莊翔莉 艾 斯 鄭 健

(1.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院 福建福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院 福建福州 350004；3.福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)兒科研究所 福建福州 350122)

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）是威脅全世界公共健康的主要疾病之一。CKD所致的腎功能下降呈不可逆性發(fā)展，并將逐漸進展至終末期腎病[1]，嚴重影響患者生活質(zhì)量，且消耗了巨大的社會醫(yī)療資源。近年研究發(fā)現(xiàn)[2]，自噬與CKD、腎缺血再灌注等急性腎損傷、藥物性腎損害、遺傳性腎臟病、糖尿病腎病等腎臟疾病的發(fā)病及腎臟衰老有關(guān)。因此，自噬未來可能作為治療腎臟疾病的一個新靶點。益腎活血中藥腎康靈是福建省名老中醫(yī)王著礎(chǔ)治療腎病五十多年的臨床經(jīng)驗方，具有益腎氣、行氣血、化瘀血之功效，臨床驗證療效顯著[3][4]，但其具體作用機制仍有待進一步完善。因此，本研究通過建立腺嘌呤誘導的CKD小鼠模型，觀察腎康靈對CKD小鼠腎功能和腎臟自噬水平的影響，進一步探討腎康靈CKD腎損傷的保護機制，為腎康靈在CKD中的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

一、實驗材料

（一）實驗動物

C56BL/6小鼠24只，鼠齡6～8周，體質(zhì)量（22±2）g，訂購于上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)有限公司，許可證號SCXK（滬）2017-0012。實驗動物均飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級屏障系統(tǒng)，許可證號SYXK（閩）2019-0007。實驗過程中嚴格根據(jù)中華人民共和國科學技術(shù)部《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》處置實驗動物。

（二）實驗藥物

腎康靈組方為黃芪30g，生地黃15g，山茱萸9g，山藥12g，茯苓9g，牡丹皮15g，三七9g等，經(jīng)煎煮、過濾、離心、濃縮至生藥濃度為1.5g/mL的藥液，由福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院制劑室制備。

（三）實驗試劑與儀器

腺嘌呤（A8626，美國Sigma公司）；4%多聚甲醛（BL539A，北京白鯊生物）；HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒（G1120、G1346，北京索萊寶公司）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL（P0012A、P0018S，上海碧云天生物）；封閉液、轉(zhuǎn)膜液（KGP108、KGP102，江蘇凱基生物）。RM2235石蠟切片機（德國Leica公司）；DMIL/DFC295倒置顯微鏡（德國Leica公司）；PowerPac Universal電泳儀（美國BIO-RAD公司）；ChemiDoc XRS+化學發(fā)光成像分析儀（美國BIO-RAD公司）。

二、實驗方法

（一）動物模型制備及分組給藥

24只C56BL/6小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，根據(jù)性別和體質(zhì)量分層隨機化原則分為正常組、模型組和腎康靈組各8只。采用腺嘌呤誘導法[5]復制CKD小鼠模型：予模型組和腎康靈組小鼠喂食含有0.25%腺嘌呤（w/w）的飼料，正常組喂食等量普通飼料，共喂養(yǎng)28天，期間自由飲水。實驗第29天，腎康靈組經(jīng)胃灌服腎康靈溶液1mL/100g，正常組和模型組均經(jīng)胃灌服生理鹽水1mL/100g，各組連續(xù)灌胃14天。

（二）標本采集

各組小鼠末次給藥后，禁食不禁水12h，予2%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉后各小鼠予眼球摘除取血，3500rpm/min離心20min后分離上層血清，用于腎功能檢測；背部切口摘除腎組織，剝離腎外包膜后，沿冠狀面切開，取1/2右腎組織浸泡于4%多聚甲醛中用于光鏡制樣觀察，其余腎組織投入液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃保存，用于蛋白水平檢測。

（三）指標觀察與檢測

1.腎功能檢測

使用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血清尿素氮（BUN）和血肌酐（Scr）的濃度。

2.腎組織病理學觀察

4%多聚甲醛固定2天，取出腎組織經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，予4μm厚度切片，行HE染色和Masson染色，用于觀察小鼠腎組織病理形態(tài)變化。

