蔡 奔，劉 婷，高 潔，肖莉萍，施恒遠(yuǎn)，丁言穩(wěn)，賈賢杰，于 影

缺血性腦卒中作為腦卒中常見的一種類型，占所有腦卒中病例的60%～70%。缺血性腦卒中是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致腦卒中病人死亡和致殘的主要原因之一，而且缺血性腦卒中后很大可能出現(xiàn)的認(rèn)知功能障礙(post-stroke cognitive impairment，PSCI) 嚴(yán)重影響卒中病人的生活質(zhì)量，卒中后PSCI已成為當(dāng)前國際卒中研究和干預(yù)的熱點[1]。缺血性腦卒中的流行是遺傳易感性和眾多血管危險因素協(xié)同作用的結(jié)果[2]，但是對于缺血性腦卒中后PSCI，近年來相關(guān)性研究較少。孟德爾隨機(jī)化方法(Mendelian randomisation，MR)是運(yùn)用孟德爾獨(dú)立分配定律，將不同基因型導(dǎo)致不同的中間表型(即待研究的相關(guān)暴露因素)，用基因-疾病的因果鏈來推導(dǎo)暴露因素對疾病的作用，計算出暴露因素對疾病或其他結(jié)局的真實效應(yīng)值。近30年來，MR在心腦血管疾病領(lǐng)域的病因預(yù)測開發(fā)中發(fā)揮了舉足輕重的作用[3]。

線粒體乙醛脫氫酶2(ALDH2)是代謝乙醛和多種有毒醛的重要酶。在ALDH2 rs671位點G突變?yōu)锳的基因突變個體中，ALDH2酶活性嚴(yán)重降低，在東亞人中尤為明顯[4]。越來越多的流行病學(xué)調(diào)查[5]顯示，ALDH2基因多態(tài)性與心血管危險因素和腦卒中發(fā)病率的增加密切相關(guān)。來自實驗研究的證據(jù)也表明，ALDH2有助于活性醛的清除，并縮小腦梗死的范圍，改善卒中后神經(jīng)功能損傷狀態(tài)，有利于病人預(yù)后[6]。因此，本研究擬通過工具變量如飲酒代謝強(qiáng)相關(guān)基因ALDH2 rs671的改變探究飲酒相關(guān)暴露因素如飲酒史和飲酒是否臉紅等變量對缺血性腦卒中PSCI影響的因果關(guān)系，為缺血性腦卒中后PSCI的預(yù)防和治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2018年7月至2019年1月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的缺血性腦卒中病人納入本研究。研究獲得了蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，符合赫爾辛基宣言。所有參與者或其親屬提供書面知情同意，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～90歲；(2)入院時通過計算機(jī)斷層掃描(CT)或磁共振成像(MRI)證實缺血性腦卒中的診斷；(3)病人有能力和意愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)原發(fā)性出血性腦卒中或短暫性腦缺血發(fā)作；(2)任何中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦卒中前癡呆或帕金森氏病；(3)嚴(yán)重失語或構(gòu)音障礙，視覺或聽覺障礙及急性或慢性炎癥性疾病病人。

1.2 方法

1.2.1 臨床變量和評估 通過課題組前期制定的標(biāo)準(zhǔn)化問卷采用面對面訪談收集人口學(xué)和臨床特征信息。人群一般特征信息調(diào)查包括年齡、性別、種族和教育水平，其他臨床資料包括腦梗死種類(按照OSCP分型)、飲酒狀況(曾經(jīng)飲酒為過去任何時候飲酒量≥1標(biāo)準(zhǔn)杯，現(xiàn)飲酒為過去30 d內(nèi)至少有一次飲酒量≥1標(biāo)準(zhǔn)杯[7])等。病人的認(rèn)知功能用蒙特利爾認(rèn)知評估(MoCA)量表評估。MoCA量表有30項測試，評估以下7個認(rèn)知領(lǐng)域：視覺空間/執(zhí)行功能、命名、記憶、注意力、語言、抽象和方向。MoCA量表已被翻譯成中文，并被驗證為中國人群PSCI和癡呆的篩查工具[8]。量表評分均按標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，MoCA量表總分30分，得分<26分為PSCI[9-10]。

1.2.2 實驗室檢測方法 在病人簽署知情同意書后，抽取空腹靜脈血5 mL左右，一管血含抗凝劑乙二胺四乙酸(EDTA)，防止其在運(yùn)送過程中凝血，利用Tiangen血液基因組DNA提取試劑盒(貨號：DP348-02)用于提取血液基因組DNA；另一管血為不含EDTA的生化檢測管，其作用是分出血清進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定病人血清中4-羥基壬烯醛(4-HNE)的水平。

