苗樹船 夏勛 張列

(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,四川 成都 610500)

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可促使缺血性腦疾病的發(fā)生，而氧化應(yīng)激可加重血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[1-3]。既往研究顯示部分中藥可抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)從而減輕過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[4-5]。茯苓酸(pachymic acid，PA)屬于中醫(yī)傳統(tǒng)用藥，其主要是從茯苓中提取的主要活性成分，并可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)從而減輕腦缺血再灌注損傷[6]。但茯苓酸對H2O2誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷尚未闡明。因此，本研究采用H2O2處理腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，探討茯苓酸對H2O2誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及增殖的影響，為茯苓酸治療缺血性腦血管疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 茯苓酸購自四川健騰生物技術(shù)有限公司，小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株bEnd.3購自美國ATCC公司，過氧化氫購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，甲基噻唑基四唑(MTT)購自美國Sigma公司，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京博邁斯科技發(fā)展有限公司，乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，DMEM培養(yǎng)基購自美國Thermo Fisher公司，SDS凝膠制備試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，RIPA裂解液、BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，活性氧(ROS)檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司，兔抗鼠活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)抗體購自美國CST公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗處理與分組 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于96孔板(5×103個/孔)，分別加入含有濃度為100 μmol/L的H2O2處理24 h[7]，記作H2O2組。同時將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為NC組。取對數(shù)生長期腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，分別加入含有濃度為10、20、40 μmol/L的茯苓酸與濃度為100 μmol/L的H2O2處理24 h[8]，分別記作H2O2+PA 10 μmol/L組、H2O2+PA 20 μmol/L組、H2O2+PA 40 μmol/L組。

1.2.2 MTT檢測細(xì)胞存活率 收集對數(shù)生長期腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于96孔板(3×104個/孔)，分別加入濃度為10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L的茯苓酸與濃度為100 μmol/L的H2O2處理，于處理24、48、72 h時向各孔加入20 μL的MTT溶液，室溫孵育4 h，棄上清，加入DMSO(150 μL/孔)，室溫振蕩孵育10 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm處各孔吸光度值(OD)。計算細(xì)胞存活率(%)=(各實驗組OD值-空白對照組OD值)/(正常對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。

1.2.3 檢測LDH活性與MDA的水平 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，參照試劑盒說明書檢測LDH的活性。收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液，4 ℃條件下經(jīng)3000 r/min離心5 min，收集上清液，檢測MDA的水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 收集各組細(xì)胞，加入預(yù)冷PBS，4 ℃條件下經(jīng)3000 r/min離心6 min，棄上清，收集細(xì)胞沉淀，加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，依次分別加入5 μL Annexin V-FITC與5 μL PI，充分混勻，室溫孵育10 min，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 檢測ROS、CAT、SOD、GSH-Px的水平 收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液，4 ℃條件下經(jīng)3000 r/min離心5 min，收集上清液，參照試劑盒說明書檢測ROS、CAT、SOD、GSH-Px的水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.6 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測Cleaved caspase-3蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞加入RIPA裂解液，冰上孵育30 min，4 ℃條件下經(jīng)3000 r/min離心10 min，提取細(xì)胞蛋白，檢測蛋白濃度后進(jìn)行變性，SDS-PAGE反應(yīng)分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入一抗稀釋液(1∶1000)，4 ℃孵育(24 h)后加入二抗稀釋液(1∶2000)，TBST洗滌，室溫孵育1 h，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度茯苓酸促進(jìn)過氧化氫處理對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞存活 不同時間、組別及交互作用下細(xì)胞存活率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與NC組比較，H2O2組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+PA 20 μmol/L組、H2O2+PA 40 μmol/L組細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)，且不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同濃度茯苓酸促進(jìn)過氧化氫處理對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞存活

2.2 不同濃度茯苓酸抑制過氧化氫處理對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響 與NC組比較，H2O2組LDH、MDA的水平顯著升高(P<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+PA 20 μmol/L組、H2O2+PA 40 μmol/L組LDH、MDA的水平顯著降低(P<0.05)，且不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同濃度茯苓酸抑制過氧化氫處理對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響

