◎ 相紅麗，雷紅濤，黃惠英，付日留

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.合生元（廣州）健康產(chǎn)品有限公司，廣東 廣州 510663）

益生菌是通過定殖在人體內(nèi)改變宿主某一部位菌群組成的一類有益的活性微生物。通過調(diào)節(jié)宿主系統(tǒng)免疫功能或通過調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群平衡，起到促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收保持腸道健康的作用，被臨床確認(rèn)主要功效有：調(diào)節(jié)腸道菌群[1]、提高免疫力[2]、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成和礦物質(zhì)的吸收[3]、治療腸炎[4-5]以及抗腫瘤[6-7]。近幾十年來，隨著益生菌產(chǎn)品的健康功效被證明，益生菌產(chǎn)品受到廣泛關(guān)注[8-9]，被廣泛應(yīng)用[10]到食品、保健食品和藥品原料中[11-14]。然而，有調(diào)查發(fā)現(xiàn)一些商業(yè)益生菌產(chǎn)品的標(biāo)識(shí)準(zhǔn)確性存在問題，包括分類不準(zhǔn)確、標(biāo)識(shí)的菌種缺失、添加未申報(bào)的菌種等。益生菌產(chǎn)品因?yàn)榫甑牟町悾幸婀πб膊槐M相同[15]，確認(rèn)益生菌菌株及其活性是確保益生菌產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵。

雙歧桿菌的鑒別主要以雙歧桿菌的生物學(xué)特性為基礎(chǔ)，利用分離培養(yǎng)技術(shù)[16-18]、形態(tài)鑒別或在培養(yǎng)基中添加顯色成分，通過染色試驗(yàn)進(jìn)行鑒別[19]，這些方法操作簡(jiǎn)單，但特異性差，受操作人員影響較大[20]。以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的PCR檢測(cè)方法，因其準(zhǔn)確、快速、敏感、可靠及分辨率高的特點(diǎn)，在食品的鑒定中有較多應(yīng)用[21-23]，食源性病原體[24]和鑒別污染來源也有應(yīng)用PCR技術(shù)[25-26]，歐盟關(guān)于轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)的黃金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法也以PCR分析方法為基礎(chǔ)[27]。PCR鑒別方法在益生菌和雙歧桿菌的鑒別檢測(cè)中也取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，并且發(fā)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)食品中雙歧桿菌的檢測(cè)也有較好的準(zhǔn)確性和可靠性[28]。

本研究主要以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，利用Primer Premier 6軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)確定兩歧雙歧桿菌與嬰兒雙歧桿菌共存情況下的特異性引物，特異性引物在PCR體系和反應(yīng)條件下對(duì)雙歧桿菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，并在128 bp處檢查凝膠電泳的熒光條帶情況，通過顯示長(zhǎng)度辨別，確認(rèn)雙歧鑒別產(chǎn)物。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

iQTM SYBR? Green Supermix，美國(guó) Bio-Rad公司；PCR引物，北京擎科生物科技有限公司；濾芯、移液槍頭、1.5 mL/2.0 mL離心管、微量移液器，德國(guó)艾本德Eppendorf；瓊脂糖，Sigma-aldrich西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；96孔qPCR板，英國(guó)Grant儀器公司；QIAamp? PowerFecal? Pro DNA Kit提取試劑盒，德國(guó)QIAGEN公司；DNA梯度標(biāo)準(zhǔn)品，Thermo賽默飛。

漩渦振蕩器，德國(guó)IKA；小型高速離心機(jī)，英國(guó)Grant儀器公司；電泳槽、凝膠電泳呈現(xiàn)系統(tǒng)，美國(guó)Bro-Rad公司；超純水機(jī)，Milipore上海；NanoDrop 2000c超微紫外分光光度儀，Thermo賽默飛；普通PCR儀、qPCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；生物安全柜，新加坡ESCO。

1.2 主要溶液

1%瓊脂糖凝膠配制：0.5 g瓊脂粉溶解到50 mL 1×TAE緩沖液，并加入5 μL DNA染色劑）。Mastermix溶液配制：將Premix Tag/ iQTM SYBR? Green Supermix充分解凍并旋渦振蕩混勻，參照對(duì)應(yīng)的反應(yīng)體系配制Mastermix溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

按照產(chǎn)品中添加的嬰兒雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌和乳酸桿菌的類別，在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找兩歧雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌的16SrRNA序列信息，使用軟件DNA MAN對(duì)比找出序列的同源性，進(jìn)而找到兩歧雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌的16SrRNA基因的保守區(qū)。依據(jù)兩種雙歧桿菌的16SrRNA特異性基因序列并參照國(guó)外文獻(xiàn)[29-31]，利用Primer Premier 6軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，找到最合適兩歧雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌的種屬特異性引物。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的序列[32-33]。上游引物 BifF1：5’-TCGCGTCYGGTGTGAAAG-3’， 下游引物BifR1：5’-GGTGTTCTTCCCGATATCTACA-3’，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度128 bp。

1.3.2 DNA提取

采用QIAamp Power Fecal Pro糞便DNA提取試劑盒并按照說明，對(duì)兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和乳酸桿菌菌粉原料進(jìn)行DNA提取，提取好后備用。

1.3.3 引物特異性評(píng)價(jià)

