李淑芳，史天潔，左紹遠(yuǎn)

前列腺癌是男性最常見的非皮膚性腫瘤，每年約有160萬新發(fā)病例和36.6萬人因病死亡，是導(dǎo)致老年男性癌癥相關(guān)死亡和發(fā)病率的主要原因之一，也是男性最常見的惡性腫瘤［1，2］。有研究表明，長期雄激素消融治療導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞對(duì)PI3K/Akt途徑抑制的抵抗力增強(qiáng)，從而增加了腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗力，因而尋找新型的前列腺癌治療藥物和輔助藥，通過作用于PI3K/Akt途徑發(fā)揮抗腫瘤作用成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)［3］。紅花屬菊科植物，是一種常用的傳統(tǒng)中藥，具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛等功效。蜂花粉是一種傳統(tǒng)天然營養(yǎng)食品，系蜜蜂從紅花花蕊中收集的雄性生殖細(xì)胞與自身的分泌物混合成的不規(guī)則粉狀物［4］，含有多種生物活性物質(zhì)，其中多糖是其主要活性成分之一。前期研究結(jié)果表明，采用水提法提取的紅花蜂花粉多糖（PBPC）具有明顯的體內(nèi)、體外抗腫瘤作用［5，6］。由于水溶液和堿溶液提取的多糖在結(jié)構(gòu)、活性等方面有較大的差異，而目前有關(guān)堿提紅花蜂花粉多糖的研究鮮見報(bào)道。筆者采用CCK-8、RT-PCR與Western blot方法，觀察了稀堿提取分離、純化出的紅花蜂花粉多糖APBPC-3組分對(duì)人前列腺癌細(xì)胞DU145的抑制作用及其作用機(jī)制，以期為進(jìn)一步探索APBPC-3的抗腫瘤作用提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器堿提紅花蜂花粉多糖APBPC-3，由課題組制備提供；人前列腺癌DU145細(xì)胞株（中科院上海細(xì)胞生物研究所）；MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（HyClone，美國）；CCK-8試劑盒（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；ChamQTMIUniversal SYBR qPCR Master Mix試劑盒（南京維諾贊生物科技有限公司）；RIPA裂解液、0.25%胰酶細(xì)胞消化液、青霉素-鏈霉溶液（100X）、5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、SDS-電泳液、TBST洗脫液、SDS-PAGE凝膠試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；β-actin抗體，二抗（Proteintech）；Bcl-2、Bax、P53、Caspase-3、PTEN、Akt-1、PI3k抗體（Abcam）；7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)DU145細(xì)胞在培養(yǎng)基添加10%的胎牛血清（1%100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素），在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%左右，0.25%胰酶消化傳代，選擇處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCk-8法檢測(cè)對(duì)前列腺癌細(xì)胞的增殖影響取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，6×103個(gè)/孔的濃度接種于96孔板，待細(xì)胞完全貼壁后，APBPC-3進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)組為不同濃度APBPC-3處理 （50，100，200，300，600μg/ml），其中以加入細(xì)胞懸液和培養(yǎng)基為對(duì)照組，只加細(xì)胞培養(yǎng)基為空白組，各劑量設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24 h和48 h后每孔加入20μl的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長的吸收度。由以下公式計(jì)算APBPC-3對(duì)DU145細(xì)胞增殖影響，并計(jì)算出IC50值。

細(xì)胞抑制率（%）=［OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組］/［OD對(duì)照組-OD空白組］×100%。

1.4 RT-PCR檢測(cè)DU145細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)

1.4.1 引物設(shè)計(jì) 采用primer 6.0設(shè)計(jì)，Oligo 7.0驗(yàn)證，由上海生工有限公司合成。β-actin，NCBI編號(hào)為NM_001101.3，上游引物為5-CGTGGACATCC GCAAAG-3下游引物為5-GGACTCGTCAATACT CCTGCTT-3；PI3K，NCBI編號(hào)為NM_001256045.2，上游引物為5-TGCGACAGATGAGTGATG-3，下游引物為5-TATCCTCCGATTACCAAGTG-3；Akt-1，NCBI編號(hào)為NM_001382433.1，上游引物為5-ACG CTACTTCCTCCTCAA-3，下游引物為5-GACACC TCCATCTCTTCAG-3；PTEN，NCBI編 號(hào) 為NM_000314.8，上游引物為5-GCTGGAAAGGGAC GAAC-3，下游引物5-CGCCTCTGACTGGGAAT-3；P53，NCBI編號(hào)為NM_001126112.2，上游引物為5-CCTCCTCAGCATCTTATCCG-3，下游引物為5-CACAAACACGCACCTCAAA-3；Caspase-3，NCBI編號(hào)為NM_001127428.1，上游引物為5-GGCTGGZC ATTGGACTTC-3，下游引物為5-TTATAGACCAC ATCT-3；Bcl-2，NCBI編號(hào)為NM_000633.2，上游引物為5-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3，上游引物為5-GAGACAGCCAGGAGAAATCA-3；Bax，NCBI編號(hào)為NM_138761.3，上游引物為5-GGATGCGT CCACCAAGAA-3，下游引物為：5-GCTGCCACTCG GAAAAAG-3。

