高凱夢， 孫世春

(中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院， 海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所， 山東 青島 266003)

卷曲屬(EmplectonemaStimpson, 1857)屬于紐形動物門(Nemertea) 針紐綱(Hoplonemertea)單針目(Monostilifera)卷曲科(Emplectonemertidae Bürger, 1904)，是一類身體纖細(xì)的單針紐蟲，目前包含二十多個物種。在中國沿海曾報道細(xì)卷曲紐蟲(Emplectonemagracile(Johnston, 1837))和三井卷曲紐蟲(EmplectonemamitsuiiYamaoka, 1947) 兩種[1-2]。其中，三井卷曲紐蟲在中國(大連)的記錄[2]存有較大疑問(見下文)。

三井卷曲紐蟲最早由山岡貞一(Yamaoka)發(fā)現(xiàn)于日本下田，原始描述是由奧田四郎對山岡貞一的遺作簡化后發(fā)表于《日本動物圖鑒》(改訂增補)[3],山岡氏對該種的完整描述則于2005年發(fā)表[4]。該種的已知分布區(qū)包括日本東海岸、日本海沿岸[4-7]和韓國[8]。

近年來，本課題組在中國沿海紐形動物采集調(diào)查時，在中國的東海、南海8地采集到三井卷曲紐蟲標(biāo)本27個，并對其開展了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本的采集、觀察與處理

調(diào)查采集主要在巖相潮間帶進(jìn)行。采集方法一是肉眼搜索，二是采集海藻、固著貝類、藤壺等污損生物，加海水浸泡通過溶氧脅迫獲得紐蟲。所獲紐蟲饑餓24 h后，直接以95%乙醇固定用于后續(xù)分子生物學(xué)研究，或活體運回實驗室進(jìn)行形態(tài)觀察。

活體紐蟲用7.5% MgCl2麻醉，先用體視顯微鏡(尼康SMZ800)觀察、測量、拍照。然后將標(biāo)本轉(zhuǎn)移到載玻片上，用蓋玻片輕壓，于顯微鏡(尼康E600)下進(jìn)一步觀察吻針等內(nèi)部構(gòu)造。標(biāo)本以波恩氏液或10%海水福爾馬林固定，或以10%海水福爾馬林固定頭部，以95%乙醇固定尾部(用于分子生物學(xué)研究)。形態(tài)學(xué)標(biāo)本固定至少24 h后轉(zhuǎn)移到70%乙醇保存，乙醇固定的分子生物學(xué)樣品于-25 ℃保存。

本研究在中國沿海8個地點獲得的27個標(biāo)本，其中用于分子生物學(xué)研究的標(biāo)本21個，采集信息見表1、圖1。標(biāo)本保存于中國海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所。除表1所列地點外，近20年來，我們還在遼寧大連、旅順、大長山島、獐子島、廣鹿島、葫蘆島，河北秦皇島，山東北隍城島、大欽島、砣磯島、北長山島、南長山島、大黑山島、崆峒島、威海、榮成馬山、乳山、鰲山衛(wèi)、青島、靈山島、日照，福建平潭、南日島、惠安、廈門、東山，廣東南澳島、深圳東山、硇洲島、海陵島，廣西北海、防城港、潿洲島，海南?？?、臨高、鶯歌海、儋州、三亞、陵水、永興島、七連嶼等40余個地點進(jìn)行了樣品采集(調(diào)查地點覆蓋了自渤海至南海中國各海區(qū))，但未采集到本種紐蟲。

表1 研究標(biāo)本的采集信息及COI的GenBank序列號Table 1 Sampling information of specimens used in the present study, and the GenBank accession numbers of COI sequences

1.2 分子生物學(xué)研究

所有樣本均使用試劑盒MicroElute Genomic DNA Kit200(OMEGA, USA)進(jìn)行DNA的提取。利用通用引物正向引物L(fēng)CO-1490 GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG和反向引物HCO-2198 TTAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA進(jìn)行COI基因片段擴(kuò)增[9]。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其熱循環(huán)條件為：94 ℃下預(yù)變性2 min，循環(huán)(94 ℃下變性1 min，49 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min)35次，最后在72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，經(jīng)純化后用相同引物進(jìn)行雙向測序(北京六合華大基因科技有限公司)。DNA序列的GenBank號(包括從GenBank下載的2條序列)見表1。

用MEGA ver.6.0 軟件[10]對序列進(jìn)行比對、計算遺傳距離(未校正p-距離，uncorrected p-distance；以下簡稱p-距離)。用軟件TCS v.1.21[11]在95%的鏈接概率下生成單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。單倍型及核苷酸多樣性參數(shù)由DnaSP ver.5.10.01軟件計算[12]。

