張二豪 張杰

摘要：近年來的研究顯示，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是強(qiáng)有力的基因編輯新技術(shù)。以蝗綠僵菌為試驗對象，以同源重組敲除系統(tǒng)為對照，研究CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除蝗綠僵菌的基因isp4核苷酸序列。闡明了CRISPR/Cas9載體構(gòu)建的方法，比較了CRISPR/Cas9和Recombinase敲除技術(shù)的異同，最后通過PCR和突變菌株的表型驗證了CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠應(yīng)用于綠僵菌。結(jié)果表明，CRISPR/Cas9在昆蟲病原真菌綠僵菌中是有效的基因編輯技術(shù)。

關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas9;重組酶;基因編輯;綠僵菌

中圖分類號： S188? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）11-0048-06

收稿日期：2020-10-09

基金項目：周口師范學(xué)院高層次人才科研啟動經(jīng)費研究項目（編號：2018B180061）;西藏自治區(qū)自然科學(xué)基金 （編號：XZ2018ZRG-19）。

作者簡介：張二豪（1989—），男，河南平頂山人，碩士，講師，主要研究方向為分子生物學(xué)。E-mail：1158496424@qq.com。

通信作者：張 杰，博士，講師，主要研究方向為分子生物學(xué)與生物工程。E-mail：Zhangjiezk@qq.com。

分子遺傳修飾和基因工程技術(shù)需要精確地改變基因組的核苷酸序列。隨著基因修飾新技術(shù)的不斷發(fā)展，某些基因可被敲除或被降低表達(dá)水平[1]，這些技術(shù)為基因功能的研究提供了便捷的途徑?；蚓庉嬀褪菍?xì)胞基因組中目的基因的核苷酸序列甚至是單個核苷酸進(jìn)行替換、切除，增加或者是插入外源的DNA序列，使之產(chǎn)生可遺傳的改變，進(jìn)而研究其功能的手段[2]。綠僵菌的研究已有135年的歷史[3]，它作為一個昆蟲病原真菌的模式絲狀真菌，常常用來研究真核細(xì)胞的生物學(xué)過程、基因的相關(guān)表型和侵染昆蟲致病的過程。

為了更好地研究病原真菌的基因特征，多種基因操作技術(shù)已經(jīng)在綠僵菌研究中應(yīng)用[4]。以位點為靶向的DNA內(nèi)切酶是基因編輯技術(shù)中強(qiáng)有力的方法之一[5]。這些內(nèi)切酶能在基因組范圍內(nèi)與靶向序列直接結(jié)合，進(jìn)而使DNA雙鏈斷裂，斷裂的DNA被修復(fù)過程中產(chǎn)生DNA序列的修飾。開發(fā)這些工具酶的起始方向集中在同源內(nèi)切酶、鋅指內(nèi)切酶和轉(zhuǎn)錄激活內(nèi)切酶類[6-7]。與傳統(tǒng)突變體材料的獲得方法相比，基因編輯技術(shù)能定向改變基因的組成和結(jié)構(gòu)，具有高效、可控和定向操作的優(yōu)點[8-9]。在目標(biāo)基因DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂[10]的基礎(chǔ)上進(jìn)行基因編輯是傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)的共同之處，但是各種基因編輯技術(shù)的原理及作用方式并不相同。

