李金庫， 于 朋， 溫海深， 齊 鑫， 孫冬磊， 王靈鈺， 李 昀

(海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)， 山東 青島 266003)

硬骨魚類與陸生脊椎動物一樣都需要維持體液的離子平衡及滲透穩(wěn)態(tài)，魚類在水中面臨更加多變的離子環(huán)境，因而維持體液穩(wěn)態(tài)對硬骨魚類來說更具有挑戰(zhàn)性[1]。為了應(yīng)對水環(huán)境中的鹽度變化，魚類進化出復(fù)雜的滲透調(diào)節(jié)機制[2]。長久以來，人們普遍認為水分的跨膜運輸是以自由擴散的方式通過磷脂雙分子層。然而，在之后的研究中人們發(fā)現(xiàn)水分子可以快速的通過選擇性通道進入紅細胞而其它的溶質(zhì)分子和離子則不能通過。直至1991 年，Agre 等完成了對水通道蛋白1(AQP1)的克隆和鑒定[3]，從而確定了細胞膜上存在轉(zhuǎn)運水的特定性通道蛋白，由此揭開了研究水通道蛋白的序幕。隨后人們在脊椎動物中共鑒定出17個水通道蛋白同源基因(aqp0～aqp16)，將其稱為水通道蛋白家族，其功能多樣，能顯著增加細胞膜水的通透性，參與水的分泌、吸收及細胞內(nèi)外平衡的調(diào)節(jié)，廣泛參與細胞滲透壓以及生理與病理的調(diào)節(jié)。

水通道蛋白3(AQP3)參與水的分泌、吸收及細胞內(nèi)外平衡的調(diào)節(jié)，在魚類的滲透調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。AQP3作為水通道蛋白家族的一員，除了對水有通透性以外，還允許甘油和尿素等小分子物質(zhì)的通過。近年來有關(guān)硬骨魚中aqp3基因的研究取得了一些進展。 Cutler等在歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)中克隆出aqp3基因并對其組織表達譜進行了分析，發(fā)現(xiàn)其主要表達于眼、食道、腸和鰓，在胃和腎臟中沒有表達或表達量很低。對其鰓中aqp3的表達量進行分析，結(jié)果顯示其表達水平在海水適應(yīng)過程中顯著降低[4]。進一步研究表明aqp3與水或尿素的運輸有關(guān)，AQP3可能在基底外側(cè)膜中充當一個管道，將水釋放到漿膜液中，并防止細胞腫脹[4-6]。隨后，Hirata 等在瓦氏雅羅魚(Tribolodonhakonensis)中也鑒定出aqp3基因。研究發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境中瓦氏雅羅魚鰓組織中aqp3的表達量顯著增加，并利用免疫組化技術(shù)將AQP3定位在了瓦氏雅羅魚鰓組織的氯細胞中，與Na+/K+-ATP酶的定位結(jié)果相似。這表明酸誘導的aqp3表達促進了基底外側(cè)膜的水轉(zhuǎn)運，在一定程度參與了滲透調(diào)節(jié)[7]。Watanabe等在莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus)中克隆出了aqp3基因，利用RT-PCR對海水和淡水適應(yīng)過程中的aqp3基因進行組織表達分析，結(jié)果顯示在淡水適應(yīng)過程中，AQP3在主要的滲透調(diào)節(jié)器官如鰓中的表達量明顯高于海水，而在腎、腸中的表達情況相反。此外利用免疫組化技術(shù)將aqp3定位在了鰓中氯細胞的基底外側(cè)[8]。隨著多種硬骨魚類全基因組數(shù)據(jù)的公布，越來越多的aqp3在硬骨魚中被鑒定出來，例如日本鰻鱺(Anguillajaponica)[9]、日本青鳉(Oryziaslatipes)[10]、歐洲鱸(Dicentrarchuslabrax)[11]、薩羅羅非魚(Sarotherodonmelanothern)[12]等，使得硬骨魚aqp3的結(jié)構(gòu)、功能方面的研究愈發(fā)深入。

