳統(tǒng)的蒽環(huán)類藥物和阿糖胞苷為基礎(chǔ)進(jìn)行治療。近年來，AML病人的總體生存時(shí)間較以往雖然有所提高，但治療策略卻并未發(fā)生太大變化。目前，20～30歲AML病人的3年生存率大約只有30%，而對(duì)于>60歲的老年病人，5年生存率僅有5%左右[1]。AML病人治愈率低、預(yù)后差以及缺乏特異性藥物仍是目前臨床研究亟待解決的難題，因此，可靠的預(yù)后評(píng)估對(duì)治療策略至關(guān)重要。隨著對(duì)AML細(xì)胞遺傳學(xué)及基因改變的不斷認(rèn)識(shí)，細(xì)胞及分子遺傳學(xué)異常逐漸被認(rèn)為是影響AML預(yù)后的重要因素。常見基因突變?nèi)鏦TI基因突變，IDH1/2基因突變、FLT3和TET2基因突變都已被證實(shí)與AML病人的預(yù)后不良高度相關(guān)[2-5]。此外，在AML中，轉(zhuǎn)錄因子RUNX1 被檢測(cè)到發(fā)生突變的概率較大，早在2008就已被WHO作為AML特異性的分子標(biāo)志進(jìn)行單獨(dú)分類[6]。

RUNX1基因是RUNX家族成員之一，位于21號(hào)染色體長(zhǎng)臂(21q22,12)，可與核心結(jié)合因子B(CBF)形成異二聚體復(fù)合物，并與DNA序列發(fā)生相互作用[7]。RUNX1基因作為造血過程中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，參與多種造血基因的表達(dá)調(diào)節(jié)，如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子[8],是人類白血病中多種染色體易位的常見靶點(diǎn)。RUNX1基因突變見于多種血液系統(tǒng)疾病，如急性髓系白血病、骨髓增生異常綜合癥等，且RUNX1突變是AML病人預(yù)后不良的影響因素，RUNX1突變對(duì)AML病人總體生存率的下降具有重要意義[9-10]。本研究從RUNX1突變AML病人和RUNX1未突變AML病人樣本中找出差異基因，結(jié)合樣本對(duì)應(yīng)的臨床信息，將全部的差異基因進(jìn)行Cox回歸分析并進(jìn)一步構(gòu)建預(yù)后基因模型，以期為AML的臨床個(gè)體化治療、預(yù)后判斷及病情監(jiān)測(cè)提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)作報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取 從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NBCI)的基因表達(dá)匯編(GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載數(shù)據(jù)集GSE37642以及其對(duì)應(yīng)的平臺(tái)文件GPL96(Affymetrix Human Genome U133A Array)。基于GPL96平臺(tái)的GSE37642數(shù)據(jù)集中共包含422個(gè)AML病人的組織樣本(骨髓單核細(xì)胞)，提取樣本對(duì)應(yīng)的生存時(shí)間、生存狀態(tài)、是否發(fā)生RUNX1突變等臨床信息。

1.2 數(shù)據(jù)處理 將GSE37642的矩陣數(shù)據(jù)讀入R軟件中，通過平臺(tái)文件GPL96將表達(dá)矩陣的探針信息轉(zhuǎn)換為基因名。多個(gè)探針對(duì)應(yīng)同一個(gè)基因名時(shí)取表達(dá)值最大的探針并對(duì)樣本表達(dá)值做標(biāo)準(zhǔn)化處理(log2對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換)。此外，將缺少RUNX1突變信息的樣本予以剔除，最終得到包含370個(gè)AML組織樣本的表達(dá)矩陣文件(59個(gè)RUNX1突變樣本，311個(gè)未突變樣本)。

1.3 差異表達(dá)分析 上述得到的表達(dá)矩陣文件，按照是否發(fā)生RUNX1突變將樣本分為2組，并通過Limma軟件包從2組樣本中篩選差異表達(dá)基因。Pvalue<0.05和差異倍數(shù)的絕對(duì)值(|log2(Fold Change)|)>0.7為差異基因的篩選條件。

1.4 預(yù)后基因模型的構(gòu)建 從標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)矩陣中提取全部差異基因的表達(dá)量，并與樣本對(duì)應(yīng)的生存時(shí)間、生存狀態(tài)信息合并。將全部的差異基因進(jìn)行單因素Cox回歸分析，并篩選出P<0.05的基因納入到后續(xù)的多因素Cox回歸當(dāng)中。構(gòu)建的多因素Cox回歸模型中，基于雙向逐步回歸法，對(duì)構(gòu)建模型的基因進(jìn)一步的篩選，并用得到的基因構(gòu)建預(yù)后基因模型。

1.5 基因模型評(píng)估 根據(jù)基因模型的公式，計(jì)算每個(gè)樣本的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，并按照中位數(shù)將樣本分為高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組與低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組。對(duì)2組樣本做生存分析并通過未來1、3、5年的ROC曲線對(duì)模型預(yù)測(cè)精度予以評(píng)估。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因 從RUNX1突變組與未突變組中共篩選得到89個(gè)差異基因，其中30個(gè)基因上調(diào)，有BIK、SMYD3、CCNA1、CRIP1等；59個(gè)基因下調(diào)，有SETBP1、DNTT、PTK2、APP等(見圖1)。