1.4.2 RT-PCR實(shí)驗(yàn) 由CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇篩選出APBPC-3的IC50值濃度處理DU145細(xì)胞48h，對(duì)照組不加APBPC-3，收集待檢測(cè)細(xì)胞，按RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明提取RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算DU145細(xì)胞中相關(guān)基因表達(dá)量。

1.5 Western blot檢測(cè)DU145細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)同“1.4.2”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)處理DU145細(xì)胞，向待檢測(cè)細(xì)胞加入150μl RIPA裂解液（含PMSF），然后于冰上裂解10 min，離心12000 rpm 30 min 4℃。采用BCA試劑法定量蛋白，加入1×蛋白上樣緩沖液沸水浴加熱5 min，使蛋白充分變性。參照試劑盒說明書配制SDS-PAGE凝膠后，放入電泳槽內(nèi)取各組中蛋白20μg上樣電泳，以50 V電壓電泳45 min后調(diào)整電壓至120 V 1.5 h至電泳結(jié)束，濕轉(zhuǎn)膜，1×TBST洗膜3次，每次間隔5 min，取出PVDF膜浸入含5%脫脂奶粉的封閉液中搖床封閉1.5 h。以1∶1000的一抗工作液4℃孵育24 h后，1∶2000的二抗工作液室溫孵育1 h，1×TBST洗膜3次，每次間隔5 min，滴加發(fā)光劑顯影、曝光，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩多重比較采用LSD檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 APBPC-3對(duì)DU145細(xì)胞增殖的影響不同濃度（50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml和600μg/ml）的APBPC-3作用于細(xì)胞24 h和48 h后，對(duì)DU145細(xì)胞的抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴性（P＜0.05），見圖1。在50～600μg/ml濃度范圍內(nèi)均具有抑制作用，48 h IC50值為304.039μg/ml。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)（圖2）結(jié)果表明，對(duì)照組細(xì)胞貼壁良好，呈橢圓形，細(xì)胞密度大。而用APBPC-3（50～600μg/ml）處理的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，不能貼附在壁上，并在培養(yǎng)基中漂浮。與對(duì)照組相比，經(jīng)APBPC-3處理的細(xì)胞數(shù)量減少。DU145細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變與CCK-8法檢測(cè)結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，APBPC-3對(duì)DU145細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，且呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。

圖1 APBPC-3對(duì)DU145細(xì)胞增殖的影響

圖2 見封三。

圖2 不同濃度APBPC-3作用DU145細(xì)胞48 h后的形態(tài)學(xué)變化（10×倍鏡）

2.2 APBPC-3對(duì)DU145細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路mRNA表達(dá)水平的影響以IC50濃度的APBPC-3劑量作用于DU145細(xì)胞48 h后，使DU145細(xì)胞Bcl-2、Akt-1和PI3K基因mRNA表達(dá)量降低，與對(duì)照組相比，Bcl-2和Akt-1基因mRNA下調(diào)差異顯著（P＜0.01），但對(duì)PI3K基因mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。同時(shí)Bax基因、PTEN基因、P53基因和Caspase-3基因mRNA表達(dá)量明顯增加，與對(duì)照組相比，差異顯著（P＜0.05）。見圖3。

圖3 APBPC-3對(duì)DU145細(xì)胞QPCR結(jié)果

2.3 APBPC-3對(duì)DU145細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，APBPC-3處理組細(xì)胞的Bcl-2、PI3K和Akt-1蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），而PTEN、P53和Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著提高（P<0.05）。結(jié)果與RT-PCR一致，表明APBPC-3可通過PI3K/Akt信號(hào)通路抑制DU145細(xì)胞的增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用。見圖4。

