張力鵬 滕彥嬌 王宏鵬 李天宇 宋文芹 陳成彬

摘要：以西藏大花紅景天為研究對象，用MISA軟件篩選轉(zhuǎn)錄組測序獲得的48 790條unigene，開發(fā)EST-SSR（表達序列標簽-微衛(wèi)星序列）并對其通用性進行分析，以期為紅景天屬物種的遺傳多樣性研究和分子標記輔助育種奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，共檢測出10 761個SSR位點，分布于8 973條unigene中，分布頻率為22.06%，平均分布距離為4.725 kb。優(yōu)勢重復(fù)基序以單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸為主，其中單核苷酸重復(fù)單元以基序A/T為主，共7 167個，二核苷酸重復(fù)單元以AG/CT為主，共1 008個。隨機合成280對引物，其中248對表現(xiàn)出有效擴增，54對具有多態(tài)性。此外，SSR引物在長鞭紅景天、狹葉紅景天、菊葉紅景天、圣地紅景天、柴胡紅景天、高山紅景天中具有較高的通用性，擴增效率分別為75.0%、73.75%、72.5%、62.5%、70.0%、72.5%。

關(guān)鍵詞：大花紅景天;轉(zhuǎn)錄組;SSR;通用性分析

中圖分類號： S567.23+9.01? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）11-0040-08

收稿日期：2020-08-29

作者簡介：張力鵬（1989—），男，河北滄州人，博士，助理研究員，主要從事中藥材種質(zhì)資源品種改良研究。E-mail：nknanhai@163.com。

通信作者：陳成彬，博士，副教授，主要從事中藥材種質(zhì)資源與品種改良研究。E-mail：chencb@nankai.edu.cn。

紅景天是雙子葉薔薇目（Rosales）景天科（Crassulaceae）紅景天屬（Rhodiola L.）植物，因其根或根莖的浸出液為紅色而得名[1]。全世界紅景天屬植物共有90多種，其中我國占有主要的種質(zhì)資源有70多種，主要分布在海拔（3 500～5 000 m）較高的山區(qū)，包括青藏高原及其毗鄰帶、橫斷山脈、天山山脈等[2-4]。其中以西藏占有的種類最多，為32種;四川次之，為22種;新疆為14種。紅景天常被稱作“高原人參”或“雪山仙草”應(yīng)用于傳統(tǒng)中醫(yī)和藏醫(yī)種，已經(jīng)有數(shù)千年的歷史。目前主要藥用種為薔薇紅景天（R. rosea）、大花紅景天（R. crenulata）、菊葉紅景天（R. sachalinensis）、圣地紅景天（R. sacra）、齒葉紅景天（R. serrata）、高山紅景天（R. cretinii）和長鞭紅景天（R. fastigiata）等[5-7]?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，紅景天根部含有40多種活性物質(zhì)如紅景天苷、沒食子酸、苷原酪醇及其衍生物等，具有抗氧化、抗缺氧、抗輻射、抗衰老、抗疲勞、提高機體免疫力等作用。其中以大花紅景天的活性物質(zhì)含量最高、藥效最好、使用最為廣泛。因此《中華人民共和國藥典》2015版中唯一指定的入藥種為大花紅景天[8]。

基于多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR）的分子標記技術(shù)具有多態(tài)性好、遺傳性高、穩(wěn)定性強、簡單迅速的特點，已逐漸成為研究植物物種遺傳多樣性的有力工具[9]。其中簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）也稱微衛(wèi)星，能夠均勻、隨機地分布于植物基因組DNA中，具有數(shù)量豐富、穩(wěn)定性高和簡單便捷等優(yōu)點[10-12]。2013年，You等篩選分離了柴胡紅景天的17對多態(tài)性引物以擴增微衛(wèi)星位點（CCG）6、（AAG）8、（AGG）6、（CT）13、（AGC）6、（AC）10和（ATC）6，并將其成功應(yīng)用于大花紅景天、長鞭紅景天和圣地紅景天[13]。雷淑蕓等基于高通量測序技術(shù)對唐古特紅景天全基因組的SSR位點進行了分析，為紅景天屬植物SSR標記的開發(fā)奠定了一定基礎(chǔ)[14]。然而，目前對紅景天基因組SSR的研究依然較少，特別是關(guān)于主要入藥種大花紅景天的SSR位點尚無報道。