1.2.3 基因型測定方法 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目標(biāo)序列：從血液中提取的基因組DNA，經(jīng)過酶標(biāo)儀測得質(zhì)量濃度20 ng/μL以上,純度用OD260/OD280表示，數(shù)值在1.7～1.9之間為純度合格，PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，目標(biāo)序列中含有所研究的ALDH2 rs671基因位點，體系共50 μL，其中50 ng的DNA樣本、2 μL上游產(chǎn)物和2 μL下游產(chǎn)物(上海生工公司合成)、25 μL PCR Master Mix(2X)(thermo scientific公司，Lithuania，K0171)、其余用ddH2O或DEPC水配到50 μL。PCR反應(yīng)體系經(jīng)課題組前期文獻(xiàn)研究及驗證確定為：預(yù)變性95 ℃ 3 min、變性 95 ℃ 30 s、退火55 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 1 min、變性到延伸共40個循環(huán)，最后延伸72 ℃ 10 min、4 ℃保存半個小時以穩(wěn)定反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)束后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠，125 V，30 min電泳，電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)鑒定。

純化PCR產(chǎn)物及基因序列測定：經(jīng)過PCR擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物經(jīng)過Tiangen普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒(DP204-02)純化后，測定得出目標(biāo)序列的正向堿基對序列，經(jīng)過Gene Bank中找到的ALDH2 rs671位置附近的序列及引物序列核對，根據(jù)位置所處的峰值顯示，最終確定ALDH2的基因型。

1.3 MR基本原理的3個假設(shè) MR基本原理的三個假設(shè)：(1)遺傳變異G與暴露或中間表型X有關(guān)；(2)除了通過暴露或中間表型X外，遺傳變異G與結(jié)果Y無關(guān)；(3)遺傳變異G與已知或未知的混雜因素C無關(guān)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用逆方差加權(quán)法(IVW)、方差分析、Hardy-Weinberg平衡分析、二元logistic回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 PSCI與非PSCI病人的人口學(xué)特征和臨床特征 將131例病人按照MoCA量表26分劃分標(biāo)準(zhǔn)分為PSCI組94例和非PSCI組37例，文化程度、飲酒后是否臉紅和是否有飲酒史對病人PSCI的影響具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。缺血性腦卒中有部分前循環(huán)梗死24例(18.32%)、腔隙性腦梗死71例(54.20%)、后循環(huán)梗死36例(27.48%)，PSCI分組中梗死類型分布的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 缺血性腦卒中PSCI的一般人群特征(n)

分組n腦梗死類型部分前循環(huán)梗死 腔隙性腦梗死 后循環(huán)梗死 飲酒史不飲酒 曾經(jīng)飲酒 現(xiàn)在飲酒 飲酒是否臉紅經(jīng)常 偶爾 不臉紅 飲酒種類白酒 紅酒 啤酒 PSCI組941749285619191926493511非PSCI組37722815715225102111χ2—0.926.0219.030.25P —>0.05 <0.05<0.05>0.05

2.2 實驗室檢測結(jié)果 從病人全血中提取DNA濃度為(54.88±20.59)ng/μL，純度(OD260/OD280)均在1.7～1.9之間，通過ALDH2 rs671位點的多態(tài)性決定其基因型，其中G突變?yōu)锳，野生GG型76例，突變雜合AG型52例和突變純和AA型3例，該基因位點經(jīng)過Hardy-Weinberg 遺傳平衡定量分析顯示具有恒定性(P>0.05)(見表2)。

表2 ALDH2 rs671基因的Hardy-Weinberg遺傳平衡分析結(jié)果

2.3 ALDH2不同基因型相關(guān)變量的比較 ALDH2各基因型MoCA得分差異經(jīng)過單因素方差分析發(fā)現(xiàn)不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，根據(jù)ALDH2基因型分組分析病人調(diào)查問卷中相關(guān)變量，發(fā)現(xiàn)相關(guān)協(xié)變量(如性別，年齡和梗死類型等)中ALDH2基因型的分布差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明該工具變量ALDH2基因與一些協(xié)變量無關(guān)，而對于各ALDH2基因型分組的血清4-HNE濃度的差異經(jīng)過單因素方差分析發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，飲酒暴露相關(guān)變量如飲酒史情況和飲酒后是否臉紅等變量，對ALDH2基因型野生型和突變型分布的影響具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表3)。

表3 ALDH2不同基因型相關(guān)變量的比較

2.4 飲酒相關(guān)暴露與缺血性腦卒中PSCI的因果關(guān)系分析結(jié)果 將上述符合MR假設(shè)的ALDH2基因型與飲酒后是否臉紅及飲酒史納入MR，進(jìn)一步利用ALDH2基因型作為工具變量分析飲酒相關(guān)暴露因素與缺血性腦卒中PSCI之間的效應(yīng)值(見表4)。因此有飲酒史與PSCI之間的因果關(guān)系值βIVW有飲酒史=βXY有飲酒史=0.606(OR=3.334，95%CI：3.038～3.653)；飲酒后臉紅與PSCI之間的因果關(guān)系值為βIVW臉紅=βXY臉紅=0.320(OR=4.908，95%CI：4.739～6.475)。

