◎ 鄭若欣，易 嘯，羅 爽，吳小娟，吳衛(wèi)宇

（四川國(guó)檢檢測(cè)有限責(zé)任公司，四川 瀘州 646000）

桑椹是?？贫嗄晟颈局参锷?shù)的果實(shí)，俗稱(chēng)桑果、桑棗等[1]，2002年被原衛(wèi)生部列入保健食品藥食同源原料目錄。桑椹含有多種活性成分如白藜蘆醇、黃酮類(lèi)、多糖、生物堿、氨基酸、揮發(fā)油和原花青素等[2-6]。其中桑葚多糖具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗氧化、抗疲勞等作用[7]。目前桑葚除作為鮮食水果外，通常被加工成果汁、果酒、蜜餞、果醬和果醋等產(chǎn)品。作為新興產(chǎn)品的桑葚果酒則是以新鮮桑葚和桑葚汁為原料，利用酵母菌將糖發(fā)酵轉(zhuǎn)化為酒精等產(chǎn)物，再經(jīng)陳釀而成的酒質(zhì)醇厚酒味香甜的果酒產(chǎn)品[8-9]。通過(guò)發(fā)酵后的桑葚果酒中依然保留部分活性成分，現(xiàn)有的相關(guān)研究進(jìn)展較少。本試驗(yàn)擬通過(guò)醇沉濃度、時(shí)間、溫度3因素的比較建立醇沉-苯酚硫酸法測(cè)定桑葚果酒中多糖含量，為桑葚酒的保健功能提供有力的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚酒：市售；葡萄糖對(duì)照品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖標(biāo)準(zhǔn)品：Dr.ehrenstorfer公司；乙腈為色譜純；苯酚為優(yōu)級(jí)純；濃硫酸、無(wú)水乙醇為分析純；高效液相色譜試驗(yàn)用水為一級(jí)水，其余均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent 1260；色譜柱：美國(guó)SepaxHP-Amino（4.6 mm×250 mm，5 μm）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：HITACHIU-3900；電子天平：賽多利斯CPA225D；高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Sigma3-18ks；水浴鍋：金怡HHS11.4。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0 mg·mL-1）：稱(chēng)取經(jīng)過(guò)98～100 ℃烘箱中干燥2 h后的葡萄糖1 g（精確到0.001 g），加水溶解后定容至1 000 mL。此溶液每毫升相當(dāng)于1.0 mg葡萄糖；葡萄糖工作溶液：取10.00 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0 mg·mL-1）于100 mL容量瓶中定容，配制為100 μg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。苯酚溶液：取1 g苯酚于燒杯中，加入15 mL水于40 ℃水浴中溶解，混勻。現(xiàn)配現(xiàn)用；糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液（20 mg·mL-1）：分別稱(chēng)取（96±2）℃干燥2 h的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖各1 g，加水定容于50 mL。

1.3.2 最大吸收波長(zhǎng)及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別取0 μL、100 μL、200 μL、400 μL、600 μL、800 μL和1 000 μL葡萄糖工作溶液于10 mL比色管中，以水補(bǔ)齊，加入5 mL濃硫酸，混勻后100 ℃水浴15 min后，冷卻，以試劑為空白全波段掃描最大吸收波長(zhǎng)后測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品處理

取25 mL桑葚果酒于50 mL瓷坩堝中，60 ℃水浴下?lián)]發(fā)至近干，10 mL水溶解轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中加入無(wú)水乙醇，混勻后低溫沉淀，12 000 r·min-1離心10 min后倒出上清液,保留沉淀,加入等體積等濃度乙醇溶液12 000 r·min-1離心5 min，去離子水溶解后定容至25 mL待測(cè)。

1.4 檢測(cè)條件優(yōu)化

1.4.1 醇沉濃度對(duì)桑葚多糖含量測(cè)定結(jié)果的影響

設(shè)置乙醇濃度為70%、75%、80%、85%和90%。分別取25 mL桑葚果酒于50 mL瓷坩堝中在60 ℃下?lián)]發(fā)至近干，10 mL水溶解轉(zhuǎn)移至離心管中分別加入23.3 mL、30.0 mL、40.0 mL、56.7 mL和 90.0 mL無(wú)水乙醇，混勻后4 ℃沉淀16 h后12 000 r·min-1離心10 min，倒出上清液，保留沉淀，加入等體積同濃度乙醇溶液12 000 r·min-1離心5 min，去離子水溶解后定容至25 mL待測(cè)。取適量體積待測(cè)液測(cè)定多糖含量。

