王平 賴聞 田松明

(重慶市兩江新區(qū)第一人民醫(yī)院耳鼻喉科，重慶 401121)

鼻咽癌是一種起源于人鼻咽部上皮組織的惡性腫瘤，屬于頭頸部癌，常見于東亞和東南亞[1]；其在我國東南部地區(qū)特別是廣東省高度流行，治療方案包括順鉑或5-氟尿嘧啶為主的放化療方案及外科干預[2]。放化療耐受是臨床治療失敗的主要原因，研究鼻咽癌的化療耐受靶點可為其治療提供新的方向，減輕患者痛苦，提高生存率。研究[3]表明，miR-221在骨肉瘤細胞系MG-63、SaoS-2和U2OS中明顯上調，miR-221的過表達促進骨肉瘤細胞的侵襲、遷移、增殖和順鉑耐藥，抑制其表達可增強骨肉瘤細胞的順鉑敏感性。miR-221-5p在人鼻咽癌微環(huán)境癌相關成纖維細胞中上調表達[4]。生物信息學分析發(fā)現，乙醛脫氫酶1家族A2成員(Aldehyde dehydrogenase 1 family member A2，ALDH1A2)的3′UTR區(qū)含有與miR-221-5p互補的序列。ALDH1A2在高級別上皮性卵巢癌組織中表達低于低級別上皮性卵巢癌組織，其過表達可抑制上皮性卵巢癌細胞株的增殖和遷移，而ALDH1A2的下調顯著增加了細胞的生長和遷移[5]。ALDH1A2在人結腸癌組織中表達下調，其過表達具有抑制結腸癌細胞增殖、克隆形成及侵襲的作用[6]。ALDH1A2與miR-221-5P在鼻咽癌中的表達和作用尚不清楚，對順鉑敏感性的影響也未可知。基于上述結果，本研究假設miR-221-5p可通過靶向ALDH1A2基因增加鼻咽癌細胞的順鉑敏感性，并對其進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料 人永生化鼻咽上皮細胞NP69及人鼻咽癌細胞系SUNE1、HNE1和CNE2購自中國科學院上海細胞研究所，RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，順鉑(DDP)、RIPA裂解液、胰蛋白酶、溴化噻唑藍四氮唑(MTT)和二甲基亞礬(DMSO)購自美國Sigma-Aldrich公司，ALDH1A2抗體、CyclinD1抗體、Cleave-caspase-3抗體、MRP1抗體和β-actin抗體購自英國Abcam公司，Total RNA提取試劑盒、 real-time PCR 試劑盒、反轉錄試劑盒(RT-PCR)購自寶生物工程(大連)有限公司，引物、miR-221-5p mimics(miR-221-5p)、miR-221-5p抑制劑(anti-miR-221-5p)、ALDH1A2過表達載體(pcDNA-ALDH1A2)、ALDH1A2抑制物(si-ALDH1A2)、陰性對照(miR-con、anti-miR-con、pcDNA-con和si-con)及ALDH1A2野生型(WT)和突變型(MUT)雙熒光報告質粒購自上海吉瑪制藥有限公司，Lipofectamine 2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，酶標儀、發(fā)光儀、顯微鏡及Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將人永生化鼻咽上皮細胞NP69、鼻咽癌細胞系SUNE1、HNE1和CNE2均培養(yǎng)于含10 % FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在飽和濕度37 ℃、5%CO2密閉培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞生長融合成一層時，洗滌，胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 細胞轉染 收集對數生長期的SUNE1細胞，消化并計數，用培養(yǎng)液將細胞稀釋為1×l06個/mL，接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合度達80%～90%時進行轉染，以不轉染的細胞為NC組。根據Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書進行操作，將載體或片段轉入SUNE1細胞。轉染分組：miR-221-5p低表達組(轉染anti-miR-con和anti-miR-221-5p)，ALDH1A2高表達組(轉染pcDNA-con和pcDNA-ALDH1A2)，miR-221-5p高表達組(轉染miR-con、miR-221-5p)，miR-221-5p和ALDH1A2低表達組(轉染anti-miR-221-5p+si-con和anti-miR-221-5p+si-ALDH1A2)，ALDH1A2的野生型(WT)和突變型(MUT)雙熒光素酶載體組(分別轉染miR-con+WT，miR-221-5p+WT，miR-con+MUT，miR-221-5p+MUT)。轉染48 h，收集細胞，驗證轉染結果，進行后續(xù)實驗。