表4 ALDH2基因?qū)SCI和飲酒相關(guān)暴露因素的多因素分析結(jié)果

3 討論

有研究[11]表明ALDH2基因第12外顯子中常見的功能單核苷酸多態(tài)性(SNP)是缺血性腦卒中的危險指標(biāo)，SNP是基因組中存在的最豐富和最穩(wěn)定的遺傳變異。本研究對酒精代謝強(qiáng)相關(guān)基因ALDH2 rs671位點基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗得差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明本研究人群樣本具有區(qū)域群體代表性[12]。本研究滿足MR因果分析原理的3個基礎(chǔ)假設(shè)，即遺傳工具變量與暴露或中間表型有關(guān)，通過ALDH2基因野生型和突變型之間飲酒相關(guān)暴露因素分析，發(fā)現(xiàn)飲酒暴露因素中飲酒史和飲酒是否臉紅與ALDH2基因型的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；除了通過暴露或中間表型外，遺傳變異與結(jié)果無關(guān)，ALDH2基因型對缺血性腦卒中認(rèn)知功能是否損傷的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；遺傳變異與已知或未知的混雜因素?zé)o關(guān)，經(jīng)過Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，ALDH2 rs671基因位點具有恒定性，不受妊娠和其他環(huán)境因素的影響。研究發(fā)現(xiàn)是否具有飲酒史與病人PSCI間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，證明飲酒是腦卒中的獨(dú)立危險因素，影響疾病的嚴(yán)重程度及預(yù)后轉(zhuǎn)歸[13]。在調(diào)整相關(guān)協(xié)變量后，采用二分類logistics回歸分析發(fā)現(xiàn)飲酒后臉紅是PSCI的危險性因素。MR分析飲酒相關(guān)暴露因素時發(fā)現(xiàn)飲酒后臉紅與PSCI之間的因果關(guān)系值為βIVW臉紅=βXY臉紅=0.320(OR=4.908，95%CI：4.739～6.475)，有飲酒史與PSCI之間的因果關(guān)系值為βIVW有飲酒史=βXY有飲酒史=0.606(OR=3.334，95%CI：3.038～3.653)，顯示有飲酒史及飲酒后臉紅與缺血性腦卒中后PSCI之間存在因果關(guān)系，即有有飲酒史和飲酒后臉紅是PSCI的危險因素，相關(guān)飲酒暴露如飲酒或飲酒后臉紅會增加缺血性腦卒中PSCI的危險性。

本研究是基于MR分析原理來探究飲酒相關(guān)暴露與缺血性腦卒中病人PSCI的因果關(guān)系，利用與飲酒代謝強(qiáng)相關(guān)基因ALDH2基因作為工具變量來分析飲酒暴露與病人PSCI之間的因果關(guān)系。最終結(jié)果顯示，有飲酒史和飲酒后臉紅是缺血性腦卒中PSCI的危險因素，相關(guān)飲酒暴露如飲酒或飲酒后臉紅會增加PSCI的發(fā)生概率(OR>1，95%CI均>1)。此結(jié)果提示缺血性腦卒中病人入院前有飲酒史和喝酒后臉紅是導(dǎo)致病人PSCI的重要危險因素，在健康人群或高危人群中倡導(dǎo)減少酒精的攝入，喝酒后臉紅病人盡量減少飲用酒精或者不喝酒，能夠有效地降低缺血性腦卒中PSCI的發(fā)生風(fēng)險，其機(jī)制可能與人體在飲酒后，機(jī)體內(nèi)酒精不能及時、完全代謝消除時，易產(chǎn)生一些有毒的醛類和一些自由基，引起正常膜結(jié)構(gòu)功能的破壞，造成皮下一些微血管的破裂，引起酒后臉紅，酒精的代謝產(chǎn)物還能與腦組織中的卵磷脂結(jié)合，會直接損傷腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞。大腦中的腦白質(zhì)由神經(jīng)纖維聚集而成，參與執(zhí)行、注意、記憶以及視覺空間等腦功能活動，而大腦完整的白質(zhì)連接是維持正常認(rèn)知功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[14]。酒精及其一些代謝產(chǎn)物的神經(jīng)毒性均可降低神經(jīng)元活動，干擾神經(jīng)遞質(zhì)的釋放與表達(dá)。酒精通過以上作用機(jī)制造成病人學(xué)習(xí)記憶等PSCI[15]。

本研究首次基于孟德爾隨機(jī)化分析方法研究飲酒暴露與缺血性腦卒中PSCI間的因果關(guān)系，發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中病人入院前有飲酒史和飲酒后臉紅與其PSCI間存在正向因果關(guān)聯(lián)。但本研究人群中完全前循環(huán)梗死病人出現(xiàn)完全大腦中動脈綜合征即三偏癥、意識障礙和失語，無法完成問卷調(diào)查。其次一些調(diào)查者拒絕參與抽血檢測，導(dǎo)致部分抽樣偏倚。其次是利用MR和橫斷面調(diào)查資料進(jìn)行因果推斷，雖然MR研究對生物標(biāo)志物與缺血性腦卒中PSCI的因果關(guān)系提供了大量證據(jù)，但這方面依托的隊列研究較少，是進(jìn)一步研究的方向。最后，ALDH2等位突變基因是缺血性腦卒中的重要危險因素，但不同民族、不同國家和不同地區(qū)的研究結(jié)果不完全一致，對于不同人群的基因研究還需進(jìn)一步綜述和論證。