張二豪 張杰

摘要：近年來(lái)的研究顯示，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是強(qiáng)有力的基因編輯新技術(shù)。以蝗綠僵菌為試驗(yàn)對(duì)象，以同源重組敲除系統(tǒng)為對(duì)照，研究CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除蝗綠僵菌的基因isp4核苷酸序列。闡明了CRISPR/Cas9載體構(gòu)建的方法，比較了CRISPR/Cas9和Recombinase敲除技術(shù)的異同，最后通過(guò)PCR和突變菌株的表型驗(yàn)證了CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠應(yīng)用于綠僵菌。結(jié)果表明，CRISPR/Cas9在昆蟲(chóng)病原真菌綠僵菌中是有效的基因編輯技術(shù)。

關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas9;重組酶;基因編輯;綠僵菌

中圖分類號(hào)： S188? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）11-0048-06

收稿日期：2020-10-09

基金項(xiàng)目：周口師范學(xué)院高層次人才科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)研究項(xiàng)目（編號(hào)：2018B180061）;西藏自治區(qū)自然科學(xué)基金 （編號(hào)：XZ2018ZRG-19）。

作者簡(jiǎn)介：張二豪（1989—），男，河南平頂山人，碩士，講師，主要研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)。E-mail：1158496424@qq.com。

通信作者：張 杰，博士，講師，主要研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)與生物工程。E-mail：Zhangjiezk@qq.com。

分子遺傳修飾和基因工程技術(shù)需要精確地改變基因組的核苷酸序列。隨著基因修飾新技術(shù)的不斷發(fā)展，某些基因可被敲除或被降低表達(dá)水平[1]，這些技術(shù)為基因功能的研究提供了便捷的途徑。基因編輯就是對(duì)細(xì)胞基因組中目的基因的核苷酸序列甚至是單個(gè)核苷酸進(jìn)行替換、切除，增加或者是插入外源的DNA序列，使之產(chǎn)生可遺傳的改變，進(jìn)而研究其功能的手段[2]。綠僵菌的研究已有135年的歷史[3]，它作為一個(gè)昆蟲(chóng)病原真菌的模式絲狀真菌，常常用來(lái)研究真核細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程、基因的相關(guān)表型和侵染昆蟲(chóng)致病的過(guò)程。

為了更好地研究病原真菌的基因特征，多種基因操作技術(shù)已經(jīng)在綠僵菌研究中應(yīng)用[4]。以位點(diǎn)為靶向的DNA內(nèi)切酶是基因編輯技術(shù)中強(qiáng)有力的方法之一[5]。這些內(nèi)切酶能在基因組范圍內(nèi)與靶向序列直接結(jié)合，進(jìn)而使DNA雙鏈斷裂，斷裂的DNA被修復(fù)過(guò)程中產(chǎn)生DNA序列的修飾。開(kāi)發(fā)這些工具酶的起始方向集中在同源內(nèi)切酶、鋅指內(nèi)切酶和轉(zhuǎn)錄激活內(nèi)切酶類[6-7]。與傳統(tǒng)突變體材料的獲得方法相比，基因編輯技術(shù)能定向改變基因的組成和結(jié)構(gòu)，具有高效、可控和定向操作的優(yōu)點(diǎn)[8-9]。在目標(biāo)基因DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂[10]的基礎(chǔ)上進(jìn)行基因編輯是傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)的共同之處，但是各種基因編輯技術(shù)的原理及作用方式并不相同。