花鱸(Lateolabraxmaculatus)又稱中國花鱸，俗稱海鱸、七星鱸、寨花等，廣泛分布于中國沿海以及朝鮮沿海，是中國重要的海產(chǎn)經(jīng)濟魚類[13]?；|具有廣鹽性的特征(能適應(yīng)0～45的鹽度范圍)[14]，是研究滲透調(diào)節(jié)機制的理想模型，然而關(guān)于花鱸水通道蛋白基因的研究未見報道。本研究獲得了花鱸aqp3a基因的cDNA全長序列，并對其序列特征進行了系統(tǒng)分析；利用枝位點模型進行了選擇壓力分析，預(yù)測出了aqp3a基因進化過程中受到正選擇的位點；利用qRT-PCR技術(shù)檢測了花鱸aqp3a基因的組織表達譜，及其在淡水和海水轉(zhuǎn)換后的各個時間點(0h、12h、1d、3d、7d)鰓中的表達情況。此外，利用顯微注射技術(shù)將花鱸aqp3a在非洲爪蟾的卵母細胞中進行異源表達，以進一步檢測AQP3a蛋白的透水活性。本研究結(jié)果為深入研究花鱸aqp3a基因的滲透調(diào)節(jié)功能提供了基礎(chǔ)，同時也為其它魚類水通道蛋白的相關(guān)研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 鹽度轉(zhuǎn)換實驗

實驗所用花鱸及實驗場地均由東營市利津縣雙瀛水產(chǎn)苗種有限責任公司提供。隨機選取90尾室內(nèi)海水(鹽度30)人工養(yǎng)殖的健康的1齡花鱸((120.66 ± 1.87) g)，隨機分配到6個體積為100 L的白色塑化桶中(3個淡水桶，3個海水桶)，每桶放置15尾。于實驗開始前3周分別在淡水(FW，鹽度0)和海水(SW，鹽度30)環(huán)境下馴化，馴化期間于每日8:30和16:30投喂配合飼料，并在投喂1 h后吸除殘餌和糞便。每2天換一次水，換水量為50%。

馴化3周后正式進行鹽度轉(zhuǎn)換實驗：將淡水中的個體迅速轉(zhuǎn)入海水，標記為FW-SW組；同時將海水中的個體迅速轉(zhuǎn)移至淡水中，并標記為SW-FW組，每個實驗組設(shè)置3個重復(fù)。其它實驗條件包括溫度((15.0±0.5 ) ℃)、溶解氧((7.1±0.4) mg/L)、pH(8.0±0.3)等在整個實驗過程中保持恒定。分別于鹽度轉(zhuǎn)換前(0 h)和轉(zhuǎn)換后的4個時間點(12 h、1 d、3 d 和 7 d)采集樣品，于各實驗組的3個平行桶中各取3尾魚，即每個實驗組在各個時間點共取9尾魚，經(jīng)MS222(200 mg/L)麻醉后立即取樣。采集鰓組織樣本并迅速放入液氮中，隨后置于-80 ℃保存。另外，0 h對照組每條魚除鰓組織外，采集腎、性腺、胃、腸、肌肉、心、脾、肝和腦9個組織，并立即放入液氮中，隨后置于-80 ℃保存，用于總RNA的提取和組織表達譜的分析。

1.2 總RNA的提取與cDNA的合成

用TRIzol試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)從所取組織樣品中提取總RNA。采用Biodropsis BD-1000核酸分析儀(OSTC, Beijing)和瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的RNA的濃度和完整性。使用PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (RR047A Takara)試劑盒并按照說明書進行cDNA的合成。合成的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 花鱸aqp3a基因的鑒定及克隆

從NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中檢索并下載6種脊椎動物的aqp3核苷酸序列，包括人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、雞(Gallusgallus)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)和斑馬魚(Daniorerio)，利用TBLASTN (1×e-5)對花鱸參考基因組(PRJNA408177)及全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(PRJNA515783)進行檢索，初步確定花鱸候選aqp3a基因序列。

按照SMARTer RACE 5′/3′ Kit (TaKaRa)說明書，以花鱸鰓組織的總RNA為模板合成第一鏈cDNA。根據(jù)獲得的候選aqp3a基因序列設(shè)計用于CDS克隆的正、反向引物和用于5′、3′非編碼區(qū)克隆的特異性引物，以花鱸鰓組織cDNA為模板進行PCR擴增。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng) 1%的瓊脂糖凝膠電泳后，用FastPure? Gel DNA Extraction Mini Kit膠回收試劑盒(Vazyme)純化，純化產(chǎn)物與TA/Blunt-Zero載體(Vazyme)連接，轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，并篩選陽性克隆測序。實驗所用引物信息詳見表1, 引物合成及測序均由華大基因完成。將獲得的序列利用open rea-ding frame (ORF) finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)在線軟件來預(yù)測氨基酸序列，并通過BLASTP比對NCBI非冗余(NR)蛋白序列數(shù)據(jù)庫進行進一步驗證。利用CDD數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)對鑒定得到的花鱸aqp3a基因的特征結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primer names and sequences