2 結(jié)果

三井卷曲紐蟲Emplectonema mitsuii Yamaoka, 1947

EmplectonemamitsuiiYamaoka: 山岡貞一 1947: 1466, fig. 4133[3]; 佐藤隼夫, 伊藤猛夫 1961: 187, fig. 7.1.7[13]; 奧田四郎, 巖田文男 1965: 397, figs a-d[14]; 宋鵬東等 1989: 53-54[2]; Crandall et al. 2001: 177-178, pl. 1 figs 1-4, pl. 2 figs 16, 16a, 16b[5]; Yamaoka 2005: 142[4]; Kajihara et al. 2011: tab. 1[6]; Sundberg et al. 2016: tab. S1[8]。

2.1 標(biāo)本及采集信息

研究標(biāo)本共27個。采自浙江省舟山市泗礁山、嵊山島、枸杞島、東極島，臺州市大陳島，溫州市南麂島和柴嶼，海南省文昌市龍樓(銅鼓嶺)共8個地點，詳細(xì)信息見表1、圖1。所有標(biāo)本均采自潮間帶，除在柴嶼發(fā)現(xiàn)個別個體生活于巖石縫隙外，均生活于海藻叢中。

(圓點表示本研究的采集地點；三角為其它文獻(xiàn)記錄[2]。Circles show collecting sites of present study; the triangle shows the site of a previous record [2].)

2.2 形態(tài)

體扁平，前部背面稍隆起，腹面平，麻醉后常向腹面彎曲。麻醉后體長約15～29 mm，體寬0.5～0.7 mm。體黃，顯綠，或黃綠色(見圖2A～E)，有的個體背面具青色小斑點(見圖2C)。頭端尖，運動時尤為明顯。眼點較大，分4組，前兩組各2～6個，后兩組各1～4個，一般橙紅色，偶見暗褐色(見圖2C, D)。前頭溝在腹面，向上不延伸至背面；后頭溝位于后眼之后，呈環(huán)繞身體的閉環(huán)(見圖2C～E)。頭部中央具一橙紅色色斑，位于左右前眼點之間(見圖2B, C)。吻孔腹位，縱裂縫狀(見圖2D)。吻腔不及體長的一半。吻主針光滑，長62～85 μm，針座近錐形，后端圓，長59～69 μm，針座寬20～30 μm(見圖2I)。主針略長于針座，針長/座長為1.02～1.14。副針囊2個，各具副針2～3枚。腸具側(cè)盲囊。沒有對所有個體進(jìn)行鏡檢，但龍樓4月標(biāo)本、枸杞7月標(biāo)本、柴嶼10月標(biāo)本見成熟個體。生殖腺位于體后部約60%，數(shù)目很多(見圖2F, G)。精子頭部棒狀，約3～4 μm，具很長的鞭毛(見圖2H)。

(A：活體外形(柴嶼標(biāo)本)；B, C：頭部背面觀，示眼的數(shù)目和顏色變化(B大陳島標(biāo)本，C柴嶼標(biāo)本)；D：頭部腹面觀(枸杞島標(biāo)本)；E：頭部側(cè)面觀(枸杞標(biāo)本)；F：柴嶼10月份雌性個體的腸區(qū)壓片，示成熟卵；G：柴嶼10月份雄性個體的腸區(qū)壓片，示成熟精巢；H：精子；I：主針及針座。gr1： 前頭溝；gr2： 后頭溝; rs： 吻口。比例尺：B～E = 200 μm; F,G = 100 μm; H = 10 μm; I = 50 μm。A: A complete worm from Chai Yu (Island); B, C: Dorsal view of head (A from Dachen Island, B from Chai Yu), showing number and color variation of eyes; D: Ventral view of head (from Gouqi Island); E: Lateral view of head (from Gouqi Island); F: Squeezed intestinal region of a female collected from Chai Yu in October; G: Squeezed intestinal region of a male collected from Chai Yu in October; H: Sperms; I: Central stylet and basis. gr1: Anterior cephalic groove; gr2: Posterior cephalic groove; rs: Rhynchostome. Scale bars: B～E = 200 μm; F,G = 100 μm; H = 10 μm; I = 50 μm.)

2.3 DNA序列

將中國21個標(biāo)本的COI序列(658 bp)與GenBank下載的2條序列(見表1)比對后，得到長度為513 bp的序列數(shù)據(jù)集。對23條COI序列的分析共檢測到4個不同單倍型(Hap1，Hap2，Hap3，Hap4)，構(gòu)成一個單倍型網(wǎng)絡(luò)。其中，主單倍型Hap1包含19個個體，來自中國沿海的6個地點(嵊山島、枸杞島、東極島、南麂島、柴嶼、龍樓)；Hap2包含2個個體，分別來自日本忍路和韓國濟(jì)州島；Hap3和Hap4各包含1個個體，分別采自嵊山島和柴嶼(見圖3)。所有23條序列的p-距離為0.000 0～0.017 5(平均0.003 3)，平均單倍型多樣性(Hd)為0.320±0.121, 平均核苷酸多樣性(π)為0.003±0.002，呈現(xiàn)單倍型多樣性與核苷酸多樣性均低的模式。中國沿海21個樣本間的p-距離為0.000 0～0.003 9(平均0.000 4)，平均單倍型多樣性Hd為0.186±0.110, 平均核苷酸多樣性π為0.000 4±0.000 2。東海(浙江5地19個標(biāo)本)和南海(龍樓2個標(biāo)本)樣本間平均遺傳距離僅為0.000 2。中國與日本(忍路)/韓國(濟(jì)州島)樣本間遺傳距離明顯較大，均為0.017 7(日本與韓國兩樣本的COI序列相同)(見表2)。