同源內(nèi)切酶利用單一結(jié)構(gòu)域識別和切割雙鏈DNA[11]的基因編輯技術(shù)具有一定的局限性。CRISPR/Cas9是新一代的識別和綁定特異DNA序列為導(dǎo)向的基因編輯技術(shù)[12]。Generoso等首次報道，CRISPR/Cas作為特異的短間隔序列，成簇存在于大腸桿菌（Escherichia coli）基因組內(nèi)的特殊短重復(fù)序列之中[13]。隨后的研究表明，CRISPR位點在細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中分別占40%和90%，這些位點具有適應(yīng)性的免疫功能[14]。在2012年，CRISPR/Cas9在鏈球菌（Streptococcus pyogenes）中，通過錨定crRNA 5′端的20 nt核苷酸序列行使功能[15]。經(jīng)過優(yōu)化的CRISPR/Cas9系統(tǒng)編碼序列在哺乳動物細(xì)胞中可以高度激活[16-17]。在實際操作時，在sgRNA上5′ 端設(shè)計的20 nt核苷酸序列能夠與目標(biāo)基因完全互補(bǔ)，即可達(dá)到基因編輯的作用[18]?；蚓庉嫾夹g(shù)CRISPR/Cas9在高等真核生物上已經(jīng)成功應(yīng)用[19-20]。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯過程實質(zhì)上是非同源末端重組（non-homologous end joining，NHEJ）修復(fù)和同源末端重組修復(fù)（homology-directed repair，HDR）過程[21]。與傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)最大的優(yōu)點是易形成基因序列倍增，這些倍增區(qū)域在sgRNA的錨定下很容易突變[22]。如果2個sgRNA位于基因組側(cè)的兩翼，它們中間區(qū)域的基因組會被刪除或發(fā)生顛倒[23-24]。通過雙sgRNA可以進(jìn)行基因組序列置換[25]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的高效和便利，促使它很快地成為了細(xì)菌、植物和細(xì)胞培養(yǎng)時的基因編輯工具。CRISPR/Cas9可以直接導(dǎo)入到受精卵中進(jìn)行早期的胚胎基因修飾，進(jìn)而獲得基因修飾動物[26-27]。在基因組編輯工具應(yīng)用時，通常是將含有特殊啟動子的CRISPR/Cas9質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或電激法送到目的細(xì)胞內(nèi)[27-28]。然而CRISPR/Cas9基因系統(tǒng)在昆蟲病原真菌中的應(yīng)用尚未見報道。

本研究以蝗綠僵菌為材料，同源重組敲除系統(tǒng)為對照，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除蝗綠僵菌的基因isp4核苷酸序列。試驗結(jié)果顯示，CRISPR/Cas9敲除載體構(gòu)建的方法和Recombinase敲除載體的構(gòu)建技術(shù)不同，PCR和突變菌株的表型驗證了CRISPR/Cas9基因編輯和Recombinase基因編輯技術(shù)一樣成功應(yīng)用于綠僵菌。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

蝗綠僵菌（Metarhizium acridum）（CGMCC No.1877），將該菌株接種到1/4薩氏葡萄糖酵母培固體養(yǎng)基（1/4SDA）上，28 ℃，避光倒置培養(yǎng)。DNA提取時用液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)后經(jīng)過真空抽濾獲得菌絲體。

大腸桿菌（Escherichia coli DH5α，鼎國試劑公司），固體培養(yǎng)時，將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株接種到LB固體培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)基含有終濃度50～100 μg/mL的卡那霉素。綠僵菌轉(zhuǎn)化時選擇的培養(yǎng)基為細(xì)胞核分離基液（NIM）培養(yǎng)基，含有終濃度400 μg/mL的抗草丁膦（PPT）。選擇性靶基因為PPT基因。

1.2 質(zhì)粒

商業(yè)人工改造質(zhì)粒CRISPR/Cas9 pGK1.1 （Puror）和同源敲除質(zhì)粒PUC19，含有抗卡那霉素和PPT基因。

1.3 核酸操作

將含有抗性的大腸桿菌接種到液體LB培養(yǎng)基中，經(jīng)過離心獲得菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒（TIANGEN）獲得質(zhì)粒DNA。

將綠僵菌菌絲體用液氮研磨，然后用基因組DNA提取試劑盒（Omega）提取，Taq Plus DNA Polymerase （TIANGEN）進(jìn)行PCR克隆，進(jìn)而獲得目標(biāo)核苷酸序列。

目標(biāo)片段和質(zhì)粒的連接用NovoRecPCR一步定向克隆操作。其余的分子生物學(xué)技術(shù)按照參考文獻(xiàn)[14]執(zhí)行。

1.4 轉(zhuǎn)化試驗

根據(jù)轉(zhuǎn)化說明書（Invitrogen）將改造的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到E.coli感受態(tài)細(xì)胞;用電轉(zhuǎn)化的方法，將目標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)根癌農(nóng)桿菌中;然后根據(jù)參考文獻(xiàn)將含有抗性質(zhì)粒的膿桿菌和綠僵菌孢子接種于含有PPT的固體培養(yǎng)基上，進(jìn)而獲得轉(zhuǎn)化的綠僵菌。