1.4.2 沉淀溫度對(duì)桑葚多糖含量測(cè)定結(jié)果的影響

分別取25 mL桑葚果酒于50 mL瓷坩堝中在60 ℃下?lián)]發(fā)至近干，10 mL水溶解轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中加入40 mL無(wú)水乙醇，混勻后分別置于4 ℃、6 ℃、8 ℃、16 ℃ 和 24 ℃ 沉 淀 16 h，12 000 r·min-1離 心10 min后倒出上清液，保留沉淀，加入等體積80%乙醇溶液12 000 r·min-1離心5 min，去離子水溶解后定容至25 mL待測(cè)。取適量體積待測(cè)液測(cè)定多糖含量。

1.4.3 沉淀時(shí)間對(duì)桑葚多糖含量測(cè)定結(jié)果的影響

分別取25 mL桑葚果酒于50 mL瓷坩堝中在60 ℃下?lián)]發(fā)至近干，10 mL水溶解轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中加入40 mL無(wú)水乙醇，混勻后4 ℃分別沉淀4 h、6 h、8 h、16 h、24 h 和 48 h，12 000 r·min-1離心 10 min，倒出上清液，保留沉淀，加入等體積80%乙醇溶液12 000 r·min-1離心5 min，去離子水溶解后定容至25 mL待測(cè)。取適量體積待測(cè)液測(cè)定多糖含量。

1.5 醇沉法提取物單糖含量驗(yàn)證分析

取桑葚多糖待測(cè)液參照GB 5009.8—2016標(biāo)準(zhǔn)方法[10]測(cè)定。流動(dòng)相：乙腈+水=77+23；流動(dòng)相流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；示差折光檢測(cè)器條件：溫度40 ℃；等梯度洗脫。

1.6 方法檢出限

采用空白標(biāo)準(zhǔn)偏差評(píng)估法確定檢出限：在490 nm波長(zhǎng)下，測(cè)20組空白對(duì)照溶液的吸光度，求該組值的標(biāo)準(zhǔn)偏差σ，檢出限=3σ/k，k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

1.7 方法精密度

分別取6組桑葚果酒25 mL于50 mL瓷坩堝中在60 ℃下?lián)]發(fā)至近干，10 mL水溶解轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中加入40 mL無(wú)水乙醇，混勻后4 ℃沉淀24 h，12 000 r·min-1離心10 min，倒出上清液，保留沉淀，加入等體積80%乙醇溶液12 000 r·min-1離心5 min，去離子水溶解后定容至25 mL待測(cè)。取適量體積待測(cè)液測(cè)定多糖含量，計(jì)算精密度。

1.8 方法穩(wěn)定性

取桑葚多糖待測(cè)液，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h和48 h按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)與標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過(guò)全波段掃描苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的最大吸收波長(zhǎng)為490 nm。以葡萄糖質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，其線性回歸方程為A=0.074 6C-0.002 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，線性范圍為 0 ～ 10 μg·mL-1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 檢測(cè)條件優(yōu)化

2.2.1 乙醇濃度對(duì)桑葚多糖含量的影響

不同乙醇濃度下桑葚多糖提取結(jié)果見(jiàn)圖2。由結(jié)果可知隨著乙醇濃度的提高其提取率也隨之增加，至80%濃度時(shí)達(dá)到最大值122 mg·L-1，隨后繼續(xù)提高乙醇濃度桑葚多糖的提取率呈下降趨勢(shì)。在乙醇沉淀方式下，不同濃度乙醇可沉淀的多糖種類(lèi)和含量均不同，該方法中80%乙醇濃度可最大程度地提取桑葚果酒中的多糖。

圖2 乙醇濃度對(duì)得率的影響圖

2.2.2 沉淀溫度對(duì)桑葚多糖含量的影響

不同沉淀溫度下桑葚多糖提取結(jié)果見(jiàn)圖3。由結(jié)果可以看出隨溫度升高桑葚多糖提取率呈逐漸下降趨勢(shì)。在4～8 ℃其提取率呈緩慢下降，但溫度逐漸上升至24 ℃時(shí)桑葚多糖含量?jī)H有20.31 mg·L-1，為4 ℃時(shí)含量的17%。多糖的溶解度與溫度呈正相關(guān)性，溫度越高溶解度越高，而溫度越低多糖溶解度下降與乙醇的沉淀效應(yīng)越強(qiáng)，因而提取率越高。但是在試驗(yàn)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)溫度不能降至4 ℃以下，提取過(guò)程使用的耗材在低溫下破裂導(dǎo)致試驗(yàn)不能有效進(jìn)行。