(圖中數(shù)字為標(biāo)本數(shù)；單倍型間的每個空心圓代表一個缺失的單倍型。 Numbers correspond to the number of specimens; each blank circle indicates a missing haplotype. )

表2 不同地點基于COI序列的遺傳距離(未校正p-距離)Table 2 Averaged genetic distance (uncorrected p-distance) for COI sequences between different locations

3 討論

本文觀察的中國標(biāo)本的形態(tài)與原始描述基本一致。與模式標(biāo)本相比[4-5]，本文標(biāo)本存在以下細(xì)微差異：體型較小(體長15～29 mmvs.50～70 mm)；體色黃綠色(見圖2A～E)，而模式標(biāo)本體色白黃；多數(shù)標(biāo)本眼的顏色與原始描述一致，呈朱紅色，但也發(fā)現(xiàn)眼呈暗褐色的標(biāo)本(見圖2C)；吻針和針座較小(主針長62～85 μmvs.96～130 μm；針座長59～69 μmvs.80～110 μm)，該差異可能是因為本文標(biāo)本個體較小。Sundberg等對大量樣品的分析結(jié)果顯示，紐形動物COI基因的種內(nèi)變異上限約為3%[8]，本文樣品與韓國、日本標(biāo)本間序列差異小于此值(見表2)?；贑OI序列的TCS物種界定分析顯示，中國、日本、韓國的23個標(biāo)本歸于同一單倍型網(wǎng)絡(luò)，也表明他們隸屬同一物種[15]。

除本文記錄的分布點外，本種已知分布區(qū)包括日本下田(靜岡)[4-5]、三崎(神奈川)、忍路(北海道)和佐渡島(新潟)[6-7]，韓國濟(jì)州島( 見表1)。宋鵬東等曾在大連記錄本種[2]，但近年來，作者及同事在遼寧至山東的黃渤海沿岸進(jìn)行了多次調(diào)查采集，超過20個調(diào)查地點具有本種的典型生境(巖相潮間帶，有大型藻類生長)，但均未發(fā)現(xiàn)本種。三井卷曲紐蟲是一暖水種，其在緯度較高的北海道忍路出現(xiàn)可能與對馬暖流有關(guān)(柁原宏，個人通訊)。因此，本種在大連的分布可能系一誤記。

COI序列的分析結(jié)果表明，三井卷曲紐蟲的單倍型多樣性和核苷酸多樣性總體較低，特別是浙江、海南90%個體共享同一單倍型，其他個體與該主單倍型間也僅有一個堿基差異，提示其可能經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)或種群是由少數(shù)個體通過奠基者效應(yīng)而建立[16]。雖然濟(jì)州島與忍路間、浙江各采樣點與海南龍樓間的地理距離明顯大于浙江各采樣點與濟(jì)州島間的距離，但浙江和濟(jì)州島的個體間遺傳距離遠(yuǎn)大于濟(jì)州島與忍路、浙江與海南個體間的遺傳距離(見表2)。遺憾的是，濟(jì)州島和忍路的樣品僅有1個，海南樣品僅有2個，包括模式產(chǎn)地在內(nèi)的日本東海岸多個分布地均無可用于DNA研究的樣品，現(xiàn)有數(shù)據(jù)尚不能探討三井卷曲紐蟲的地理分布格局的形成歷史。

4 結(jié)語

形態(tài)研究和DNA序列分析表明，浙江和海南的標(biāo)本與在日本、韓國報道的三井卷曲紐蟲屬于同種。在中國沿海三井卷曲紐蟲分布于浙江、海南等暖水水域，前人在遼寧大連的記錄可能為一誤記。中國沿海三井卷曲紐蟲的遺傳距離、單倍型與核苷酸多樣性均很低，但與韓國、日本2個樣品間序列差異較大，提示有必要通過深度采樣在種群水平上解析其地理分布格局的形成歷史。

致謝：曾曉起教授、鄭曉東教授等在樣品采集過程中給予大量幫助，俄羅斯科學(xué)院遠(yuǎn)東分院Alexei V. Chernyshev教授提供GenBank序列樣品的準(zhǔn)確采集地信息，北海道大學(xué)柁原宏教授對研究物種在日本的分布給予進(jìn)一步解釋，謹(jǐn)此致謝！