3.Western blot法檢測腎組織自噬相關(guān)蛋白表達

RIPA裂解液提取腎組織樣本總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，各組蛋白定量后行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后，于室溫封閉1h，4℃孵育一抗過夜，再室溫孵育二抗1h，以TBST充分洗膜，行ECL化學發(fā)光法顯影成像，以β-actin為內(nèi)參，分析各目的蛋白表達水平。

（四）數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

三、實驗結(jié)果

（一）腎功能指標比較

見表1。

表1 3組小鼠BUN、Scr含量比較（n=8，±s）

表1 3組小鼠BUN、Scr含量比較（n=8，±s）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 BUN（mmol/L） Scr（μmol/L）正常組 10.91±1.39 13.24±1.91模型組 31.36±9.02▲▲ 35.81±9.79▲▲腎康靈組 12.89±1.69△△ 15.49±1.89△

（二）腎組織病理學變化

采用HE染色法觀察CKD小鼠腎臟病理變化，結(jié)果顯示，正常組小鼠腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)均勻，未見明顯病理損傷；模型組小鼠腎小球系膜增生，腎小管管腔擴張、細胞腫脹變性；腎康靈組小鼠腎小球、腎小管病變程度較模型組明顯減輕。見圖1。

采用Masson染色法觀察CKD小鼠腎臟纖維化程度，結(jié)果顯示，正常組小鼠腎小球無明顯變化，腎小管管腔無明顯代謝物沉積，腎間質(zhì)中僅有少量藍色膠原纖維呈條索狀沉積；模型組小鼠腎小球球囊明顯擴張，基底膜明顯增厚，有大片藍色膠原纖維沉積在腎小管間質(zhì)及上皮；腎康靈組小鼠上述纖維化程度明顯減輕。見圖2。

圖1 各組小鼠腎組織HE染色結(jié)果（×400）

圖2 各組小鼠腎組織HE染色結(jié)果（×400）

（三）腎組織自噬相關(guān)蛋白表達水平比較

與正常組小鼠比較，模型組小鼠腎組織P62表達水平顯著降低，Atg5和LC3Ⅱ表達顯著升高（P均＜0.01）。與模型組小鼠比較，經(jīng)中藥腎康靈干預后，CKD小鼠腎組織的P62表達顯著上調(diào)（P＜0.05），Atg5和LC3Ⅱ表達顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3、表2。

圖3 各組小鼠腎組織自噬相關(guān)蛋白表達條帶圖

表2 各組小鼠腎組織自噬相關(guān)蛋白表達水平（n=5，±s）

表2 各組小鼠腎組織自噬相關(guān)蛋白表達水平（n=5，±s）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 P62/β-actin Atg5/β-actin LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ正常組 0.72±0.08 1.18±0.08 1.70±0.16模型組 0.36±0.16▲▲ 1.77±0.40▲▲ 2.37±0.22▲▲腎康靈組 0.58±0.21△ 1.36±0.19△ 1.80±0.41△△

四、討論

自噬是普遍存在于真核細胞中的一種依賴溶酶體的胞內(nèi)降解系統(tǒng)，能夠清除細胞中損傷或衰老細胞器及生物大分子，是一種高度保守的維持自身穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)機制。近年來越來越多研究表明，自噬參與了腎臟的疾病、修復和衰老過程。P62、Atg5和LC3Ⅱ是自噬體形成過程中的關(guān)鍵分子[6]。自噬體形成時，LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ，P62蛋白則選擇性地與LC3Ⅱ直接結(jié)合并被自噬體包裹降解[7]。而自噬相關(guān)蛋白Atg5可與Atg12、Atg16L1形成多聚體，參與LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化，從而進一步參與自噬泡雙層膜的形成[8]。

中藥腎康靈是根據(jù)CKD腎虛血瘀的病理特點而研創(chuàng)的臨床經(jīng)驗方。研究結(jié)果表明，CKD小鼠BUN和Scr顯著升高，腎組織呈現(xiàn)纖維化病變，Atg5和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平明顯升高，P62蛋白水平明顯下降，提示自噬參與了CKD小鼠腎損傷的過程。經(jīng)腎康靈干預治療后，CKD小鼠腎功能顯著緩解，腎組織纖維化程度減輕，Atg5和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達下降，P62蛋白表達顯著升高，提示腎康靈可能通過抑制自噬流發(fā)生，從而改善CKD腎損傷，最終延緩CKD進展。其作用機制尚需在體外實驗中進一步驗證。