冷遠(yuǎn)鵬 薛曉康 孫華

摘要：建立了一種以固相萃取作為快速凈化技術(shù)的高效液相色譜質(zhì)譜法測定有機肥中18種抗生素的殘留量，檢測目標(biāo)物包括14種磺胺類物質(zhì)及4種氟喹諾酮類物質(zhì)。樣品經(jīng)3 mL固相萃取柱快速凈化后直接經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MSMS）外標(biāo)法定量，流速0.4 mL/min，流動相為甲醇及0.1%甲酸水梯度洗脫，色譜柱為C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），進樣體積2 μL，正離子掃描多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，分析時長9 min。結(jié)果表明，有機肥基質(zhì)對測試無明顯基質(zhì)效應(yīng)，目標(biāo)化合物在10～250 μg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r均大于0.995），方法檢出限為0.013～2.679 μg/kg，定量限為0.042～8.929 μg/kg，精密度良好，重復(fù)6次測試保留時間的RSD在5%以內(nèi)，濃度的RSD在10%以內(nèi)，空白加標(biāo)回收率為89.2%～106.1%。豬糞、雞糞、鴨糞3個實際樣品高低2個水平加標(biāo)回收率為70%～130%。說明該方法簡便可行、準(zhǔn)確度可靠、靈敏度高，可為有機肥中抗生素測定標(biāo)準(zhǔn)制訂提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：固相萃取;高效液相色譜質(zhì)譜法;動物糞便有機肥;抗生素

中圖分類號：X592? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）11-0146-07

收稿日期：2020-09-01

基金項目：上海市科委上?；瘜W(xué)品公共安全工程技術(shù)研究中心項目（編號：18DZ2280700）。

作者簡介：冷遠(yuǎn)鵬（1990—），男，貴州遵義人，碩士，中級工程師，從事化妝品、農(nóng)藥殘留檢測相關(guān)研究。E-mail：lirper@163.com。

通信作者：薛曉康，博士研究生，高級工程師，主要從事化妝品、農(nóng)藥殘留檢測相關(guān)研究。E-mail：xxk@ghs.cn。

抗生素是指由微生物或高等動植物所產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物，其具有抗病原體或其他活性，能干擾其他生物的細(xì)胞發(fā)育功能[1]。抗生素按化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為酰胺類抗生素、喹諾酮類抗生素、氨基糖苷類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素等，與其他類相比，喹諾酮類及酰胺類抗生素由于可直接化學(xué)合成、生產(chǎn)簡便且價格低廉，在獸藥中作為抗菌劑和促進生長劑被廣泛使用。然而，由于其性質(zhì)穩(wěn)定，僅少部分被動物完全代謝消耗，大部分則以原藥或次級代謝產(chǎn)物形式隨糞尿直接排出體外[2]。當(dāng)動物排泄物用于發(fā)酵制作有機肥時，發(fā)酵堆肥環(huán)境有利于抗生素的穩(wěn)定存在并可導(dǎo)致部分抗生素代謝產(chǎn)物反應(yīng)轉(zhuǎn)化為原藥[3-7]。

抗生素污染目前備受關(guān)注，有機肥中抗生素到達(dá)土壤環(huán)境后將影響和改變農(nóng)作區(qū)土壤菌落的原始結(jié)構(gòu)和功能，對農(nóng)田造成污染[8-10]，部分抗生素通過植物吸收進入食物鏈，最終對人產(chǎn)生毒害作用[11-16]，殘留在土壤中的抗生素還會誘導(dǎo)耐藥菌種出現(xiàn)，從而對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生二次污染[17-18]。

有機肥中抗生素殘留種類繁多，但目前我國的檢測指標(biāo)僅為在2016年發(fā)布的GB/T 32951—2016《有機肥料中土霉素、四環(huán)素、金霉素與強力霉素的含量測定 高效液相色譜法》，還未建立有效檢測有機肥中喹諾酮類及酰胺類抗生素的方法。在限值規(guī)定方面，我國原農(nóng)業(yè)部公告第235號規(guī)定了《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中動物源性食品中磺胺的最高殘留限量為100 μg/kg，豬肌肉中喹諾酮限量為100 μg/kg。相對于肥料業(yè)，近年來食品業(yè)和環(huán)境業(yè)中抗生素殘留有了一定的研究[19-22]，但有機肥中喹諾酮類及酰胺類抗生素的檢測分析相關(guān)研究較少，目前也還沒有相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)。