1.4 氨基酸序列分析

通過ExPASy Prot-Param在線工具(https://web.expasy.org/protparam/)計算得到預(yù)測的花鱸AQP3a蛋白的分子量(MW, kD)和等電點(pI)。利用TMHMM Server v2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/servi-ces/TMHMM/)預(yù)測編碼氨基酸序列中的α跨膜螺旋。通過Swiss-Model程序(https://swissmodel.expasy.org/)構(gòu)建花鱸AQP3a蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型，并用PyMOL 1.3軟件作圖。通過DNAMAN軟件對人、小鼠、雞、非洲爪蟾、歐洲鱸、尼羅羅非魚、遮目魚(Chanoschanos)、黃顙魚(Tachysurusfulvidraco)、銀大馬哈魚(Oncorhynchuskisutch)、斑馬魚以及花鱸的預(yù)測AQP3a蛋白進行氨基酸多重序列比對，并對序列同源性及親水性進行分析。

1.5 系統(tǒng)進化分析

利用花鱸和其它幾種脊椎動物的AQP3氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析。利用MEGA 7.0軟件的Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，bootstrap值為1 000。

1.6 選擇壓力分析

基于花鱸與其它物種構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹，采用枝位點模型對兩個主要的進化枝(硬骨魚類與高等脊椎動物)進行選擇壓力分析。以硬骨魚類為前景枝，高等脊椎動物為后景枝，利用EasyCodeML程序?qū)χξ稽c模型的各項參數(shù)進行計算，采用似然比檢驗(LRT)比較模型對的擬合程度，采用貝葉斯法(BEB)對正選擇位點進行識別[15],利用Protter (http://wlab.ethz.ch/protter/start/)在線軟件繪制AQP3氨基酸的二級結(jié)構(gòu)并標注正選擇位點的位置分布。

1.7 qRT-PCR分析

使用StepOne Plus Real-Time PCR system (Applied Biosystems) PCR儀，對花鱸aqp3a進行qRT-PCR相對表達定量分析。20 μL反應(yīng)總體系包含2 μL cDNA模板，正向和反向引物各0.4 μL，10 μL SYBR?FAST qPCR Master Mix、0.4 μL ROX Dye和6.8 μL ddH2O。反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性5 s；95 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s, 共計40個循環(huán)。以18s RNA為內(nèi)參[16]。使用primer 5軟件設(shè)計基因特異性引物，引物具體信息見表1。采用2-ΔΔCT法進行基因的相對表達量的計算, 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one way-ANOVA)，當P<0.05時認為差異顯著。

1.8 花鱸aqp3a基因的異源表達

實驗所用非洲爪蟾由山東大學生命學院動物細胞與發(fā)育生物學重點實驗室提供。非洲爪蟾的年齡為3～4齡，體長(10.22 ± 3.00) cm。實驗開始前將非洲爪蟾暫養(yǎng)在循環(huán)水系統(tǒng)中(自來水充分曝氣；水溫：15 ℃；光照：12 h光照/12 h黑暗)，每周投喂3次。實驗開始后挑選發(fā)育良好的雌性個體，注射50單位的人絨毛膜促性腺激素促進其產(chǎn)卵，以人工擠卵的方式獲得Ⅴ～Ⅵ期的卵母細胞，并在解剖鏡下剝除卵膜。將花鱸aqp3acDNA經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA用于非洲爪蟾卵母細胞的顯微注射。顯微注射系統(tǒng)(ZGENEBIO, PCO-1500, Taiwan)的注射壓力為43 psi，注射時間為10 ms。用于顯微注射的卵母細胞分為2組，其中實驗組每顆卵母細胞注射含10 ngaqp3acRNA的水溶液50 nL，對照組每顆卵母細胞注射50 nL蒸餾水，之后在改良的Barth溶液(MBS，88 mmol/L； NaCl，1 mmol/L； KCl， 0.7 mmol/L； CaCl2，2.5 mmol/L； NaHCO3，1 mmol/L；MgSO4，5 mmol/L；HEPES，1 000 IU/mL；青霉素，鏈霉素100 μg/mL；制真菌素125 IU/mL)中孵育48 h(18 ℃，滲透壓：200 mOsmol)。隨后，將卵母細胞轉(zhuǎn)移至10倍稀釋的MBS (20 mOsmol)中，通過顯微鏡5 min內(nèi)每30 s獲取一張卵母細胞輪廓圖像。保存的圖像隨后使用tpsDig232軟件進行測量(http://life.bio.sunysb.edu/morph/)，以此來測定卵母細胞的透水率(Pf)。Pf值計算公式為：Pf=V0·[d(V/V0)/dt]/ [S·Vw·(Oin-Oout)]，其中V0代表卵母細胞的初始體積；[d(V/V0)dt]表示相對卵母細胞體積隨時間的變化;Vw為水的摩爾體積(Vw=18 cm3/mol)；S為卵母細胞初始表面積；Oin和Oout為卵母胞內(nèi)、外環(huán)境的滲透壓。