乳酸桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌菌粉原料DNA提取物先稀釋至50 ng·μL-1進(jìn)行均一化，然后再稀釋至5 ng·μL-1作為工作液，最后稀釋至1 ng·μL-1，在PCR反應(yīng)體系中加入與模板DNA等體積的水作為空白對(duì)照，設(shè)定樣品在96孔板的位置。用微量移液器移取20 μL mastermix至96孔板的孔內(nèi)，然后在各反應(yīng)孔內(nèi)加入5 μL DNA模板用實(shí)時(shí)熒光PCR板專用封板膜封板。菌粉原料DNA提取物使用雙歧桿菌屬水平特異性引物，按實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系（iQTM SYBR? Green Supermix染料，12.5 μL；上游引物，1.25 μL；下游引物，1.25 μL；分子級(jí)別無菌水，5.0 μL，DNA 模板，5.0 μL）和熒光定量PCR反應(yīng)程序（95 ℃，預(yù)變性3 min；95 ℃，變性30 s；退火60 ℃，延伸30 s；循環(huán)40次，95 ℃，1 min；55 ℃，1 min終延伸）對(duì)DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，觀察擴(kuò)增曲線和Ct值。

1.4 PCR鑒別反應(yīng)體系的構(gòu)建

1.4.1 PCR反應(yīng)體系的設(shè)計(jì)

嬰兒雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌和乳酸桿菌菌粉原料DNA提取物，加入雙歧桿菌屬水平特異性引物，按照反應(yīng)體系（Premix Taq?酶，25 μL；上游引物，2.5 μL；下游引物，2.5 μL；分子級(jí)別無菌水，15 μL，DNA模板，5.0 μL）、PCR反應(yīng)程序（95 ℃，預(yù)變性3 min；95 ℃，變性30 s；60 ℃，延伸30 s；循環(huán)40次，72 ℃，終延伸10 min）對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

上述菌粉原料DNA擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋至50 ng·μL-1進(jìn)行均一化，然后再稀釋至5 ng·μL-1作為工作液，最后稀釋至1 ng·μL-1，在PCR反應(yīng)體系中加入與模板DNA等體積的水作為空白對(duì)照，系統(tǒng)設(shè)定樣品在96孔板的位置。用微量移液器移取20 μL MasterMix溶液至96孔板的孔內(nèi)，然后在各反應(yīng)孔內(nèi)加入5 μL DNA模板用實(shí)時(shí)熒光PCR板專用封板膜封板。樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，吸取5 μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（130 V×35 min）。使用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳條帶進(jìn)行分析，拍照判斷菌落屬性。

1.5 乳酸桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌原料菌株鑒別

將乳酸桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌原料，分別按照傳統(tǒng)培養(yǎng)法接種培養(yǎng)出生長(zhǎng)完好的菌落，按照上述PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后產(chǎn)品按照上述方法進(jìn)行凝膠電泳，觀察熒光條帶的情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性評(píng)

擴(kuò)增曲線和Ct值如圖1所示。由圖可知，嬰兒雙歧桿菌菌株擴(kuò)增曲線的Ct值為12.48，兩歧雙歧桿菌菌株擴(kuò)增曲線的Ct值為13.14。這說明這對(duì)特異性引物可以很好的對(duì)嬰兒雙歧桿菌菌株、兩歧雙歧桿菌菌株這兩株菌進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。乳酸桿菌菌株擴(kuò)增曲線的Ct值為32.23（一般認(rèn)為樣品的Ct值超過30，就意味著qPCR對(duì)此樣品沒有擴(kuò)增作用），這說明這對(duì)引物對(duì)乳酸桿菌菌株沒有擴(kuò)增作用。

圖1 乳酸桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌DNA擴(kuò)增曲線圖

按照引物序列計(jì)算PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度約為128 bp，凝膠電泳圖如圖2，由圖可知嬰兒雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌菌株擴(kuò)增得到很明顯的條帶，而乳酸桿菌菌株沒有得到條帶，說明該引物可以對(duì)嬰兒雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌進(jìn)行鑒別，無法對(duì)乳酸桿菌鑒別。

圖2 菌粉DNA擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳熒光條帶圖

2.2 PCR鑒別體系的建立

乳酸桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌原料培養(yǎng)出的菌落PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖如圖3，由圖3可知特異性引物可以很好地對(duì)原料中兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌進(jìn)行鑒別。

圖3 菌落PCR產(chǎn)物凝膠電泳熒光鑒別圖

2.3 復(fù)合型益生菌產(chǎn)品中的雙歧桿菌鑒別

在雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基上對(duì)復(fù)合型益生菌樣品進(jìn)行培養(yǎng)，選取培養(yǎng)基中益生菌產(chǎn)品生長(zhǎng)的完好菌落，按照以上方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增和鑒別。凝膠電泳熒光條帶顯示均在128 bp左右的長(zhǎng)度，說明該方法可以對(duì)益生菌產(chǎn)品中的雙歧桿菌進(jìn)行鑒別。

3 結(jié)論

本文成功的設(shè)計(jì)特異性引物，并驗(yàn)證了引物可以對(duì)嬰兒雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，但對(duì)乳酸桿菌沒有擴(kuò)增，并確立了適合嬰兒雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌的PCR反應(yīng)體系和條件，由此，可以實(shí)現(xiàn)在嬰兒雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌和乳酸桿菌共存時(shí)，對(duì)復(fù)合型益生菌產(chǎn)品中雙歧桿菌的鑒別。