圖3 沉淀溫度對(duì)得率的影響圖

2.2.3 沉淀時(shí)間對(duì)桑葚多糖含量的影響

不同沉淀時(shí)間下桑葚多糖提取結(jié)果見(jiàn)圖4。由結(jié)果可以看出4～24 h時(shí)間段隨著沉淀時(shí)間的增加桑葚多糖得率逐漸提高，24 h得率相較于4 h時(shí)提高了近1.7倍，而當(dāng)沉淀48 h時(shí)其得率反而下降。在桑葚多糖的乙醇沉淀體系中，醇沉?xí)r間的增長(zhǎng)能有效提高沉淀多糖的得率，在一定時(shí)間內(nèi)沉淀時(shí)間越長(zhǎng)多糖分子之間不斷接觸逐漸形成較大顆粒沉淀下來(lái)，從而提高多糖得率。但試驗(yàn)也證明沉淀時(shí)間不能不斷延長(zhǎng)，當(dāng)沉淀時(shí)間達(dá)到48 h時(shí)多糖得率反而降低。

圖4 沉淀時(shí)間對(duì)得率的影響圖

2.3 醇沉法提取物單糖含量驗(yàn)證

通過(guò)單因素試驗(yàn)得到桑葚多糖檢測(cè)過(guò)程提取條件為乙醇濃度80%，醇沉溫度4 ℃，醇沉?xí)r間24 h。在此條件下提取桑葚多糖得到待測(cè)液。通過(guò)高效液相色譜分析得到圖5檢測(cè)結(jié)果。由高效液相色譜法測(cè)定待測(cè)液中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖，結(jié)果均為未檢出。由此可以確認(rèn)該方法能有效的提取出桑葚多糖而無(wú)單糖的干擾。

圖5 單糖測(cè)定結(jié)果圖

2.4 方法檢出限

空白標(biāo)準(zhǔn)偏差評(píng)估法測(cè)定20組試劑空白，計(jì)算20組數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.002 618，k為0.007 5，由公式計(jì)算得方法檢出限為1 mg·kg-1。

2.5 方法精密度

通過(guò)重復(fù)性條件下測(cè)定6次桑葚多糖，其結(jié)果如表1所示。RSD為2.1%，符合常規(guī)試驗(yàn)中相對(duì)偏差小于10%要求。通過(guò)精密度試驗(yàn)可以看出該方法可重復(fù)性較好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果表

2.6 方法穩(wěn)定性

對(duì)桑葚多糖待測(cè)液于不同時(shí)間段進(jìn)行測(cè)定，由試驗(yàn)結(jié)果如圖6，可以看出24 h時(shí)內(nèi)隨時(shí)間變化其含量值并未發(fā)生變化，但時(shí)間達(dá)到48 h后桑葚多糖含量開(kāi)始下降。這可能是因?yàn)樯］毓浦锌商崛《嗵呛肯鄬?duì)較少，隨時(shí)間的增加多糖溶解后的均一性開(kāi)始降低，同時(shí)在室溫放置下也可能受到微生物的消耗。因此在測(cè)定桑葚多糖的檢測(cè)時(shí)，應(yīng)在提取后24 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

圖6 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果圖

3 結(jié)論

多糖是一類(lèi)大分子物質(zhì)，一般不溶于有機(jī)溶劑，同時(shí)在溫度較低時(shí)溶解度降低。通過(guò)多糖的特性，利用低溫條件下的乙醇-水溶液體系中多糖大分子聚合形成微顆粒進(jìn)而沉淀下來(lái)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，隨著乙醇濃度的增加桑葚多糖得率不斷提高，至80%乙醇時(shí)達(dá)到最大值，而不同的沉淀溫度下，溫度越高多糖沉淀能力越低，在低溫4 ℃時(shí)桑葚多糖得率最大，而沉淀時(shí)間則是在時(shí)間增加至24 h時(shí)桑葚多糖得率最高。提取后的桑葚多糖復(fù)水溶解后檢測(cè)方法選用苯酚-硫酸法，其原理為多糖類(lèi)成分在濃硫酸作用下水解成單糖，脫水生產(chǎn)糠醛衍生物，與苯酚縮合成有色化合物，從而利用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定[11]。試驗(yàn)中通過(guò)提取條件乙醇濃度、沉淀溫度、沉淀時(shí)間條件的摸索，建立桑葚多糖的提取分離條件，同時(shí)通過(guò)高效液相色譜法確認(rèn)該提取方法中無(wú)單糖的干擾，以檢出限、方法精密度、穩(wěn)定性證實(shí)該方法的可行性。由試驗(yàn)結(jié)果得出，在0～10 μg·mL-1葡萄糖質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性結(jié)果良好R2=0.999 6，乙醇濃度80%、沉淀溫度4 ℃，沉淀時(shí)間24 h為提取條件，其方法檢出限為1 mg·L-1，精密度為RSD=2.1%，提取液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。醇沉-苯酚硫酸法可作為桑葚果酒中多糖含量的測(cè)定方法。