2 實驗結(jié)果

2.1 花鱸aqp3a基因的鑒定及序列分析

克隆獲得了花鱸aqp3a基因的cDNA全長序列，其序列的特征信息列于表2：aqp3a基因的mRNA全長2 058 bp，其中5′非編碼區(qū)長84 bp，3′非編碼區(qū)長1 065 bp，CDS長909 bp，編碼302個氨基酸，編碼區(qū)含有2個水通道蛋白家族的特征性天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)序列(見圖1)。預(yù)測結(jié)果表明其存在6個α跨膜螺旋，跨膜位點為：21～43、58～80、101～123、162～181、194～216和249～271(見圖1)。預(yù)測的花鱸AQP3a蛋白的三維結(jié)構(gòu)如圖2所示。AQP3a的C端和N端氨基酸的親水系數(shù)較高，其親水性氨基酸位點主要分布在跨膜區(qū)域，而其它位點表現(xiàn)出較強的疏水性(見圖3)。

(加粗部分為起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG)；黃色標注序列為6個α跨膜螺旋；紅色圓圈內(nèi)序列為2個水通道蛋白家族的特征性天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)序列。 The bold part is the start codon (ATG) and the stop codon (TAG)，The yellow labeled sequences were 6 transmembrane helices. The sequence in the red circle is the characteristic Asparagine-Proline -Alanine (NPA) sequence of the Aquaporin family.)

表2 花鱸aqp3a基因序列信息統(tǒng)計Table 2 Summary of characteristics of aqp3a genes in spotted sea bass

(圖中TM1～TM6為α跨膜螺旋，NPA為天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸序列。In the figure, TM1～TM6 is the transmembrane helix, and NPA is the sequence of Asparagine-Proline-Alanine.)

(縱軸數(shù)值大小代表氨基酸序列的親水性，值越大親水性越強。 The value of the vertical axis represents the hydrophilicity of amino acid sequence, the higher the value, the stronger the hydrophilicity.)

2.2 AQP3氨基酸序列的多重比對及同源性分析

利用DANMAN軟件對花鱸與其它10種脊椎動物的AQP3的氨基酸序列進行同源比對，結(jié)果如圖4所示，各個物種間的蛋白序列相對保守，都有2個高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)模體以及6個α跨膜螺旋?；|AQP3a與歐洲鱸AQP3的同源性最高，為91.1%，其次是尼羅羅非魚AQP3ab，同源性為89.6%，與其它高等脊椎動物的同源性則較低，為68.1%～69.4%。

(圖中黃色矩形內(nèi)的序列代表6個共同的α跨膜螺旋；橙色矩形內(nèi)的序列代表水通道蛋白家族的特征性天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)序列。The sequence in the yellow rectangle represents 6 common transmembrane helices. The orange rectangle represents the characteristic Asparagine-Proline-Alanine (NPA) sequence of the Aquaporin family.)

