◎ 吳紅洋

（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，重慶 401121）

降血壓肽（Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Peptides，簡稱ACEIP）是一類能夠降低人體血壓的小分子多肽，經(jīng)研究證實(shí)對治療高血壓有很好的療效，通過抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Renin-Angiotensin System，RAS）和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（Kallikrein-Kinin System，KKS）中的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin Converting Enzyme，ACE）活性而降低血壓[1]。降血壓肽來源廣泛，從天然動、植物及微生物都可以提取出來，具有毒副作用低、降血壓效果很明顯等優(yōu)點(diǎn)，目前人們已用酪蛋白[2]、大豆蛋白[3]、竹子[4]、藻類等制得了ACE抑制肽，因此，降血壓肽已成為目前降血壓藥物研究的熱點(diǎn)之一。

花椒籽蛋白降血壓肽是花椒籽蛋白經(jīng)特定蛋白酶酶解后制得的具有較高ACE抑制活性的產(chǎn)物，隨著降血壓肽研究的不斷加深，小分子肽活性組分的分離、鑒別也逐漸受到重視[5]。目前測定小分子肽分子量的方法主要有聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、高效液相色譜法、凝膠色譜法、質(zhì)譜法等，其中SDSPAGE電泳法具有設(shè)備投入小、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，受到科研工作者的青睞。常規(guī)的Tris-Glycine-SDS-PAGE電泳只能分析分子質(zhì)量在10～20 kDa的大分子物質(zhì)，SCHAGGEER等[6]采用改進(jìn)的三（羥甲基）甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠電泳（Tricine-SDS-PAGE）能夠有效分離小分子蛋白、多肽。近年來的文獻(xiàn)研究表明，此法對于不同酶解產(chǎn)物的小分子肽的分離條件和分離效果不盡一樣。本文在前期研究基礎(chǔ)上，將花椒籽蛋白降血壓肽作為研究對象，優(yōu)化Tricine-SDS-PAGE電泳條件，旨在找到一種簡便可行、效果理想的適合花椒籽蛋白降血壓肽分子量測定的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒籽蛋白，實(shí)驗(yàn)室自制。

SDS-PAGE蛋白質(zhì)超低分子量多肽（3.3～20.1 kDa），購于上海源葉生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力為2.0×105U·g-1），購于北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Tricine、硼酸、四甲基乙二胺（TEMEND）、聚乙二醇、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、考馬斯亮藍(lán)R250、尿素、甘油、十二烷基磺酸鈉（SDS）、β-巰基乙醇及過硫酸銨（AP）等均為分析純；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺等為電泳純。

1.2 儀器與設(shè)備

Millipore Milli-Q型超純水儀（美國Millipore）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（榮華儀器制造有限公司）；冷凍離心機(jī)（美國Thermo）；凝膠成像儀；垂直電泳儀（Bio-Rad）；CP225D型電子天平（德國Sartorius）；BP-20型pH計（德國Sartorius）；QL-901型渦旋儀（其林貝爾儀器制造公司）。

1.3 方法

1.3.1 花椒籽蛋白降血壓肽的制備

參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]，得出花椒籽蛋白降血壓肽的制備工藝：花椒籽蛋白→木瓜蛋白酶酶解→滅酶→冷卻→離心→收集酶解液→超濾→凝膠層析→冷凍干燥→保存。

1.3.2 Tricine-SDS-PAGE電泳操作方法

（1）電泳緩沖液的配制。①陽極緩沖液：將24.228 g的Tris溶于800 mL的超純水，用1.0 mol·L-1HCl調(diào)pH到8.9，再用超純水定容到1 000 mL。②陰極緩沖液：將6.055 g的Tris、8.958 g的Tricine、0.5 g的SDS溶于超純水，并定容到500 mL。③凝膠緩沖液：將36.3 g的Tris和0.3 g的SDS溶于80 mL的超純水中，用1.0 mol·L-1HCl調(diào)pH到8.45，定容到100 mL。

（2）凝膠的制備。取3.0 mL分離膠液灌入模具內(nèi)至一定高度，用水封頂，聚合完畢（約30 min左右），傾去水層，用濾紙吸凈殘留水。加入2.0 mL的間隙膠并進(jìn)行水封，待間隙膠凝固后傾去水層，灌入1.5 mL濃縮膠溶液后立即插入干凈的梳子，操作需快速，整個操作過程注意避免氣泡的產(chǎn)生。凝膠的組成見表1。

表1 凝膠的組成表

（3）樣品制備。樣品緩沖液由4% SDS、12%甘油、50 mmol·L-1Tris、2% β-巰基乙醇（v/v）以及0.1%溴酚藍(lán)組成，調(diào)pH=6.8，室溫存放。取10 μL樣品與等體積的樣品緩沖液混合，沸水浴5 min后離心（10 000 r·min-1，10 min）。

（4）點(diǎn)樣與電泳。將處理好的樣品加入點(diǎn)樣孔，每孔10 μL，同時點(diǎn)入超低分子量Marker作為參比。內(nèi)槽加入陰極電泳緩沖液，外槽加入陽極電泳緩沖液，電泳開始時電壓為30 V，待樣品完全到達(dá)分離膠與間隙膠界面后，90 V恒壓，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑距離分離膠底部1 cm處時，電泳結(jié)束。