研究采用固相萃取法提取有機肥料樣品，聯(lián)用高效液相色譜質(zhì)譜，以實現(xiàn)有機肥料中18種常見抗生素（14種磺胺類及4種氟喹諾酮類）殘留的同時、快速測定。已有3類有機肥樣品測試證明方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，以期為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供了參考，降低生態(tài)污染風(fēng)險，保護生態(tài)和健康安全。

1 材料與方法

1.1 樣品

市售有機肥，基底為豬糞、雞糞或鴨糞單一動物糞種。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

ACQUITY TQD型高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀[美國沃特世（Waters）公司];PL2002型電子天平（梅特勒托利多集團）;TDL-5離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）;Oasis PRiME HLB固相萃取柱（規(guī)格為6 mL，美國沃特世公司）;pH計FE20（梅特勒托利多集團）;0.2 μm濾膜（美國沃特世公司）;2 mm 試驗篩（紹興市上虞紗篩廠）;Vortex 3000渦旋振蕩器[維根技術(shù)（北京）有限公司]。

1.2.2 試劑

所用化學(xué)試劑無特殊說明均為分析純，試驗用符合GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》的一級水標(biāo)準(zhǔn)。

（1）抗生素。磺胺吡啶、磺胺噠嗪、磺胺甲唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲異唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星，純度不小于95%。

（2）其他試劑。甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）、檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉、乙酸。

1.3 溶液配制

1.3.1 緩沖溶液

（1）McLlvaine緩沖溶液。將1 000 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液與625 mL 0.2 mol/L 磷酸氫二鈉溶液混合，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH值為4.0。（2）Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液。濃度0.02 mol/L，稱取60.5 g乙二胺四乙酸二鈉放入1 625 mL Mcllvaine緩沖溶液中，使其溶解，然后加入純水5倍稀釋，混勻。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液 分別稱取18種適量的獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20? ℃冰箱中保存。吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇溶解配制成5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，于-20 ℃ 冰箱中保存。吸取適量標(biāo)準(zhǔn)工作液，在試驗前用含5%甲醇、95%的甲酸水溶液（甲酸濃度0.1%）的初始流動相溶液配制濃度為10.0、25.0、50.0、100.0、200.0、250.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液 吸取適量標(biāo)準(zhǔn)工作液，在試驗前用不含該18種抗生素、經(jīng)樣品前處理的空白有機肥試樣溶液配制成濃度為10.0、25.0、50.0、100.0、200.0、250.0 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.0 g碾磨過篩后的有機肥樣品于50 mL 離心管中，加入5 mL Na2EDTA-Mcllvaline緩沖液（pH值 4.0），渦旋混勻，再加入18 mL乙腈、2 mL乙酸，渦旋振蕩20 min后4 000 r/min 離心10 min，獲得含待測抗生素的上清液。取Oasis PRiME HLB固相萃取柱（吸附劑質(zhì)量為60 mg，柱管體積為3 mL），將2 mL 上清液過固相萃取柱，保持約1滴/s的流速，準(zhǔn)確量取1 mL流出液，過0.2 μm濾膜，獲得經(jīng)固相萃取凈化的上機測試液。

1.5 色譜條件

色譜柱為C18柱，ACQUITY UPLC BEH（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）;柱溫為35 ℃;流動相：A，甲醇;B，0.1%甲酸水溶液;流速為0.4 mL/min;進樣體積為2 μL;梯度洗脫條件見表1。

1.6 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI）;掃描方式為正離子掃描;檢測方式為多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）;脫溶劑溫度為350 ℃;脫溶劑氣流速為650 L/h;毛細(xì)管電壓：2.0 kV;18種抗生素質(zhì)譜參數(shù)見表2。

1.7 試驗時間和地點

試驗時間為2019年6月至2020年6月;試驗地點為上?；ぱ芯吭河邢薰荆ㄖ袊虾Ｊ性茙X東路345號）1號樓302室。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制濃度為100 μg/L的18種抗生素單標(biāo)，利用ACQUITY TQD型高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的質(zhì)譜調(diào)節(jié)功能直接將標(biāo)準(zhǔn)溶液抽入質(zhì)譜霧化進樣。調(diào)節(jié)錐孔電壓使母離子信號最大，再在此優(yōu)化后的錐孔電壓下開啟碰撞，確定信號最強的子離子為定量離子并調(diào)節(jié)碰撞能量使子離子信號最大，確定信號次強的子離子為定性離子并調(diào)節(jié)碰撞能量使該子離子信號最大。優(yōu)化后質(zhì)譜條件如表2所示。