2.3 AQP3a的系統(tǒng)進化分析

利用MAGA 7.0 軟件構(gòu)建了aqp3基因的系統(tǒng)進化樹。如圖5所示，高等脊椎動物的aqp3基因聚成一枝，硬骨魚類的aqp3基因則聚為另外一枝。其中花鱸aqp3a與歐洲鱸aqp3、尼羅羅非魚aqp3ab的同源關(guān)系相對較近。

圖5 AQP3的系統(tǒng)進化樹Fig. 5 Phylogenetic trees of AQP3

2.4 選擇壓力分析

我們采用枝位點模型，選取硬骨魚為前景枝、高等脊椎動物為后景枝，來檢驗aqp3在硬骨魚中表現(xiàn)出的正選擇位點，并通過似然率檢驗(LRT)獲得P值確定零假設(shè)模型和備選模型之間是否存在差異。如表3所示，根據(jù)貝葉斯法(BEB)，硬骨魚和高等脊椎動物之間存在22個正選擇位點：15 F，16 Q，42 A，46 L，55 M，61 F，67 A，73 V，74 C，92 L，94 G ，99 R*，105 F**，107 F**，119 I，122 M，127 L，164 I，174 I，203 L**，219 L，236 T，其中99 R，105 F，107 F和203 L為顯著受正選擇的位點(P>0.95)，利用Protter (http://wlab.ethz.ch/protter/start/)在線軟件根據(jù)花鱸AQP3a氨基酸序列繪制其二級結(jié)構(gòu)并標注正選擇位點(見圖6)，其中的3個位點分別在2個跨膜螺旋中，剩下的1個位點位于構(gòu)成水孔通道的重要位置。相比于高等脊椎動物，在硬骨魚中，99位的精氨酸替換了異亮氨酸，105位和107位的苯丙氨酸替換了丙氨酸，203位的亮氨酸替換了蘇氨酸。

表3 AQP3的選擇壓力分析Table 3 Selective pressure analysis of AQP3

圖6 枝位點模型預(yù)測的AQP3的正選擇位點Fig. 6 Distribution of positive selection sites of AQP3 predicted by the branch-site models

2.5 花鱸aqp3a基因mRNA的組織表達譜分析

花鱸aqp3a基因的組織表達譜分析結(jié)果如圖7所示，aqp3a基因在各個組織中的表達情況存在顯著差異。以表達量最低的心臟組織為參照，計算aqp3a基因在其它各個組織中的相對表達量，結(jié)果顯示，aqp3a在鰓中的表達量顯著高于其它各個組織。aqp3a在鰓組織中的表達量最高，是其在心臟中表達量的416.36倍，而在其它組織中表達量相對較低。

(柱形圖上方字母不同表示差異顯著(P<0.05)。Different letters on the column indicate significant difference (P<0.05).)

2.6 在淡水及海水適應(yīng)過程中花鱸aqp3a基因在鰓中的表達響應(yīng)

在淡水適應(yīng)(SW-FW組)過程中，花鱸aqp3a基因在鰓中的表達情況如圖8A所示，轉(zhuǎn)入淡水后12 h，aqp3a基因的表達量與對照組無明顯差異，1 d時表達量顯著上調(diào)并達到最大值，為0 h的32.6倍，3 d的表達量上調(diào)為0 h的18.5倍，7 d時的表達量降低至與0 h無顯著差異。在海水適應(yīng)(FW-SW)過程中，aqp3a基因在鰓中的表達情況如圖8B所示，在轉(zhuǎn)入海水后其表達量逐漸下調(diào)然后維持穩(wěn)定，在1 d時顯著下調(diào)為0 h的0.32倍，3和7 d時aqp3a的表達量維持在較低水平，與1 d時無明顯差異。

(柱形圖上方字母不同表示差異顯著(P<0.05)。圖A為淡水適應(yīng)過程中，花鱸aqp3a基因在鰓組織中的相對表達量水平。圖B為海水適應(yīng)過程中花鱸aqp3a基因在鰓組織中的相對表達量水平。Different letters on the column indicate significant difference (P<0.05). Fig. A shows the relative expression level of aqp3a gene in the gill tissue of spotted sea bass during freshwater adaptation. Fig. B shows the relative expression level of aqp3a gene in the gill tissue of spotted sea bass during seawater adaptation.)