本研究基于大花紅景天莖/葉混樣轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）所獲得的數(shù)據(jù)，利用MISA軟件對SSR標記進行搜索，分析其分布與組成特征，并對其擴增效率和通用性進行了初步評價，以期為紅景天屬植物的分類與鑒定、親緣關(guān)系和遺傳多樣性研究、種質(zhì)資源利用和分子標記輔助育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究用于引物篩選和通用性分析的所有植物材料均為野生種，于2015年7月15日至7月22日采自中國西藏地區(qū)。4個地理居群的大花紅景天（Rhodiola crenualta）分別采集于拉薩市米拉山（RcML）海拔4 868.4 m處、山南地區(qū)浪卡子縣（RcLK）海拔5 237.2 m處、林芝市色季拉山（RcSJ）海拔4 688 m處、那曲地區(qū)嘉黎縣（RcJL）海拔4 499 m 處。其他6種紅景天屬材料分別為長鞭紅景天（Rhodiola fastigiata，Rfa）、柴胡紅景天（Rhodiola bupleuroides，Rbu）、圣地紅景天（Rhodiola sacra，Rsa）、菊葉紅景天（Rhodiola chrysanthemifolia，Rch）、狹葉紅景天（Rhodiola kirilowii，Rki）和高山紅景天（Rhodiola cretinii，Rcr）。將上述材料的葉片用無菌水洗凈并擦干后，再用液氮速凍，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和PCR擴增 紅景天葉片基因組的提取采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[15]。用1%瓊脂糖凝膠電泳和可見分光光度計NanoDrop 1000檢測樣品DNA的質(zhì)量，保證所有DNA樣品的濃度在300～500 ng/μL之間，D260 nm/D230 nm和D260 nm/D280 nm均在1.8～2.2之間，且無RNA污染。將各DNA樣品稀釋到濃度為50? ng/μL后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴增反應(yīng)體系為25 μL，包括2×U Taq PCR Mix（Zoman Biotechnology，Beijing，China）12.5 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR擴增程序：94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，33個循環(huán);72 ℃ 5 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源 以海拔4 868.4、5 237.2 m處的大花紅景天（RcML、RcLK）為材料，用CTAB法分別提取葉片、莖的總RNA，等量混勻后，分別標記為Rc4800、Rc5200后備用[16]。轉(zhuǎn)錄組測序由上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司完成，使用Illumina HiSeqTM 2500測序儀完成。將測序得到的reads用Trinity（vesion：trinityrnaseq_r20131110）軟件paired-end的拼接方法得到Transcript序列，并用TGICL軟件延伸得到Unigene[17-18]。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組SSR檢測和引物設(shè)計 用軟件MISA（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）對轉(zhuǎn)錄組拼接unigene的SSR位點進行搜索。搜索標準如下：重復(fù)單元長度為1～6 bp時，單核苷酸重復(fù)次數(shù)≥10次，二核苷酸重復(fù)次數(shù)≥6次，三、四、五、六核苷酸重復(fù)次數(shù)≥5次。

用Primer Premier 3軟件對具有SSR位點的unigene序列設(shè)計引物。設(shè)計原則如下：引物序列長度為18～25 bp，擴增產(chǎn)物大小為80～300 bp，GC含量為40%～65%，退火溫度為55～65 ℃且上、下游引物的退火溫度相差不大于2 ℃，避免出現(xiàn)錯配、引物二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)。從設(shè)計好的引物中隨機選擇280對送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 大花紅景天轉(zhuǎn)錄組測序、unigene組裝與注釋