1.2.3 Real-time PCR檢測RNA的表達 收集各組細胞，根據Total RNA提取試劑盒進行細胞總RNA的提取，檢測濃度后按照反轉錄PCR試劑盒說明書反轉錄合成cDNA，取cDNA為模板進行 Real-time PCR反應，合成ALDH1A2 mRNA和miR-221-5p。反應程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、59 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，45個循環(huán)；72 ℃5 min。運用2-ΔΔCt法進行數據分析。

1.2.4 MTT法測定細胞存活率和對順鉑半數抑制量(IC50) 收集各組對數生長期的SUNE1細胞，稀釋后以2×103個細胞/孔接種于96孔板中，以不加DDP的細胞為空白對照，每孔加入不同濃度的DDP(終濃度分別為0.78125～50 μg/mL，倍比稀釋)，在細胞生長至72 h時進行MTT實驗，每孔加入 20 μL(5 mg/mL)MTT，培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔再加入150 μL DMSO，室溫震蕩混勻10 min，酶標儀測定490 nm 吸光度(A)值。計算順鉑IC50值，細胞存活率=(A實驗組-A空白對照組)/(A陰性對照組-A空白對照組)×100%。每孔3個平行，實驗重復3次。

1.2.5 流式細胞術測定細胞凋亡率 收集各組SUNE1細胞，以每孔2×104個細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h，胰酶消化并收集細胞，進行洗滌細胞，根據 Annexin V/PI 試劑盒說明書進行操作，加入 200 μL binding buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL 碘化丙啶(PI)混勻，避光室溫孵育20 min，再加入 300 μL binding buffer，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達 收集對數生長期的NP69細胞和各組鼻咽癌細胞，加入RIPA裂解液裂解細胞，超聲破碎細胞，收集蛋白，測定蛋白濃度。取蛋白樣本進行SDS-PAGE，用轉膜儀將蛋白轉PVDF膜，將膜用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗(ALDH1A2抗體1∶1000、CyclinD1抗體1∶3000、Cleave-caspase-3抗體1∶2000、MRP1抗體1∶1000和β-actin抗體1∶4000)，4 ℃孵育過夜，洗膜3次，加入稀釋的酶標二抗，室溫孵育1 h，洗膜，顯影拍照，以β-actin 為內參照，分析蛋白表達水平。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗 根據1.2.2進行SUNE1細胞培養(yǎng)和轉染，將構建的ALDH1A2的野生型(WT)和突變型(MUT)雙熒光素酶報告載體分別與miR-con或miR-221-5p共轉染SUNE1細胞，轉染后培養(yǎng)48 h，收集細胞并將細胞進行裂解，離心收集裂解上清，根據試劑盒進行操作，發(fā)光儀檢測熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內參照，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

2 結果

2.1 miR-221-5p、ALDH1A2 mRNA和ALDH1A2 蛋白在鼻咽癌細胞系和鼻咽上皮細胞中的表達量 與NP69組相比，SUNE1組、HNE1組和CNE2組鼻咽癌細胞中miR-221-5p的表達量均顯著上升(P<0.05)，ALDH1A2 mRNA和蛋白的表達量均顯著下降(P<0.05)，見圖1和表1。miR-221-5p和ALDH1A2在3種鼻咽癌細胞株中的表達情況一致，后續(xù)實驗選擇SUNE1細胞進行研究。