2.7 花鱸AQP3a在非洲爪蟾卵母細胞中的功能驗證

為了檢測花鱸AQP3a的水轉(zhuǎn)運活性，本研究將花鱸AQP3a在非洲爪蟾的卵母細胞中進行了異源表達。結(jié)果如圖9所示，顯微注射了aqp3acRNA的實驗組卵母細胞體積在5 min內(nèi)膨脹至初始體積的1.3～1.4倍，而注射蒸餾水的對照組體積膨脹較小或無顯著膨脹(見圖9A)；表達AQP3a蛋白的卵母細胞的透水率(Pf)約為對照組的5倍(見圖9B)，由此表明花鱸的AQP3a對水的轉(zhuǎn)運及細胞體積的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用。

(圖A為注射了蒸餾水的對照組卵母細胞和注射了花鱸AQP3a cRNA的實驗組卵母細胞在轉(zhuǎn)移至低滲培養(yǎng)液后的相對體積變化。矩形代表對照組，圓形代表實驗組。圖B為對照組與實驗組卵母細胞的透水率對比圖。 Fig. A shows the relative volume changes of oocytes in the control group injected with distilled water and those in the experimental group injected with AQP3a cRNA after being transferred to low-osmotic medium. The rectangle represents the control group and the circle represents the experimental group. Fig. B shows the comparison of oocyte permeability between the control group and the experimental group.)

3 討論

本研究成功從花鱸中鑒定出了aqp3a基因，并通過系統(tǒng)進化樹分析確定了命名的正確性。將花鱸AQP3a序列與其它物種進行多重比對，結(jié)果顯示其具有高度保守性。系統(tǒng)進化分析顯示，硬骨魚類的aqp3基因和高等脊椎動物的aqp3基因各聚為一枝，其中花鱸的AQP3a先后與歐洲鱸的AQP3、尼羅羅非魚的AQP3ab聚為一枝，這表明它們的同源關(guān)系較近。此外，采用枝位點模型對aqp3進行選擇壓力分析并在硬骨魚分支上篩選出了4個顯著的正選擇位點，其中有3個位點在2個跨膜螺旋中，剩下的位點位于構(gòu)成水孔通道的重要位置。這些受正選擇作用的非同義氨基酸替換可能導致硬骨魚與高等脊椎動物的AQP3蛋白透水性的顯著差異，影響水的通透性并影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。這種氨基酸的非同義替換對蛋白功能的影響需要通過氨基酸殘基誘變實驗進一步驗證。

在硬骨魚中，aqp3基因的表達具有組織特異性。Cutler等的研究證實了aqp3基因廣泛分布在魚類的鰓、腎、腸等多個組織中且分布和表達量會隨著魚的種類及環(huán)境的變化而變化[4-6]。甘遠迪等對薩羅羅非魚(Sarotherodonmelanothern)的研究表明，aqp3基因在鰓、肌肉、皮膚等組織中表達量較高，且表達量隨鹽度的變化而變化[12]。本研究利用qRT-PCR技術(shù)對花鱸aqp3a基因的組織表達譜進行檢測，得到了相似的結(jié)果，結(jié)果顯示aqp3a基因在各組織中廣泛表達(心臟組織除外)，且在鰓中的表達量顯著高于其它組織。這表明花鱸aqp3a基因在鰓組織中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