通過Illumine測序平臺共得到81 105 580 raw reads（原始讀序），通過對raw reads進行質(zhì)量監(jiān)控，過濾低質(zhì)量的reads后，Rc5200獲得40 584 060個clean reads（有效讀序），Rc4800獲得40 521 520個clean reads。用de novo拼接技術(shù)將有overlap（重疊區(qū)）的clean reads連接成1個更長的序列，使用Trinity （vesion：trinityrnaseq_r20131110）軟件的paired-end方法不斷延伸然后拼接成transcript（轉(zhuǎn)錄本序列），通過TGICL軟件聚類、去掉冗余序列，最終得到1套unigene（單基因序列）（圖1）。本研究共得到48 790條unigene，總長度為50 851 045 bp，平均大小為1 042.24 bp，其中最長的為15 505 bp，最短的為301 bp。

基于BLAST對de novo拼接的unigene進行功能注釋和分類，通過BLASTx將unigene序列分別與NR、SWISSPROT和KOG庫進行比對，取e<1×10-5的注釋，選擇與unigene相似性最高的蛋白，將其功能作為該unigene蛋白功能的注釋信息。5個數(shù)據(jù)庫注釋統(tǒng)計結(jié)果如下：NR注釋到31 024條（63.59%），SWISSPROT注釋到23 770條（48.72%），KOG注釋到19 792條（40.57%），KEGG注釋到7 773條（15.93%），GO注釋到20 660 條（42.34%）。

根據(jù)KOG功能分類的結(jié)果，其中大部分unigene注釋到R（即一般性功能預(yù)測），其數(shù)量為7 228個，3 665條unigene注釋到O（即次生代謝產(chǎn)物的合成、轉(zhuǎn)運和代謝）， 2 942條unigene注釋到T（即信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制），此外K（轉(zhuǎn)錄）、A（RNA的加工和修飾）、J（翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成）、U（胞質(zhì)運輸、分泌和囊泡運輸）、G（碳水化合物轉(zhuǎn)運與代謝）、C（能源的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化）、I（脂質(zhì)轉(zhuǎn)運與代謝）、E（氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝）也均在1 000條unigene以上。GO功能分類可以在基因的分子功能、細胞成分、參與的生物過程3個方面對其進行分類。對所獲得的unigene基因進行GO分類，結(jié)果顯示在分子功能中，binding、catalytic activity（結(jié)合、催化活性）類最多;在細胞成分中，cell、cell part（細胞、細胞成分）最多，分別為15 830、15 792條;在生物過程中，cellular process、metabolic process（細胞過程、代謝過程）最多，分別為14 116、12 057條（圖2）。

2.2 大花紅景天轉(zhuǎn)錄組SSR位點的分布

用軟件MISA對48 790條unigene的SSR位點進行搜索，結(jié)果顯示，符合條件的SSR共有10 761個，分布頻率（總SSR位點數(shù)/總unigene數(shù)）為22.06%，平均分布距離（總unigene長度/總SSR位點數(shù)）為4.725 kb。含有SSR位點的unigene為8 973 條，發(fā)生頻率（含有SSR位點的unigene/總unigene數(shù)）為18.39%。其中有1 512條unigene含有2個及以上SSR位點，449條unigene含有復(fù)合SSR位點。SSR位點的序列總長度為16 590 bp。

由表1可以看出，大花紅景天轉(zhuǎn)錄組SSR的類型較為豐富，單核苷酸、多核苷酸重復(fù)類型均有分布，但是不同類型的比例差異顯著。主要為單核苷酸重復(fù)類型，為7 207個，占總SSR位點數(shù)的66.97%，平均分布距離為5.622 kb。其次為二核苷酸、三核苷酸重復(fù)類型，分別含有1 468、1 960個位點，分別占SSR位點數(shù)的13.64%、18.21%，平均分布距離分別為27.603、20.674 kb;四、五、六核苷酸重復(fù)類型較少，均不多于80個位點，分別為80、29、17個。