2.3 不同濃度茯苓酸對過氧化氫處理對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率的影響 與NC組比較，H2O2組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Cleaved caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+PA 20 μmol/L組、H2O2+PA 40 μmol/L組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Cleaved caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，且不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、2，表3。

表3 不同濃度茯苓酸對過氧化氫處理腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞影響Cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

圖2 檢測腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)

2.4 不同濃度的茯苓酸對過氧化氫腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的影響 與NC組比較，H2O2組ROS的水平顯著升高(P<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+PA 20 μmol/L組、H2O2+PA 40 μmol/L組ROS的水平顯著降低(P<0.05)，且不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 不同濃度茯苓酸抑制過氧化氫處理腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生

2.5 不同濃度的茯苓酸促進(jìn)過氧化氫腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞CAT、SOD和GSH-Px產(chǎn)生 與NC組比較，H2O2組CAT、SOD、GSH-Px的水平顯著降低(P<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+PA 20 μmol/L組、H2O2+PA 40 μmol/L組CAT、SOD、GSH-Px的水平顯著升高(P<0.05)，且不同劑量組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表5 不同濃度的茯苓酸對過氧化氫腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞CAT、SOD和GSH-Px的影響

3 討論

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與凋亡失衡可能促使缺血性腦血管疾病的發(fā)生，因此如何調(diào)節(jié)微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及凋亡成為研究重點[9-10]。研究表明茯苓酸可抑制膿毒癥大鼠炎癥反應(yīng)從而減輕其急性肺損傷[11]。茯苓酸可通過抑制炎癥反應(yīng)從而改善敗血癥誘導(dǎo)的急性腎損傷[12]。茯苓酸可抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡從而保護(hù)心肌細(xì)胞[13]。茯苓酸還可通過調(diào)控細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)從而參與腫瘤發(fā)生及增加細(xì)胞放射敏感性[14]。本研究結(jié)果提示茯苓酸可促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞存活。LDH、MDA的水平升高可反應(yīng)炎癥反應(yīng)，并可加重氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生[15-16]。H2O2處理后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞LDH、MDA的水平顯著升高，而茯苓酸處理后LDH、MDA的水平顯著降低，提示茯苓酸可減輕H2O2誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷。

細(xì)胞接收到凋亡信號時，線粒體釋放細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并可激活capase級聯(lián)反應(yīng)而形成Cleaved caspase-3從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17-19]。本研究結(jié)果顯示，H2O2處理后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率顯著降低，而茯苓酸處理后細(xì)胞存活率顯著升高；H2O2處理后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率升高，Cleaved caspase-3表達(dá)下調(diào)，茯苓酸處理后可抑制細(xì)胞凋亡，并可抑制Cleaved caspase-3表達(dá)，提示茯苓酸可抑制H2O2誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

ROS生成量增多可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂類等發(fā)生氧化而造成氧化損傷，ROS還可激活相關(guān)信號通路從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。CAT、SOD、GSH-Px屬于抗氧化酶類，并可抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的作用從而減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[21-22]。本研究結(jié)果顯示H2O2處理后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS的水平顯著升高，而茯苓酸處理后ROS的水平顯著降低，進(jìn)一步研究顯示H2O2處理后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞CAT、SOD、GSH-Px的水平顯著降低，而茯苓酸處理后CAT、SOD、GSH-Px的水平顯著升高，提示茯苓酸具有抗H2O2誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的作用，還可抗細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞增殖。但關(guān)于茯苓酸減輕H2O2誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的分子機制尚需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

茯苓酸可抑制H2O2誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡，并可促進(jìn)細(xì)胞增殖從而發(fā)揮抗腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的作用，可為進(jìn)一步揭示茯苓酸治療缺血性腦血管疾病的分子機制奠定了實驗基礎(chǔ)。