同源內(nèi)切酶利用單一結(jié)構(gòu)域識(shí)別和切割雙鏈DNA[11]的基因編輯技術(shù)具有一定的局限性。CRISPR/Cas9是新一代的識(shí)別和綁定特異DNA序列為導(dǎo)向的基因編輯技術(shù)[12]。Generoso等首次報(bào)道，CRISPR/Cas作為特異的短間隔序列，成簇存在于大腸桿菌（Escherichia coli）基因組內(nèi)的特殊短重復(fù)序列之中[13]。隨后的研究表明，CRISPR位點(diǎn)在細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中分別占40%和90%，這些位點(diǎn)具有適應(yīng)性的免疫功能[14]。在2012年，CRISPR/Cas9在鏈球菌（Streptococcus pyogenes）中，通過(guò)錨定crRNA 5′端的20 nt核苷酸序列行使功能[15]。經(jīng)過(guò)優(yōu)化的CRISPR/Cas9系統(tǒng)編碼序列在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可以高度激活[16-17]。在實(shí)際操作時(shí)，在sgRNA上5′ 端設(shè)計(jì)的20 nt核苷酸序列能夠與目標(biāo)基因完全互補(bǔ)，即可達(dá)到基因編輯的作用[18]?；蚓庉嫾夹g(shù)CRISPR/Cas9在高等真核生物上已經(jīng)成功應(yīng)用[19-20]。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯過(guò)程實(shí)質(zhì)上是非同源末端重組（non-homologous end joining，NHEJ）修復(fù)和同源末端重組修復(fù)（homology-directed repair，HDR）過(guò)程[21]。與傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)是易形成基因序列倍增，這些倍增區(qū)域在sgRNA的錨定下很容易突變[22]。如果2個(gè)sgRNA位于基因組側(cè)的兩翼，它們中間區(qū)域的基因組會(huì)被刪除或發(fā)生顛倒[23-24]。通過(guò)雙sgRNA可以進(jìn)行基因組序列置換[25]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的高效和便利，促使它很快地成為了細(xì)菌、植物和細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的基因編輯工具。CRISPR/Cas9可以直接導(dǎo)入到受精卵中進(jìn)行早期的胚胎基因修飾，進(jìn)而獲得基因修飾動(dòng)物[26-27]。在基因組編輯工具應(yīng)用時(shí)，通常是將含有特殊啟動(dòng)子的CRISPR/Cas9質(zhì)粒通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或電激法送到目的細(xì)胞內(nèi)[27-28]。然而CRISPR/Cas9基因系統(tǒng)在昆蟲(chóng)病原真菌中的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以蝗綠僵菌為材料，同源重組敲除系統(tǒng)為對(duì)照，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除蝗綠僵菌的基因isp4核苷酸序列。試驗(yàn)結(jié)果顯示，CRISPR/Cas9敲除載體構(gòu)建的方法和Recombinase敲除載體的構(gòu)建技術(shù)不同，PCR和突變菌株的表型驗(yàn)證了CRISPR/Cas9基因編輯和Recombinase基因編輯技術(shù)一樣成功應(yīng)用于綠僵菌。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

蝗綠僵菌（Metarhizium acridum）（CGMCC No.1877），將該菌株接種到1/4薩氏葡萄糖酵母培固體養(yǎng)基（1/4SDA）上，28 ℃，避光倒置培養(yǎng)。DNA提取時(shí)用液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)后經(jīng)過(guò)真空抽濾獲得菌絲體。

大腸桿菌（Escherichia coli DH5α，鼎國(guó)試劑公司），固體培養(yǎng)時(shí)，將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株接種到LB固體培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)基含有終濃度50～100 μg/mL的卡那霉素。綠僵菌轉(zhuǎn)化時(shí)選擇的培養(yǎng)基為細(xì)胞核分離基液（NIM）培養(yǎng)基，含有終濃度400 μg/mL的抗草丁膦（PPT）。選擇性靶基因?yàn)镻PT基因。

1.2 質(zhì)粒

商業(yè)人工改造質(zhì)粒CRISPR/Cas9 pGK1.1 （Puror）和同源敲除質(zhì)粒PUC19，含有抗卡那霉素和PPT基因。

1.3 核酸操作

將含有抗性的大腸桿菌接種到液體LB培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)離心獲得菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒（TIANGEN）獲得質(zhì)粒DNA。

將綠僵菌菌絲體用液氮研磨，然后用基因組DNA提取試劑盒（Omega）提取，Taq Plus DNA Polymerase （TIANGEN）進(jìn)行PCR克隆，進(jìn)而獲得目標(biāo)核苷酸序列。

目標(biāo)片段和質(zhì)粒的連接用NovoRecPCR一步定向克隆操作。其余的分子生物學(xué)技術(shù)按照參考文獻(xiàn)[14]執(zhí)行。

1.4 轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

根據(jù)轉(zhuǎn)化說(shuō)明書(shū)（Invitrogen）將改造的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到E.coli感受態(tài)細(xì)胞;用電轉(zhuǎn)化的方法，將目標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)根癌農(nóng)桿菌中;然后根據(jù)參考文獻(xiàn)將含有抗性質(zhì)粒的膿桿菌和綠僵菌孢子接種于含有PPT的固體培養(yǎng)基上，進(jìn)而獲得轉(zhuǎn)化的綠僵菌。