1.5 轉(zhuǎn)化子純化

轉(zhuǎn)化后，被轉(zhuǎn)化的目的菌株經(jīng)過PCR驗證，然后在篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)，保存菌種以便后續(xù)試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR/Cas9和 Recombinase編輯系統(tǒng)的識別基礎(chǔ)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要是依靠crRNA（CRISPR-derived RNA）通過堿基配對與tracrRNA（trans-activating RNA）結(jié)合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元復(fù)合體指導(dǎo)Cas9蛋白在crRNA引導(dǎo)序列靶定位點切斷雙鏈DNA。在基因組編輯過程中，tracrRNA和crRNA可以融合成為1條RNA（sgRNA）表達(dá)，同樣可以起到靶向剪切的作用。靶向剪切的鏈缺口會促進(jìn)同源重組，從而達(dá)到基因編輯的目的（圖1-A）。對照Recombinase基因編輯技術(shù)主要依靠靶基因兩側(cè)左右臂引導(dǎo)生物本身的重組酶到靶位點進(jìn)行基因編輯（圖1-B）。由此可知，這2種基因編輯系統(tǒng)錨定目的基因位置的方式是不一致的。

2.2 CRISPR/Cas9和Recombinase基因編輯質(zhì)粒的構(gòu)建

基因編輯過程中，最重要的是構(gòu)建一個高效的質(zhì)粒載體。CRISPR/Cas9和Recombinase基因編輯系統(tǒng)的載體都是建立在商業(yè)質(zhì)粒Puc19的基礎(chǔ)之上。由圖2-A可知，把優(yōu)化的U6啟動子（U6）、核定位基因序列（NLS）、Cas9蛋白基因、BGHpA、抗性基因和GFP序列共同整合到商業(yè)質(zhì)粒pUC19中。在U6啟動子后有一個靶基因酶切位點EcoRⅤ。Recombinase基因編輯系統(tǒng)是把抗性篩選PPT基因（含啟動子）和GFP序列連接到商業(yè)質(zhì)粒pUC19中（圖2-B）。由此可知，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)質(zhì)粒的構(gòu)建比Recombinase基因編輯系統(tǒng)復(fù)雜。CRISPR/Cas9基因編輯質(zhì)粒含有多個基因敲除元件，而對照Recombinase基因編輯系統(tǒng)的質(zhì)粒中只含有Bar基因序列和GFP序列。由此可知，構(gòu)建的初始敲除質(zhì)粒CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)比Recombinase基因編輯系統(tǒng)含有更多的復(fù)雜元件。

2.3 CRISPR/Cas9和 Recombinase基因編輯系統(tǒng)敲除isp4基因

為證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠在綠僵菌上應(yīng)用，經(jīng)過生物信息學(xué)分析獲得了綠僵菌性別分化基因isp4的mRNA序列（XM_007813236.1），作為敲除的目的基因。構(gòu)建CRISPR/Cas9基因編輯載體時只需在該基因的mRNA編碼序列中找到靶序列位點（GN20GG），然后在該序列的兩側(cè)加上接頭 （F：TATATCTTGTGGAAAGGACGAT;接頭R：GGTGCCACTTTTTCAAGTTGAT） 和gRNA序列即可。

通過CasFinder軟件或word的查找功能均可找到以下19條靶序列（表1）。

以第1條靶序列為例合成如下的寡核苷酸序列：

casF：TATATCTTGTGGAAAGGACGATGGTATAGGCTTTTGCATCATCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG;

casR：GGTGCCACTTTTTCAAGTTGATCGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCCGATGATGCAAAAGCCTATACC。

將上述引物交給公司合成PAGE 純化寡核苷酸。然后寡核苷酸退火，退火后的寡核苷酸可以立刻使用或者在-20 ℃條件下長期保存。用EcoR Ⅴ酶切CRISPR/Cas9基因編輯載體致使其線性化，回收后即可根據(jù)NovoRecPCR一步定向克隆試劑盒說明書將上述退火后的寡核苷酸連接到線性化的CRISPR/Cas9 基因編輯載體上。陽性克隆用引物gRNA-F和gRNA-R進(jìn)行 PCR驗證時，能夠擴(kuò)增出180 bp的條帶（圖3-A），表明載體構(gòu)建正確。

用生物信息學(xué)方法獲得了綠僵菌性別分化基因isp4及其側(cè)翼序列，該序列左臂含有EcoR Ⅴ （GATATC） 酶切位點和BamHⅠ（GGATCC）酶切位點，右臂含有HindⅢ （AAGCTT） 酶切位點。故構(gòu)建Recombinase基因編輯載體時選用BamHⅠ和EcoRⅠ酶先后線性化載體。

