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        固相萃取-高效液相色譜質(zhì)譜法測定有機肥中18種抗生素殘留

        2021-07-26 02:06:06冷遠(yuǎn)鵬薛曉康孫華
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年11期
        關(guān)鍵詞:固相萃取

        冷遠(yuǎn)鵬 薛曉康 孫華

        摘要:建立了一種以固相萃取作為快速凈化技術(shù)的高效液相色譜質(zhì)譜法測定有機肥中18種抗生素的殘留量,檢測目標(biāo)物包括14種磺胺類物質(zhì)及4種氟喹諾酮類物質(zhì)。樣品經(jīng)3 mL固相萃取柱快速凈化后直接經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MSMS)外標(biāo)法定量,流速0.4 mL/min,流動相為甲醇及0.1%甲酸水梯度洗脫,色譜柱為C18柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm),進樣體積2 μL,正離子掃描多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式,分析時長9 min。結(jié)果表明,有機肥基質(zhì)對測試無明顯基質(zhì)效應(yīng),目標(biāo)化合物在10~250 μg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r均大于0.995),方法檢出限為0.013~2.679 μg/kg,定量限為0.042~8.929 μg/kg,精密度良好,重復(fù)6次測試保留時間的RSD在5%以內(nèi),濃度的RSD在10%以內(nèi),空白加標(biāo)回收率為89.2%~106.1%。豬糞、雞糞、鴨糞3個實際樣品高低2個水平加標(biāo)回收率為70%~130%。說明該方法簡便可行、準(zhǔn)確度可靠、靈敏度高,可為有機肥中抗生素測定標(biāo)準(zhǔn)制訂提供參考依據(jù)。

        關(guān)鍵詞:固相萃取;高效液相色譜質(zhì)譜法;動物糞便有機肥;抗生素

        中圖分類號:X592? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

        文章編號:1002-1302(2021)11-0146-07

        收稿日期:2020-09-01

        基金項目:上海市科委上?;瘜W(xué)品公共安全工程技術(shù)研究中心項目(編號:18DZ2280700)。

        作者簡介:冷遠(yuǎn)鵬(1990—),男,貴州遵義人,碩士,中級工程師,從事化妝品、農(nóng)藥殘留檢測相關(guān)研究。E-mail:lirper@163.com。

        通信作者:薛曉康,博士研究生,高級工程師,主要從事化妝品、農(nóng)藥殘留檢測相關(guān)研究。E-mail:xxk@ghs.cn。

        抗生素是指由微生物或高等動植物所產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物,其具有抗病原體或其他活性,能干擾其他生物的細(xì)胞發(fā)育功能[1]。抗生素按化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為酰胺類抗生素、喹諾酮類抗生素、氨基糖苷類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素等,與其他類相比,喹諾酮類及酰胺類抗生素由于可直接化學(xué)合成、生產(chǎn)簡便且價格低廉,在獸藥中作為抗菌劑和促進生長劑被廣泛使用。然而,由于其性質(zhì)穩(wěn)定,僅少部分被動物完全代謝消耗,大部分則以原藥或次級代謝產(chǎn)物形式隨糞尿直接排出體外[2]。當(dāng)動物排泄物用于發(fā)酵制作有機肥時,發(fā)酵堆肥環(huán)境有利于抗生素的穩(wěn)定存在并可導(dǎo)致部分抗生素代謝產(chǎn)物反應(yīng)轉(zhuǎn)化為原藥[3-7]。

        抗生素污染目前備受關(guān)注,有機肥中抗生素到達(dá)土壤環(huán)境后將影響和改變農(nóng)作區(qū)土壤菌落的原始結(jié)構(gòu)和功能,對農(nóng)田造成污染[8-10],部分抗生素通過植物吸收進入食物鏈,最終對人產(chǎn)生毒害作用[11-16],殘留在土壤中的抗生素還會誘導(dǎo)耐藥菌種出現(xiàn),從而對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生二次污染[17-18]。

        有機肥中抗生素殘留種類繁多,但目前我國的檢測指標(biāo)僅為在2016年發(fā)布的GB/T 32951—2016《有機肥料中土霉素、四環(huán)素、金霉素與強力霉素的含量測定 高效液相色譜法》,還未建立有效檢測有機肥中喹諾酮類及酰胺類抗生素的方法。在限值規(guī)定方面,我國原農(nóng)業(yè)部公告第235號規(guī)定了《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中動物源性食品中磺胺的最高殘留限量為100 μg/kg,豬肌肉中喹諾酮限量為100 μg/kg。相對于肥料業(yè),近年來食品業(yè)和環(huán)境業(yè)中抗生素殘留有了一定的研究[19-22],但有機肥中喹諾酮類及酰胺類抗生素的檢測分析相關(guān)研究較少,目前也還沒有相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)。