2.3 大花紅景天轉(zhuǎn)錄組SSR基序重復(fù)類型和頻率特征

對大花紅景天轉(zhuǎn)錄組SSR基序類型進行分析顯示，共有82種重復(fù)基序，單、二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)各有2、4、10、23、27、16種;重復(fù)次數(shù)主要為5～24次，不同重復(fù)次數(shù)的SSR位點數(shù)目不同，主要為5、10、11次重復(fù)類型（圖3）。

由表1可以看出，大花紅景天轉(zhuǎn)錄組不同SSR基序出現(xiàn)的頻率相差較大，以單、二、三核苷酸重復(fù)基序為主要類型，占總SSR位點的98.83%。其中以基序A/T最多，為7 167個，其次為AG/CT（1 008個）。單核苷酸重復(fù)基序主要為A/T，重復(fù)次數(shù)集中在10～14次，而G/C較少，僅有40個，且重復(fù)次數(shù)主要為10～13次。二核苷酸重復(fù)基序主要為AG/CT，其次為AT/AT（266個）和AC/GT（193個），CG/CG僅含有1個，主要重復(fù)次數(shù)為5～11次。三核苷酸重復(fù)基序中AAG/CTT最多，為427個，其次為ATC/ATG（323個）、AGC/CTG（315個）、AGG/CCT（271個）、AAC/GTT（225個）、ACC/GGT（194個），其余4種均未超過100個，主要重復(fù)次數(shù)為5～7次。四、五、六核苷酸重復(fù)類型雖然最多，但是數(shù)量較少，除AAAG/CTTT、AAAT/ATTT類型分別為12、10個外，其他66種類型均低于10個。

2.4 大花紅景天SSR引物的開發(fā)和通用性檢測

基于含有SSR位點的unigene序列，利用Primer Premier 3軟件設(shè)計引物，每條unigene產(chǎn)生3對引物。共得到18 696對符合條件的引物，分別位于6 232條unigene上。隨機挑選280對引物，包括單核苷酸（125對）、二核苷酸（32對）、三核苷酸（48對）、四核苷酸（51對）、五核苷酸（14對）、六核苷酸（9對）。以4個地理居群的大花紅景天DNA為模板對上述引物進行擴增，共246對引物能夠擴增出與預(yù)期產(chǎn)物大小一致的特異性條帶，有效擴增率為87.86%。不同SSR重復(fù)類型引物的擴增成功率分別為89.6%、90.63%、79.17%、94.12%、78.57%、88.89%。此外54/246對引物在不同產(chǎn)地大花紅景天中的擴增產(chǎn)物具有多態(tài)性，占有效引物的21.95%。共擴增得到167條電泳條帶，其中多態(tài)性片段為95條，平均每對引物產(chǎn)生的多態(tài)性片段為1.76條（圖4）。

為了進一步驗證大花紅景天轉(zhuǎn)錄組SSR引物是否對其他種具有通用性，在246對引物中隨機選擇80對引物，以6種紅景天（Rfa、Rbu、Rki、Rcr、Rsa、Rch）的DNA為模板進行擴增。結(jié)果顯示，大花紅景天轉(zhuǎn)錄組SSR引物對長鞭紅景天、狹葉紅景天、菊葉紅景天、圣地紅景天、柴胡紅景天和高山紅景天的PCR擴增成功率較高，分別為75%、73.75%、72.5%、62.5%、70.0%、72.5%。用篩選到的54對大花紅景天SSR多態(tài)性引物（表2）對20個樣品，包括4個產(chǎn)地（RcML、RcLK、RcJL、RcLZ）的大花紅景天和6種紅景天進行PCR擴增，每個樣品包含2個重復(fù)。結(jié)果顯示，45/54對SSR引物在10個樣本中均能夠擴增出清晰明亮的多態(tài)性產(chǎn)物條帶?；跀U增產(chǎn)物多態(tài)性信息，利用NtSYS 2.1軟件構(gòu)建上述樣品的遺傳進化樹，結(jié)果顯示，紅景天屬植物的種間遺傳多態(tài)性顯著高于種內(nèi)。由此可見，不同地理居群的大花紅景天明顯聚為1支，狹葉紅景天、菊葉紅景天和圣地紅景天明顯聚為1支，柴胡紅景天、長鞭紅景天和高山聚為1支（圖5）。