1.5 轉(zhuǎn)化子純化

轉(zhuǎn)化后，被轉(zhuǎn)化的目的菌株經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證，然后在篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)，保存菌種以便后續(xù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR/Cas9和 Recombinase編輯系統(tǒng)的識(shí)別基礎(chǔ)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要是依靠crRNA（CRISPR-derived RNA）通過(guò)堿基配對(duì)與tracrRNA（trans-activating RNA）結(jié)合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元復(fù)合體指導(dǎo)Cas9蛋白在crRNA引導(dǎo)序列靶定位點(diǎn)切斷雙鏈DNA。在基因組編輯過(guò)程中，tracrRNA和crRNA可以融合成為1條RNA（sgRNA）表達(dá)，同樣可以起到靶向剪切的作用。靶向剪切的鏈缺口會(huì)促進(jìn)同源重組，從而達(dá)到基因編輯的目的（圖1-A）。對(duì)照Recombinase基因編輯技術(shù)主要依靠靶基因兩側(cè)左右臂引導(dǎo)生物本身的重組酶到靶位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯（圖1-B）。由此可知，這2種基因編輯系統(tǒng)錨定目的基因位置的方式是不一致的。

2.2 CRISPR/Cas9和Recombinase基因編輯質(zhì)粒的構(gòu)建

基因編輯過(guò)程中，最重要的是構(gòu)建一個(gè)高效的質(zhì)粒載體。CRISPR/Cas9和Recombinase基因編輯系統(tǒng)的載體都是建立在商業(yè)質(zhì)粒Puc19的基礎(chǔ)之上。由圖2-A可知，把優(yōu)化的U6啟動(dòng)子（U6）、核定位基因序列（NLS）、Cas9蛋白基因、BGHpA、抗性基因和GFP序列共同整合到商業(yè)質(zhì)粒pUC19中。在U6啟動(dòng)子后有一個(gè)靶基因酶切位點(diǎn)EcoRⅤ。Recombinase基因編輯系統(tǒng)是把抗性篩選PPT基因（含啟動(dòng)子）和GFP序列連接到商業(yè)質(zhì)粒pUC19中（圖2-B）。由此可知，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)質(zhì)粒的構(gòu)建比Recombinase基因編輯系統(tǒng)復(fù)雜。CRISPR/Cas9基因編輯質(zhì)粒含有多個(gè)基因敲除元件，而對(duì)照Recombinase基因編輯系統(tǒng)的質(zhì)粒中只含有Bar基因序列和GFP序列。由此可知，構(gòu)建的初始敲除質(zhì)粒CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)比Recombinase基因編輯系統(tǒng)含有更多的復(fù)雜元件。

2.3 CRISPR/Cas9和 Recombinase基因編輯系統(tǒng)敲除isp4基因

為證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠在綠僵菌上應(yīng)用，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析獲得了綠僵菌性別分化基因isp4的mRNA序列（XM_007813236.1），作為敲除的目的基因。構(gòu)建CRISPR/Cas9基因編輯載體時(shí)只需在該基因的mRNA編碼序列中找到靶序列位點(diǎn)（GN20GG），然后在該序列的兩側(cè)加上接頭 （F：TATATCTTGTGGAAAGGACGAT;接頭R：GGTGCCACTTTTTCAAGTTGAT） 和gRNA序列即可。

通過(guò)CasFinder軟件或word的查找功能均可找到以下19條靶序列（表1）。

以第1條靶序列為例合成如下的寡核苷酸序列：

casF：TATATCTTGTGGAAAGGACGATGGTATAGGCTTTTGCATCATCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG;

casR：GGTGCCACTTTTTCAAGTTGATCGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCCGATGATGCAAAAGCCTATACC。

將上述引物交給公司合成PAGE 純化寡核苷酸。然后寡核苷酸退火，退火后的寡核苷酸可以立刻使用或者在-20 ℃條件下長(zhǎng)期保存。用EcoR Ⅴ酶切CRISPR/Cas9基因編輯載體致使其線性化，回收后即可根據(jù)NovoRecPCR一步定向克隆試劑盒說(shuō)明書(shū)將上述退火后的寡核苷酸連接到線性化的CRISPR/Cas9 基因編輯載體上。陽(yáng)性克隆用引物gRNA-F和gRNA-R進(jìn)行 PCR驗(yàn)證時(shí)，能夠擴(kuò)增出180 bp的條帶（圖3-A），表明載體構(gòu)建正確。

用生物信息學(xué)方法獲得了綠僵菌性別分化基因isp4及其側(cè)翼序列，該序列左臂含有EcoR Ⅴ （GATATC） 酶切位點(diǎn)和BamHⅠ（GGATCC）酶切位點(diǎn)，右臂含有HindⅢ （AAGCTT） 酶切位點(diǎn)。故構(gòu)建Recombinase基因編輯載體時(shí)選用BamHⅠ和EcoRⅠ酶先后線性化載體。