硬骨魚類復(fù)雜的滲透調(diào)節(jié)機制使其在面對海、淡水環(huán)境時，可通過滲透調(diào)節(jié)器官調(diào)節(jié)水鹽平衡，在整個滲透調(diào)節(jié)過程中鰓發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[17-19]。在鹽度適應(yīng)過程aqp3基因在鰓中的表達量具有顯著差異，如歐洲鱸、歐洲鰻鱺、日本鰻鱺、莫桑比克羅非魚等相關(guān)研究結(jié)果表明aqp3mRNA在淡水條件下的表達量均高于海水條件下的表達量。部分學者認為這是由于AQP3的作用可能是通過水分的轉(zhuǎn)運來調(diào)節(jié)細胞體積。本實驗對花鱸aqp3a基因在淡水適應(yīng)過程中的鰓組織中的表達變化情況進行研究，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)入淡水后其表達量出現(xiàn)顯著上調(diào)，與之前的研究結(jié)果一致，但在3 d后表達出現(xiàn)下調(diào)，7 d后表達趨于穩(wěn)定并與對照組無顯著差異，該結(jié)果與Giffard-Mena等人對歐洲鱸aqp3在淡水適應(yīng)過程中的表達變化的研究略有不同，其鰓組織中aqp3在淡水適應(yīng)一周后的表達量仍比對照組上調(diào)8倍。因此，我們提出另一種假設(shè)，在花鱸鰓組織中，aqp3a的作用并非通過建立細胞膜通路直接控制水分運輸，而是間接參與細胞體積的調(diào)節(jié)。以往對歐洲鰻鱺、莫桑比克羅非魚的免疫組化研究結(jié)果顯示AQP3主要分布在氯細胞中，與Na+/K+-ATP酶共定位于基底側(cè)的微管網(wǎng)中[8]，在低滲環(huán)境下，水分子通過水通道蛋白由外界水環(huán)境進入氯細胞，導致細胞腫脹，進而激活Na+/K+-ATP酶的活性，調(diào)節(jié)離子濃度，進而維持細胞體積。而短時間內(nèi)花鱸aqp3a的顯著上調(diào)可能與氯細胞的凋亡、轉(zhuǎn)化和細胞分化有關(guān)。對羅非魚胚胎表皮細胞的研究表明，氯細胞存在4種類型且在海、淡水環(huán)境中以不同的類型存在[20]。當花鱸由海水轉(zhuǎn)入淡水時，海水型氯細胞大量凋亡而淡水型氯細胞的建立和分化促使aqp3amRNA的顯著上調(diào)，至淡水適應(yīng)7 d時表達趨于穩(wěn)定。同樣有很多學者對aqp3在海水適應(yīng)過程中的表達情況進行了研究，Cutler等對歐洲鰻鱺進行海水馴化，3周后aqp3的表達量顯著下降[5]。Tse等將日本鰻鱺由FW轉(zhuǎn)入SW中，鰓中aqp3mRNA水平也出現(xiàn)類似的下降[9]。我們同樣對花鱸aqp3a基因海水適應(yīng)過程中在鰓組織中的表達模式進行了研究，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)入海水后其表達量逐漸下調(diào)，并在1 d后維持穩(wěn)定。Isaia等認為鰻鱺aqp3mRNA表達的下降與向SW轉(zhuǎn)移后鰓的水滲透性下降有關(guān)[21]。Lignot等利用免疫組化在鹽度適應(yīng)的歐洲鰻鱺中，將AQP3定位在了鰓的氯細胞、基底上皮細胞及覆蓋鰓弓的上皮細胞中，且在SW馴化的歐洲鰻鱺中，這兩個非氯細胞位置的染色均顯著減少，并由此推測氯細胞中AQP3蛋白水平的降低可能是導致SW中AQP3 mRNA和蛋白表達下調(diào)的原因[22-24]。同樣在SW馴化后的羅非魚鰓中AQP3免疫組化染色程度也有所降低[24]。針對花鱸aqp3a在海水馴化過程中的表達情況，根據(jù)我們的假設(shè)，其在海水適應(yīng)過程中表達量逐漸降低然后維持穩(wěn)定一方面原因是由于海、淡水不同類型的氯細胞相互轉(zhuǎn)化，另一方面可能是由于海水環(huán)境中除了氯細胞外，上皮細胞等其它類型細胞中aqp3a的表達量降低。由此表明，aqp3a在花鱸的滲透調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著相當重要的作用。

非洲爪蟾的卵母細胞作為功能基因組學中重要的研究工具可在短時間內(nèi)正確的表達外源基因，翻譯合成蛋白質(zhì)[25]。為進一步驗證花鱸aqp3a基因的功能，利用非洲爪蟾Ⅴ～Ⅵ期的卵母細胞對其進行異源表達。通過顯微注射技術(shù)將花鱸aqp3a的cRNA注射入卵母細胞中，以此檢測其透水活性。實驗結(jié)果顯示花鱸aqp3a的cRNA能夠在非洲爪蟾卵母細胞的細胞膜中高效表達，并顯著提高細胞膜的透水能力，這表明花鱸aqp3a基因?qū)λ霓D(zhuǎn)運和細胞體積調(diào)節(jié)有重要作用。

4 結(jié)語

本研究克隆、分析了花鱸的aqp3a基因，并檢測了該基因的組織表達情況。結(jié)果表明aqp3a基因存在組織表達特異性，且在鰓中的表達量顯著高于其它組織。通過短期鹽度轉(zhuǎn)換實驗檢測該基因在海、淡水適應(yīng)過程中在鰓組織中的表達變化情況，結(jié)果顯示aqp3a基因在海、淡水適應(yīng)過程中的變化情況存在顯著差異。同時利用非洲爪蟾的卵母細胞對花鱸aqp3a基因進行異源表達以檢測其透水活性，結(jié)果顯示該基因能顯著提高細胞膜的透水活性。本實驗對花鱸aqp3a基因在滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮的作用進行了初步研究，其具體的分子機制還需要進一步研究。