圖1 Western Blot 檢測ALDH1A2蛋白的表達量

表1 miR-221-5p、ALDH1A2mRNA和ALDH1A2 蛋白在鼻咽癌細胞系和鼻咽上皮細胞中表達水平

2.2 低表達miR-221-5p抑制鼻咽癌細胞SUNE1增殖，誘導凋亡，增強對順鉑的敏感性 與NC組和anti-miR-con組相比，anti-miR-221-5p組miR-221-5p表達量顯著下降(P<0.05)，Cleave-caspase-3表達量顯著升高(P<0.05)，增殖相關蛋白CyclinD1和MRP1(多藥耐藥相關蛋白1)表達均降低(P<0.05)，細胞存活率顯著下降(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，順鉑半數抑制量(IC50)降低(P<0.05)，見圖2和表2。

表2 低表達miR-221-5p抑制鼻咽癌細胞SUNE1增殖、誘導凋亡和增強對順鉑的敏感性

圖2 低表達miR-221-5p抑制鼻咽癌細胞SUNE1增殖、誘導凋亡和增強對順鉑的敏感性

2.3 高表達ALDH1A2抑制鼻咽癌細胞SUNE1增殖，誘導凋亡，增強對順鉑的敏感性 與NC組和pcDNA-con組相比，pcDNA-ALDH1A2組ALDH1A2和Cleave-caspase-3表達量顯著升高(P<0.05)，Cyclin D1和MRP1表達顯著降低(P<0.05)，細胞存活率下降(P<0.05)，凋亡率上升(P<0.05)，順鉑半數抑制量(IC50)顯著降低(P<0.05)，見圖3和表3。

表3 高表達ALDH1A2抑制鼻咽癌細胞SUNE1增殖，誘導凋亡和增強對順鉑的敏感性

圖3 高表達ALDH1A2抑制鼻咽癌細胞SUNE1增殖，誘導凋亡，增強對順鉑的敏感性

2.4 miR-221-5p靶向ALDH1A2 TargetScan預測結果顯示，ALDH1A2的3′-UTR區(qū)含有與miR-221-5p互補的序列，見圖4A。與miR-con組相比，miR-221-5p組ALDH1A2野生型WT的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降(P<0.05)，而突變型MUT的螢火蟲熒光素酶相對活性無明顯變化，見表4。Western blot結果表明，與miR-con組相比，過表達miR-221-5p可使ALDH1A2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-con組相比，抑制miR-221-5p表達可使ALDH1A2蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，見圖4 B和表5。說明miR-221-5p靶向負調控ALDH1A2的表達。

表4 miR-con或miR-221-5p與ALDH1A2報告質粒共轉染SUNE1細胞后雙熒光素酶活性檢測

表5 Western Blot檢測ALDH1A2的表達

圖4 miR-221-5p靶向調控ALDH1A2表達

2.5 低表達ALDH1A2可部分逆轉miR-221-5p低表達對SUNE1細胞增殖、凋亡以及順鉑敏感性的影響 抑制miR-221-5p可抑制SUNE1細胞增殖、促進凋亡和增強順鉑敏感性。與anti-miR-221-5p+si-con

組相比，anti-miR-221-5p+si-ALDH1A2組ALDH1A2和Cleave-caspase-3蛋白表達顯著降低(P<0.05)，CyclinD1和MRP1蛋白表達顯著升高(P<0.05)，細胞存活率顯著上升(P<0.05)，凋亡率顯著降低(P<0.05)，順鉑半數抑制量(IC50)顯著升高(P<0.05)，見圖5和表6。

圖5 低表達ALDH1A2可部分逆轉miR-221-5p低表達對SUNE1細胞增殖、凋亡以及順鉑敏感性的影響

表6 低表達ALDH1A2可部分逆轉miR-221-5p低表達對SUNE1細胞增殖和凋亡以及順鉑敏感性的影響

3 討論

順鉑(Cisplatin)是一種鉑族金屬抗癌化療藥物，是順式-二氯二氨合鉑的簡稱，?？s寫為DDP，目前已廣泛應用于治療多種人惡性腫瘤，包括膀胱癌、頭頸部癌、肺癌、卵巢癌和睪丸癌[7]。順鉑主要作用機制是基于其與DNA嘌呤的交聯能力，干擾DNA修復機制，造成DNA損傷，進而誘導癌細胞凋亡；但由于其耐藥性和不良副作用，順鉑常與其他藥物聯合治療，以克服耐藥性和減少毒性。鼻咽癌可發(fā)生順鉑耐藥表型，靶向或阻斷BEX3活性可能有助于逆轉鼻咽癌順鉑耐藥表型[8]。臨床研究[9]表明，順鉑聯合吉西他濱可延長復發(fā)或轉移性鼻咽癌患者的無進展生存期，可作為該人群的標準一線治療方案。