3 討論與結(jié)論

近年來，隨著紅景天藥用價值和保健價值的逐漸開發(fā)，人們對其需求量也與日俱增。然而由于缺少人工栽培技術(shù)，對紅景天種質(zhì)資源的掠奪和破壞十分嚴重，從而引起多個物種資源數(shù)量急劇下降，極大破壞了凍原植被帶的高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)[19]。此外，紅景天屬植物多分布于海拔較高的山區(qū)，因生長環(huán)境惡劣，常伴有低溫、低氧、強紫外等特點，使得對其采集和研究均十分困難[20-22]。本研究對

2種海拔地區(qū)的大花紅景天進行轉(zhuǎn)錄組測序，基于測序結(jié)果分析SSR分子標記的類型與分布情況，并對SSR引物的有效性和通用性進行評估，為進一步開展紅景天屬植物遺傳多樣性分析、物種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、分子標記輔助育種和功能基因的發(fā)掘提供堅實的理論基礎(chǔ)。

根據(jù)表達序列標簽（EST）開發(fā)SSR分子標記具有簡單、便捷等特點，特別對于尚無參考基因組序列的非模式植物而言，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以獲得大量基因序列，為開發(fā)該物種的SSR分子標記提供有力的基礎(chǔ)[23]。目前已對多個物種的SSR位點進行了比較詳盡的研究，如黑綠豆（Vigna mungo）[24]、花生（Arachis hypogaea）[25]、綠豆（Vigna radiate）[26]、赤小豆（Vigna umbellata）[27]、豇豆（Vigna unguiculata）[28]、洋麻（Hibiscus cannabinus）[29]、開心果（Pistacia vera）[30]、白樺（Betula platyphylla）[31]、苜蓿（Medicago sativa）[32]和刺梨（Rosa roxburghii）[33]等。本研究通過對轉(zhuǎn)錄組組裝的unigene序列SSR位點進行搜索，共得到10 761 個SSR，分布頻率為22.06%，平均分布距離為4.725 kb，與已報道的萬壽菊（Tagetes erecta）[34]、柑橘（Citrus sinensis osbeck）[35]、蘿卜（Raphanus sativus）[36]等相似。不同物種的SSR重復(fù)類型十分不同，如大花紅景天SSR重復(fù)基序類型以單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復(fù)類型最多，占總位點數(shù)的98.83%，且A/T重復(fù)10次的最多，為2 899個，占總位點的26.93%，這一結(jié)果與綠豆的SSR分布相似[26]。ACG/AGT、CG/CG重復(fù)基序比例最少，與刺梨的結(jié)果一致[33]。

在隨機合成的280對引物中，有249對引物可以在4個地理居群的大花紅景天中成功擴增，比例較高，為87.86%，且篩選到54對多態(tài)性引物。說明大花紅景天的種內(nèi)遺傳變異較小。此外，隨機挑選的80對引物對6種紅景天植物擴增成功率均在60%以上，說明利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)的大花紅景天SSR具有較高的通用性，為其他紅景天種材料提供了較為豐富的SSR信息來源。通過對多態(tài)性擴增產(chǎn)物構(gòu)建進化樹可以觀察到紅景天屬植物的種內(nèi)遺傳變異明顯小于種間，且圣地紅景天與菊葉紅景天明顯聚為一支，長鞭紅景天與柴胡紅景天聚類關(guān)系較近，這與筆者所在實驗室前期基于DNA條形碼（ITS）所獲得紅景天屬植物聚類結(jié)果[37]一致。說明SSR分子標記技術(shù)可以作為區(qū)分紅景天屬植物類群的重要手段。

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