        研究采用固相萃取法提取有機肥料樣品,聯(lián)用高效液相色譜質(zhì)譜,以實現(xiàn)有機肥料中18種常見抗生素(14種磺胺類及4種氟喹諾酮類)殘留的同時、快速測定。已有3類有機肥樣品測試證明方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度,以期為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供了參考,降低生態(tài)污染風(fēng)險,保護生態(tài)和健康安全。

        1 材料與方法

        1.1 樣品

        市售有機肥,基底為豬糞、雞糞或鴨糞單一動物糞種。

        1.2 儀器與試劑

        1.2.1 儀器

        ACQUITY TQD型高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀[美國沃特世(Waters)公司];PL2002型電子天平(梅特勒托利多集團);TDL-5離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);Oasis PRiME HLB固相萃取柱(規(guī)格為6 mL,美國沃特世公司);pH計FE20(梅特勒托利多集團);0.2 μm濾膜(美國沃特世公司);2 mm 試驗篩(紹興市上虞紗篩廠);Vortex 3000渦旋振蕩器[維根技術(shù)(北京)有限公司]。

        1.2.2 試劑

        所用化學(xué)試劑無特殊說明均為分析純,試驗用符合GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》的一級水標(biāo)準(zhǔn)。

        (1)抗生素。磺胺吡啶、磺胺噠嗪、磺胺甲唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲異唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星,純度不小于95%。

        (2)其他試劑。甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、甲酸(色譜純)、檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉、乙酸。

        1.3 溶液配制

        1.3.1 緩沖溶液

        (1)McLlvaine緩沖溶液。將1 000 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液與625 mL 0.2 mol/L 磷酸氫二鈉溶液混合,用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH值為4.0。(2)Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液。濃度0.02 mol/L,稱取60.5 g乙二胺四乙酸二鈉放入1 625 mL Mcllvaine緩沖溶液中,使其溶解,然后加入純水5倍稀釋,混勻。

        1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液 分別稱取18種適量的獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用甲醇溶解配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-20? ℃冰箱中保存。吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用甲醇溶解配制成5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液,于-20 ℃ 冰箱中保存。吸取適量標(biāo)準(zhǔn)工作液,在試驗前用含5%甲醇、95%的甲酸水溶液(甲酸濃度0.1%)的初始流動相溶液配制濃度為10.0、25.0、50.0、100.0、200.0、250.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

        1.3.3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液 吸取適量標(biāo)準(zhǔn)工作液,在試驗前用不含該18種抗生素、經(jīng)樣品前處理的空白有機肥試樣溶液配制成濃度為10.0、25.0、50.0、100.0、200.0、250.0 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

        1.4 樣品前處理

        準(zhǔn)確稱取2.0 g碾磨過篩后的有機肥樣品于50 mL 離心管中,加入5 mL Na2EDTA-Mcllvaline緩沖液(pH值 4.0),渦旋混勻,再加入18 mL乙腈、2 mL乙酸,渦旋振蕩20 min后4 000 r/min 離心10 min,獲得含待測抗生素的上清液。取Oasis PRiME HLB固相萃取柱(吸附劑質(zhì)量為60 mg,柱管體積為3 mL),將2 mL 上清液過固相萃取柱,保持約1滴/s的流速,準(zhǔn)確量取1 mL流出液,過0.2 μm濾膜,獲得經(jīng)固相萃取凈化的上機測試液。

        1.5 色譜條件

        色譜柱為C18柱,ACQUITY UPLC BEH(100 mm×2.1 mm,1.9 μm);柱溫為35 ℃;流動相:A,甲醇;B,0.1%甲酸水溶液;流速為0.4 mL/min;進樣體積為2 μL;梯度洗脫條件見表1。

        1.6 質(zhì)譜條件

        離子源為電噴霧離子源(ESI);掃描方式為正離子掃描;檢測方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM);脫溶劑溫度為350 ℃;脫溶劑氣流速為650 L/h;毛細(xì)管電壓:2.0 kV;18種抗生素質(zhì)譜參數(shù)見表2。

        1.7 試驗時間和地點

        試驗時間為2019年6月至2020年6月;試驗地點為上?;ぱ芯吭河邢薰荆ㄖ袊虾J性茙X東路345號)1號樓302室。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

        配制濃度為100 μg/L的18種抗生素單標(biāo),利用ACQUITY TQD型高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的質(zhì)譜調(diào)節(jié)功能直接將標(biāo)準(zhǔn)溶液抽入質(zhì)譜霧化進樣。調(diào)節(jié)錐孔電壓使母離子信號最大,再在此優(yōu)化后的錐孔電壓下開啟碰撞,確定信號最強的子離子為定量離子并調(diào)節(jié)碰撞能量使子離子信號最大,確定信號次強的子離子為定性離子并調(diào)節(jié)碰撞能量使該子離子信號最大。優(yōu)化后質(zhì)譜條件如表2所示。