根據(jù)NovoRecPCR一步定向克隆試劑盒說明書設(shè)計PCR擴(kuò)增左右臂的引物和接頭見表2。

經(jīng)過PCR擴(kuò)增獲得敲除載體的左右臂，經(jīng)過酶切后獲得線性化載體，根據(jù)NovoRecPCR一步定向克隆試劑盒說明書構(gòu)建成Recombinase基因編輯載體。經(jīng)過轉(zhuǎn)化的陽性克隆用引物isp4F和isp4R能夠擴(kuò)增出2 800 bp的DNA條帶（圖3-A）。

含CRISPR/Cas9和Recombinase載體的農(nóng)桿菌侵染綠僵菌后獲得陽性敲除綠僵菌孢子，熒光顯微鏡觀察看到綠色熒光的綠僵菌孢子（圖3-B和圖3-C）。上述結(jié)果表明了isp4基因的CRISPR/Cas9和Recombinase敲除載體成功在綠僵菌中表達(dá)。

為一步證明綠僵菌敲除載體被正確敲除，用RT-PCR對isp4基因的表達(dá)量（引物RT-PCR-isp4F和 RT-PCR-isp4R）進(jìn)行了驗證（圖4），菌落形態(tài)的觀察也證明了2種敲除方法均改變了目的菌株的基因。這些結(jié)果表明isp4基因能夠被正確敲除。

3 討論

綠僵菌作為一種昆蟲病原真菌的模式真菌，敲除技術(shù)限制影響了對其基因序列的大規(guī)模操作。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)首先在細(xì)菌中被報道，隨后被應(yīng)用于動植物的基因靶向技術(shù)，不斷得到優(yōu)化[29-30]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性被限制在sgRNA 5′端20 nt 的位點，這20 nt的核苷酸和靶向DNA進(jìn)行Watson-Crick RNA-DNA容錯性堿基配對，也有可能形成脫靶效應(yīng)[22]。再者，多個物種的Cas9通過識別各自的sgRNA骨架，可在同一細(xì)胞中執(zhí)行不同的功能，彼此之間互不干擾[9]。CRISPR/Cas9的特異性與靶序列的長度和構(gòu)成及Cas9和sgRNA的濃度有關(guān)。sgRNA靶序列中鳥嘌呤和胞嘧啶含量過高或過低都會影響打靶效應(yīng)[7]。

CRISPR/Cas9技術(shù)是基因編輯有力的工具，且被廣泛應(yīng)用，但它仍是相對新穎的技術(shù)，還有待提高。目前，CRISPR/Cas9技術(shù)的瓶頸是如何降低脫靶風(fēng)險。正如上所述，降低CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)包括縮短sgRNA、用雙切口dCas-FokI等方法。每條sgRNA序列都含有變化的脫靶位點，故在試驗時，須要仔細(xì)分析影響脫靶的因素，降低脫靶效率。近年來積累了很多檢測脫靶突變的方法，可以讓研究者更有效地預(yù)測脫靶效應(yīng)[10，26]。眾所周知，基因編輯技術(shù)的效應(yīng)與內(nèi)切核酸酶在識別基因組上的特異位點相關(guān)。例如，轉(zhuǎn)錄因子及近年來研究的CRISPR/Cas9易結(jié)合于基因組DNA[21]。轉(zhuǎn)錄因子綁定和染色質(zhì)重塑與組氨酸修飾有關(guān)[16]。由于基因組序列表觀修飾和基因序列變化的復(fù)雜性，研究者仍然缺乏對CRISPR/Cas9的酶活性和DNA綁定對CRISPR/Cas9效果的認(rèn)識[20，31]。

在本研究中，利用CRISPR/Cas9技術(shù)和Recombinase技術(shù)同時敲除了綠僵菌的isp4基因。通過比較發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9技術(shù)和Recombinase技術(shù)一樣能夠成功應(yīng)用于昆蟲病原真菌（綠僵菌）。在研究過程中發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9在綠僵菌中也存在效率不是很高的現(xiàn)象。CRISPR/Cas9技術(shù)在構(gòu)建敲除質(zhì)粒骨架時比Recombinase技術(shù)復(fù)雜，但是一旦建成熟骨架，后續(xù)進(jìn)行大量基因敲除時就相對容易。對于CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)和轉(zhuǎn)化效率方面尚需進(jìn)一步研究。

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