根據(jù)NovoRecPCR一步定向克隆試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增左右臂的引物和接頭見(jiàn)表2。

經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增獲得敲除載體的左右臂，經(jīng)過(guò)酶切后獲得線性化載體，根據(jù)NovoRecPCR一步定向克隆試劑盒說(shuō)明書(shū)構(gòu)建成Recombinase基因編輯載體。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性克隆用引物isp4F和isp4R能夠擴(kuò)增出2 800 bp的DNA條帶（圖3-A）。

含CRISPR/Cas9和Recombinase載體的農(nóng)桿菌侵染綠僵菌后獲得陽(yáng)性敲除綠僵菌孢子，熒光顯微鏡觀察看到綠色熒光的綠僵菌孢子（圖3-B和圖3-C）。上述結(jié)果表明了isp4基因的CRISPR/Cas9和Recombinase敲除載體成功在綠僵菌中表達(dá)。

為一步證明綠僵菌敲除載體被正確敲除，用RT-PCR對(duì)isp4基因的表達(dá)量（引物RT-PCR-isp4F和 RT-PCR-isp4R）進(jìn)行了驗(yàn)證（圖4），菌落形態(tài)的觀察也證明了2種敲除方法均改變了目的菌株的基因。這些結(jié)果表明isp4基因能夠被正確敲除。

3 討論

綠僵菌作為一種昆蟲(chóng)病原真菌的模式真菌，敲除技術(shù)限制影響了對(duì)其基因序列的大規(guī)模操作。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)首先在細(xì)菌中被報(bào)道，隨后被應(yīng)用于動(dòng)植物的基因靶向技術(shù)，不斷得到優(yōu)化[29-30]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性被限制在sgRNA 5′端20 nt 的位點(diǎn)，這20 nt的核苷酸和靶向DNA進(jìn)行Watson-Crick RNA-DNA容錯(cuò)性堿基配對(duì)，也有可能形成脫靶效應(yīng)[22]。再者，多個(gè)物種的Cas9通過(guò)識(shí)別各自的sgRNA骨架，可在同一細(xì)胞中執(zhí)行不同的功能，彼此之間互不干擾[9]。CRISPR/Cas9的特異性與靶序列的長(zhǎng)度和構(gòu)成及Cas9和sgRNA的濃度有關(guān)。sgRNA靶序列中鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶含量過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響打靶效應(yīng)[7]。

CRISPR/Cas9技術(shù)是基因編輯有力的工具，且被廣泛應(yīng)用，但它仍是相對(duì)新穎的技術(shù)，還有待提高。目前，CRISPR/Cas9技術(shù)的瓶頸是如何降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)。正如上所述，降低CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)包括縮短sgRNA、用雙切口dCas-FokI等方法。每條sgRNA序列都含有變化的脫靶位點(diǎn)，故在試驗(yàn)時(shí)，須要仔細(xì)分析影響脫靶的因素，降低脫靶效率。近年來(lái)積累了很多檢測(cè)脫靶突變的方法，可以讓研究者更有效地預(yù)測(cè)脫靶效應(yīng)[10，26]。眾所周知，基因編輯技術(shù)的效應(yīng)與內(nèi)切核酸酶在識(shí)別基因組上的特異位點(diǎn)相關(guān)。例如，轉(zhuǎn)錄因子及近年來(lái)研究的CRISPR/Cas9易結(jié)合于基因組DNA[21]。轉(zhuǎn)錄因子綁定和染色質(zhì)重塑與組氨酸修飾有關(guān)[16]。由于基因組序列表觀修飾和基因序列變化的復(fù)雜性，研究者仍然缺乏對(duì)CRISPR/Cas9的酶活性和DNA綁定對(duì)CRISPR/Cas9效果的認(rèn)識(shí)[20，31]。

在本研究中，利用CRISPR/Cas9技術(shù)和Recombinase技術(shù)同時(shí)敲除了綠僵菌的isp4基因。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9技術(shù)和Recombinase技術(shù)一樣能夠成功應(yīng)用于昆蟲(chóng)病原真菌（綠僵菌）。在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9在綠僵菌中也存在效率不是很高的現(xiàn)象。CRISPR/Cas9技術(shù)在構(gòu)建敲除質(zhì)粒骨架時(shí)比Recombinase技術(shù)復(fù)雜，但是一旦建成熟骨架，后續(xù)進(jìn)行大量基因敲除時(shí)就相對(duì)容易。對(duì)于CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)和轉(zhuǎn)化效率方面尚需進(jìn)一步研究。

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