        2.2 流動相的優(yōu)化

        以乙腈和甲醇溶液作為2種有機相進行18種抗生素混標(biāo)溶液的進樣對比試驗。當(dāng)乙腈作為流動相時,組分色譜峰較寬,分離度較低,且對于4種氟喹諾酮類抗生素出現(xiàn)峰拖尾現(xiàn)象,故確定有機流動相為甲醇。優(yōu)化條件后標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流(TIC)色譜圖及定量離子對色譜圖如圖1、圖2所示,以甲醇為流動相,磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪及磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺-6-二甲氧嘧啶2組同分異構(gòu)體均具有較好分離度,其具體情況如圖2中9、10、11、13、14號所示。

        2.3 基質(zhì)效應(yīng)

        目前常用于評估基質(zhì)效應(yīng)(ME)的指標(biāo)為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率(ME值)。若ME值大于1.2時,說明基質(zhì)對濃度越高的樣品具有越強的信號增強作用,即具有基質(zhì)增強效應(yīng);若ME值低于0.8時,說明基質(zhì)對濃度越高的樣品具有越強的信號抑制作用,即具有基質(zhì)抑制效應(yīng);若ME值介于0.8~1.2之間時,說明基質(zhì)無明顯基質(zhì)效應(yīng)[23]。如圖3所示,18種抗生素的ME值均在0.8~1.0之間,說明有機肥基質(zhì)對抗生素信號有輕微抑制作用。但由于ME值均大于0.8,基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線需要找到確定不含有這些抗生素的有機肥,經(jīng)過前處理過程后方能獲得,不如用初始流動相直接配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液使用方便,所以認(rèn)為可忽略有機肥的基質(zhì)效應(yīng)。回收率試驗將進一步確定有機肥基質(zhì)及本方法其他因素的影響。

        2.4 方法學(xué)評價

        2.4.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限 取“1.3”節(jié)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,按“1.5”節(jié)色譜條件及“1.6”節(jié)質(zhì)譜條件進樣,以抗生素濃度(x)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算回歸方程并確定相關(guān)系數(shù)(r),以3倍信噪比為檢出限(LOD)、10倍信噪比為定量限(LOQ)。如表3所示,18種抗生素在10~250 μg/L 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r均大于0.995,方法檢出限為0.013~2.679 μg/kg,方法定量限為0.042~8.929 μg/kg。

        2.4.2 精密度 向空白有機肥樣品中添加一定量標(biāo)準(zhǔn)儲備液后進行前處理,使上機溶液中抗生素理論濃度為 50.0 μg/L,按“1.5”節(jié)色譜條件及“1.6”節(jié)質(zhì)譜條件連續(xù)進樣6次。如表4所示,抗生素保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均在5%以內(nèi),濃度的RSD均在10%以內(nèi),空白加標(biāo)回收率在89.2%~106.1%之間,說明方法精密度良好,前處理過程能夠有效提取出抗生素,液相色譜質(zhì)譜分析能夠保持結(jié)果的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性。

        2.4.3 實際樣品測定及加標(biāo)回收率 以基底為豬糞、雞糞或鴨糞某單一動物糞種的市售有機肥,作為實際樣品進行抗生素及加標(biāo)回收率測定,低水平加標(biāo)濃度為20.0 μg/L、高水平加標(biāo)濃度為160.0 μg/L。如表5所示,豬糞樣品中磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶有檢出,其余抗生素未檢出;雞糞樣品中氧氟沙星有檢出,其余抗生素未檢出;鴨糞樣品中磺胺吡啶、磺胺二甲異唑、磺胺間二甲氧嘧啶有檢出,其余抗生素未檢出。3種糞種的樣品加標(biāo)回收率均在70.0%~130%之間,高低水平加標(biāo)回收率無明顯差異,說明該方法適用于實際有機肥樣品中18種抗生素的測試。

        3 結(jié)論

        本研究建立了一種測定動物糞便基底有機肥中14種磺胺類抗生素、4種氟喹諾酮類抗生素殘留的固相萃取-高效液相色譜質(zhì)譜法。樣品經(jīng)提取凈化前處理后上機測試,9min即可完成單針分析。

        初始流動相標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線對比結(jié)果顯示,有機肥基底對測試無明顯基底效應(yīng),減輕了標(biāo)線配制難度。方法準(zhǔn)確度和精密度良好、靈敏度高,適用于動物糞種制成的有機肥中常見抗生素痕量殘留的分析檢測。鑒于目前沒有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),本研究結(jié)果可為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制訂提供依據(jù)。

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