（5）固定、染色、脫色。取出平板中的凝膠立即浸泡在固定液中固定1 h，再將固定后的凝膠置于45 ℃的考馬斯亮藍(lán)染色液中浸泡30～60 min，最后用洗脫液進(jìn)行脫色，多次變換洗脫液直至電泳條帶清晰、凝膠背景洗脫干凈為止。

（6）成像。用凝膠成像系統(tǒng)成像，并觀察電泳圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠種類對電泳效果的影響

目前，Tricine-SDS-PAGE電泳法有多種凝膠組合方式，有的是用分離膠、間隙膠和濃縮膠，有的僅用分離膠和濃縮膠。張銳昌等[9]采用三層梯度膠測定出小麥蛋白酶解物分子量的分布情況，而黃薇等[10]、孫波等[11]采用兩層膠的電泳方法獲得了理想的肽電泳顯帶結(jié)果。本文首先采用僅灌注濃縮膠和分離膠對花椒籽蛋白降血壓肽進(jìn)行電泳分離，電泳分離圖譜如圖1所示。

圖1 電泳圖譜圖

由圖1可知，Maker條帶并未完全分離，隨著分子量的降低，電泳條帶堆積現(xiàn)象較嚴(yán)重，而樣品除在20 100 Da附近有一個條帶外，幾乎看不見明顯的條帶，可能跟蛋白肽的種類和電泳緩沖液的濃度有關(guān)，因?yàn)檫m當(dāng)?shù)碾娪揪彌_液能保持蛋白質(zhì)在電泳系統(tǒng)中的溶解性和穩(wěn)定性[6]，因此后續(xù)將采用三層凝膠對花椒籽蛋白降血壓肽進(jìn)行分離測定。

2.2 不同分離膠濃度對電泳效果的影響

目前Tricine-SDS-PAGE電泳法測定分子量的方法關(guān)鍵在于凝膠的配制，其中不同分離膠的濃度對小分子肽的分離有較大影響。不同凝膠系統(tǒng)的電泳圖譜見圖2。

由圖2可以看出，當(dāng)分離膠濃度為20%時，隨著分子量的降低，Maker條帶彌散現(xiàn)象嚴(yán)重，并且有明顯的拖尾現(xiàn)象，酶解液的條帶在分子量為5 856 Da處呈堆積現(xiàn)象；當(dāng)分離膠濃度為16.5%和15.5%時，Maker條帶的電泳圖譜背景淺，分辨率得到提高，拖尾現(xiàn)象也有一定改善，而酶解液在20 100 Da和5 856 Da處有條帶，且濃度為15.5%時的電泳效果相對更好。

圖2 不同凝膠系統(tǒng)的電泳圖譜圖

凝膠濃度大且孔徑小時，電泳容易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，樣品分子不能正常進(jìn)入凝膠中，導(dǎo)致分離效果不好，反之孔徑大且凝膠濃度小會使來自樣品中的各種蛋白質(zhì)分子伴隨著緩沖液向前流進(jìn)，能使條帶能很好的分離，從而降低了分辨率。研究表明，凝膠濃度提高到25%時，實(shí)驗(yàn)的電泳受阻，原因是分離膠孔徑變小，因此凝膠濃度不是越高越好[12]。綜上所述，實(shí)驗(yàn)選擇分離膠濃度為15.5%。

2.3 分離膠中添加甘油對電泳效果的影響

由圖2可知，當(dāng)分離膠濃度（添加尿素）為15.5%時電泳分離效果最好，但是酶解液條帶不明顯，因此將酶解液經(jīng)超濾和凝膠層析后進(jìn)行分離，同時考察甘油對電泳效果的影響。SDS-PAGE電泳圖譜如圖3所示。

圖3 SDS-PAGE電泳圖譜圖

由圖3可以看出，在分離膠濃度15.5%條件下，添加甘油的電泳圖譜中Maker的5個條帶分離效果好，分辨率高。酶解液條帶主要呈連續(xù)分布狀態(tài)，但在20 100 Da、14 400 Da和5 856 Da附近處有電泳條帶出現(xiàn)，說明該酶解液分子量分布范圍較廣。經(jīng)過超濾和凝膠層析純化后，分子量降低，超濾液條帶集中在5 000 Da以下，層析液最高活性組分分子量主要集中在3 000 Da以下，說明降血壓肽起抑制效果的活性組分主要在3 000 Da以下。有文獻(xiàn)報道，分離膠中添加尿素或甘油可以增加小分子多肽電泳分離的效果，其中尿素的使用與否主要取決于蛋白質(zhì)的具體性質(zhì)，有些蛋白沒有尿素時分離效果更好，但是有些蛋白的分離就需要添加尿素時才能更好分辨[13]，而在分離膠中添加適量的甘油，由于分離膠交聯(lián)度不同會對電泳產(chǎn)生一定影響。分離膠的交聯(lián)度在C=5%時，會改變膠中丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的分子比例使其接近標(biāo)準(zhǔn)的20∶1，凝膠分子之間的結(jié)構(gòu)更緊密，使小分子肽更好地分離，條帶更清晰[12]。

3 結(jié)論

本文通過優(yōu)化Tricine-SDS-PAGE電泳條件使得花椒籽蛋白降血壓肽得到較好分離，得到的最佳電泳條件為：分離膠濃度為15.5% T、6% C（添加甘油），間隙膠濃度為10% T、3% C，濃縮膠濃度為4% T、3% C，此條件下花椒籽蛋白酶解液電泳泳帶分布較廣，經(jīng)純化后，超濾液分子量在5 000 Da以下，層析液最高活性組分的分子量在3 000 Da以下。