大量miRNA在鼻咽癌中表達異常，以腫瘤抑制因子或致癌因子的作用調控鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展和耐藥等過程，可為患者提供有用的預后生物標志物，為鼻咽癌治療提供新的靶點[10-11]。miR-221-5p在前列腺癌、腎細胞癌組織和細胞系中表達上調，與癌細胞增殖、遷移和患者預后有關[12-13]。miR-221-5p在人乳腺癌微環(huán)境癌相關成纖維細胞中表達上調，可能參與了正常成纖維細胞向癌相關成纖維細胞的轉化，并與癌相關成纖維細胞的增殖、黏附、侵襲、轉移有密切關系[14]。有研究[4]表明，miR-221-5p在人鼻咽癌癌相關成纖維細胞中表達上調，可能與癌相關成纖維細胞的侵襲能力有關。miR-221-5p在鼻咽癌組織和細胞中的表達和作用尚不清楚。本研究發(fā)現，miR-221-5p在鼻咽癌細胞SUNE1、HNE1和CNE2中高表達，與前述結果[4]類似。抑制miR-221-5p表達可抑制鼻咽癌SUNE1細胞增殖和誘導細胞凋亡，并增強細胞的順鉑敏感性，說明miR-221-5p在鼻咽癌細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性過程中發(fā)揮重要作用。

ALDH1A2又稱乙醛脫氫酶(ALDH)1家族成員A2，是一種催化視黃醛合成視黃酸的酶，與ALDH1A1和ALDH1A3是三個高度保守的細胞同工酶，對脊椎動物成體器官和組織的正常生長、分化、發(fā)育和維持至關重要，是正常組織干細胞和腫瘤干細胞的標志物，參與自我更新、分化和自我保護[15]。ALDH1A2 在乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌和前列腺癌中表達異常，與患者總體生存率、癌細胞增殖、遷移、治療靶點、預后等有關[16-20]。ALDH1A2表達與神經母細胞瘤患者預后不良顯著相關，而且與異種神經母細胞瘤的生長和未分化以及神經母細胞瘤細胞對化療藥物13-順式維甲酸的耐藥有關[21]。ALDH1A2在鼻咽癌中的表達尚不清楚。

本研究結果發(fā)現，ALDH1A2在鼻咽癌細胞SUNE1、HNE1和CNE2中表達量均顯著下調，雙熒光素酶報告系統結果顯示，miR-221-5p靶向負調控ALDH1A2的表達；進一步的實驗結果表明，低表達ALDH1A2可部分逆轉miR-221-5p低表達對SUNE1細胞增殖、凋亡以及順鉑敏感性的影響，說明miR-221-5p和ALDH1A2在鼻咽癌細胞中存在調控關系。另外，本研究通過TargetScan預測發(fā)現，ALDH1A2的3’-UTR序列中含有與miR-221-5p互補的核苷酸序列，提示兩者存在調控關系，也提示ALDH1A2參與miR-221-5p對鼻咽癌增殖、凋亡和順鉑耐藥性的調控。下一步將研究miR-221-5p和ALDH1A2在鼻咽癌患者中的表達，兩者對腫瘤增殖、侵襲的影響，及對癌癥分期和患者存活期的影響等，進一步探討miR-221-5p和ALDH1A2在鼻咽癌臨床中的作用。

4 結論

在鼻咽癌SUNE1細胞中，低表達miR-221-5p可靶向促進ALDH1A2表達，進而抑制鼻咽癌SUNE1細胞增殖和誘導細胞凋亡，并增強細胞的順鉑敏感性的作用機制；miR-221-5p可能是鼻咽癌潛在的化療增敏靶點。