2.2 流動相的優(yōu)化

以乙腈和甲醇溶液作為2種有機相進行18種抗生素混標(biāo)溶液的進樣對比試驗。當(dāng)乙腈作為流動相時，組分色譜峰較寬，分離度較低，且對于4種氟喹諾酮類抗生素出現(xiàn)峰拖尾現(xiàn)象，故確定有機流動相為甲醇。優(yōu)化條件后標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流（TIC）色譜圖及定量離子對色譜圖如圖1、圖2所示，以甲醇為流動相，磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪及磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺-6-二甲氧嘧啶2組同分異構(gòu)體均具有較好分離度，其具體情況如圖2中9、10、11、13、14號所示。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

目前常用于評估基質(zhì)效應(yīng)（ME）的指標(biāo)為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率（ME值）。若ME值大于1.2時，說明基質(zhì)對濃度越高的樣品具有越強的信號增強作用，即具有基質(zhì)增強效應(yīng);若ME值低于0.8時，說明基質(zhì)對濃度越高的樣品具有越強的信號抑制作用，即具有基質(zhì)抑制效應(yīng);若ME值介于0.8～1.2之間時，說明基質(zhì)無明顯基質(zhì)效應(yīng)[23]。如圖3所示，18種抗生素的ME值均在0.8～1.0之間，說明有機肥基質(zhì)對抗生素信號有輕微抑制作用。但由于ME值均大于0.8，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線需要找到確定不含有這些抗生素的有機肥，經(jīng)過前處理過程后方能獲得，不如用初始流動相直接配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液使用方便，所以認(rèn)為可忽略有機肥的基質(zhì)效應(yīng)。回收率試驗將進一步確定有機肥基質(zhì)及本方法其他因素的影響。

2.4 方法學(xué)評價

2.4.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限 取“1.3”節(jié)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按“1.5”節(jié)色譜條件及“1.6”節(jié)質(zhì)譜條件進樣，以抗生素濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程并確定相關(guān)系數(shù)（r），以3倍信噪比為檢出限（LOD）、10倍信噪比為定量限（LOQ）。如表3所示，18種抗生素在10～250 μg/L 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.995，方法檢出限為0.013～2.679 μg/kg，方法定量限為0.042～8.929 μg/kg。

2.4.2 精密度 向空白有機肥樣品中添加一定量標(biāo)準(zhǔn)儲備液后進行前處理，使上機溶液中抗生素理論濃度為 50.0 μg/L，按“1.5”節(jié)色譜條件及“1.6”節(jié)質(zhì)譜條件連續(xù)進樣6次。如表4所示，抗生素保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均在5%以內(nèi)，濃度的RSD均在10%以內(nèi)，空白加標(biāo)回收率在89.2%～106.1%之間，說明方法精密度良好，前處理過程能夠有效提取出抗生素，液相色譜質(zhì)譜分析能夠保持結(jié)果的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性。

2.4.3 實際樣品測定及加標(biāo)回收率 以基底為豬糞、雞糞或鴨糞某單一動物糞種的市售有機肥，作為實際樣品進行抗生素及加標(biāo)回收率測定，低水平加標(biāo)濃度為20.0 μg/L、高水平加標(biāo)濃度為160.0 μg/L。如表5所示，豬糞樣品中磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶有檢出，其余抗生素未檢出;雞糞樣品中氧氟沙星有檢出，其余抗生素未檢出;鴨糞樣品中磺胺吡啶、磺胺二甲異唑、磺胺間二甲氧嘧啶有檢出，其余抗生素未檢出。3種糞種的樣品加標(biāo)回收率均在70.0%～130%之間，高低水平加標(biāo)回收率無明顯差異，說明該方法適用于實際有機肥樣品中18種抗生素的測試。

3 結(jié)論

本研究建立了一種測定動物糞便基底有機肥中14種磺胺類抗生素、4種氟喹諾酮類抗生素殘留的固相萃取-高效液相色譜質(zhì)譜法。樣品經(jīng)提取凈化前處理后上機測試，9min即可完成單針分析。

初始流動相標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線對比結(jié)果顯示，有機肥基底對測試無明顯基底效應(yīng)，減輕了標(biāo)線配制難度。方法準(zhǔn)確度和精密度良好、靈敏度高，適用于動物糞種制成的有機肥中常見抗生素痕量殘留的分析檢測。鑒于目前沒有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，本研究結(jié)果可為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制訂提供依據(jù)。

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