2.2 預(yù)后基因模型 基于樣本對(duì)應(yīng)的生存信息，全部的差異基因通過單因素Cox回歸進(jìn)行篩選，得到38個(gè)基因(見圖2)。采用38個(gè)基因構(gòu)建多因素Cox回歸模型，并通過雙向逐步回歸法篩選得10個(gè)基因(見圖3)，包括BIK、APP、MLLT3、C10orf10、PLXNC1、FHL1、CST3、TGLL1、HOXA5、KIAAO125。使用該10個(gè)基因構(gòu)建預(yù)后基因模型，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式為：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=-0.100×(BIK)+0.215×(APP)+-0.232×(MLLT3)+0.112×(C10orf10)+0.160×(PLXNC1)+0.113×(FHL1)+ -0.167×(CST3)+ -0.152×(IGLL1)+ 0.164×(HOXA5)+ 0.084×(KIAA0125)。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式，其中BIK、MLLT3、CST3和IGLL1的風(fēng)險(xiǎn)比小于1，表明這些基因可能是AML預(yù)后保護(hù)因素。而其他6個(gè)基因的風(fēng)險(xiǎn)比大于1，提示這些基因可能是AML預(yù)后危險(xiǎn)因素。預(yù)后基因模型的風(fēng)險(xiǎn)曲線(見圖4)。

2.3 預(yù)后基因模型 基于預(yù)后基因模型，對(duì)高、低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組進(jìn)行生存分析，結(jié)果表明高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組的總體生存率顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組(χ2=14.03，P<0.01)(見圖5)；基于預(yù)后基因模型，采用ROC曲線對(duì)未來1年、3年和5年的總體生存率進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，1年的AUC為0.709，3年的AUC為0.769，5年的AUC為0.771，提示構(gòu)建的模型具有較好的預(yù)測(cè)能力。

3 討論

研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，RUNX家族參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如RUNX1在造血調(diào)控以及血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用；RUNX2作為骨細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，可參與骨骼發(fā)育與骨肉瘤的形成，RUNX3的缺失會(huì)導(dǎo)致實(shí)體瘤的形成[13-14]。RUNX1在造血調(diào)控以及血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中亦發(fā)揮重要作用，RUNX1能夠促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖發(fā)揮致癌作用[15]。本研究從NBCI的基因表達(dá)匯編數(shù)據(jù)庫(kù)中收集共包含422個(gè)AML病人的組織樣本，提取樣本對(duì)應(yīng)的生存時(shí)間、生存狀態(tài)、是否發(fā)生RUNX1突變等臨床信息，將樣本分為RUNX1突變組和RUNX1未突變組，并通過Limma軟件包從2組樣本中篩選出89個(gè)差異表達(dá)基因，其中30個(gè)基因上調(diào)，有BIK、SMYD3、CCNA1、CRIP1等；其中59個(gè)基因下調(diào)，有SETBP1、DNTT、PTK2、APP等?；跇颖緦?duì)應(yīng)的生存信息，全部的差異基因通過單因素Cox回歸進(jìn)行篩選，得到38個(gè)基因被納入到后續(xù)的多因素Cox回歸模型當(dāng)中?；陔p向逐步回歸法，從38個(gè)基因中進(jìn)一步篩選得到10個(gè)基因，包括BIK、APP、MLLT3、C10orf10、PLXNC1、FHL1、CST3、IGLL1、HOXA5、KIAAO125。上述10個(gè)基因被用來構(gòu)建預(yù)后基因模型，并基于該模型得到每個(gè)病人的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，其中BIK、MLLT3、CST3和IGLL1的風(fēng)險(xiǎn)比小于1，表明這些基因可能是AML預(yù)后保護(hù)因素。MLLT3是維持人類造血干細(xì)胞的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子[16]。而APP、C10orf10、PLXNC1、FHL1、HOXA5和KIAAO125這6個(gè)基因的風(fēng)險(xiǎn)比大于1，提示這些基因很有可能是AML預(yù)后的危險(xiǎn)因素。近年來，APP(淀粉樣前體蛋白)的表達(dá)增加可促進(jìn)AML1/eto陽(yáng)性白血病細(xì)胞的增殖和遷移，同時(shí)提高了髓外浸潤(rùn)的發(fā)生率，與AML病人的預(yù)后不良高度相關(guān)[17]。FU等[18]研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)FHL1的AML病人其總體生存率和化療反應(yīng)較對(duì)照組更差，而靶向干預(yù)FHL1的表達(dá)可以有效提高AML病人對(duì)阿糖胞苷的藥物敏感性。值得注意的是，高、低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組的生存分析結(jié)果表明高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組的總體生存率顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組。此外，通過ROC曲線對(duì)病人未來1、3和5年的總體生存率進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明AUC均大于0.7，這反映出我們構(gòu)建的模型具有較好的預(yù)測(cè)能力。

本研究通過生物信息學(xué)工具篩選差異基因成功構(gòu)建了預(yù)后模型，其中BIK、MLLT3、CST3和IGLL1可能是AML預(yù)后保護(hù)因素，APP、C10orf10、PLXNC1、FHL1、HOXA5和KIAAO125可能是AML預(yù)后的危險(xiǎn)因素。鑒于我們的標(biāo)本量少和部分病人年齡、體能狀態(tài)原因，我們建立的預(yù)后模型可能為AML今后的靶向治療及預(yù)后判斷提供新的方向，BIK、MLLT3、CST3等基因可能會(huì)成為RUNX1突變型AMl治療的新靶點(diǎn)。其具體機(jī)制仍需擴(kuò)大病例樣本及結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)后進(jìn)一步明確。