圖4 APBPC-3對(duì)DU145細(xì)胞Western blot結(jié)果

3 討論

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)的一種高發(fā)的前列腺上皮惡性腫瘤［7］。有研究報(bào)道，PI3K/AKT通路的異常激活與細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腫瘤發(fā)生、癌癥進(jìn)展和耐藥性的發(fā)生有關(guān)，因而臨床上有許多藥物單獨(dú)或聯(lián)合通過該靶向通路用于實(shí)體瘤和血液惡性腫瘤的治療［8］。目前，前列腺癌治療基于患者的癌癥分期和特征進(jìn)行各種選擇，如放射治療、手術(shù)和化療等，然而由于放化療的不良反應(yīng)及耐藥性的發(fā)生，越來越多的研究集中在從天然植物中尋找用于治療癌癥的新醫(yī)藥產(chǎn)品［9］。有研究發(fā)現(xiàn)，五味子乙素可呈劑量依賴性的抑制P-Akt、p-mTOR和MMP-9的表達(dá)，從而抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和U87的遷移和侵襲［10］。該研究也表明APBPC-3可通過降低PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)基因、蛋白表達(dá)而抑制前列腺癌DU145細(xì)胞增殖。PI3K家族是一類針對(duì)底物絲氨酸/蘇氨酸殘基或磷脂信使的激酶，機(jī)體內(nèi)多種生長因子均能通過PI3K誘發(fā)PIP3的生成，進(jìn)一步活化含有PH結(jié)構(gòu)域的蘇氨酸激酶Akt，激活的Akt轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，激活下游靶分子，參與生存、增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程、生長、遷移和血管生成［11，12］，該通路在癌癥中通常由于激酶本身的突變和（或）PTEN的丟失而過度激活。腫瘤抑制因子PTEN可使PIP3去磷酸化而抑制Akt活性，阻止下游激酶的激活來調(diào)節(jié)該通路，是PI3K的負(fù)向調(diào)節(jié)因子。細(xì)胞凋亡受多種基因調(diào)控，其中P53被認(rèn)為是細(xì)胞分裂、DNA修復(fù)、細(xì)胞衰老和凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，大量研究表明，P53可以直接激活促凋亡蛋白Bax、APAF-1和PIG3，也可使抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl及Survin失活［13，14］。PI3K/Akt通路可以通過對(duì)MDM2的調(diào)控實(shí)現(xiàn)對(duì)P53正負(fù)向水平調(diào)節(jié)，Akt可使MDM2上的Ser166和Ser186磷酸化，導(dǎo)致MDM2移位到細(xì)胞核，促進(jìn)了P53的泛素化［15，16］。眾所周知，細(xì)胞凋亡是一個(gè)需要激活多個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)的生物學(xué)過程，其中線粒體是細(xì)胞凋亡途徑之一，Bcl-2家族和Caspase酶是調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵因素［17］。Bcl-2家族蛋白的激活是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的第一個(gè)調(diào)控步驟，Bcl-2家族蛋白包括Bad、Bax、Bcl-xl和Bcl-2等，Bcl-2蛋白家族之間的相互作用可以通過釋放細(xì)胞色素C（Cyto C）到細(xì)胞質(zhì)來調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性［18，19］。Bax和Bcl-2是功能相對(duì)立的2種調(diào)控蛋白，Bax作為促凋亡蛋白，可以促進(jìn)Cyto C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，而Bcl-2作為抗凋亡蛋白，可保護(hù)線粒體的完整性，阻止Cyto C的釋放［20，21］。Caspases家族蛋白Caspase-3（C-3）、Caspase-8和Caspase-9（C-9）在線粒體途徑介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡中起重要作用，C-3蛋白是線粒體凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，其中C-9是一系列caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的起始caspase，可被細(xì)胞質(zhì)CytoC激活，進(jìn)一步激活C-3，進(jìn)而導(dǎo)致一系列激活細(xì)胞凋亡蛋白酶的反應(yīng)［22］。

堿提紅花蜂花粉多糖APBPC-3對(duì)人前列腺癌DU145細(xì)胞具有顯著的抗增殖作用，其機(jī)制可能是通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路從而誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提示APBPC-3可能是一種潛在的治療前列腺癌的藥物。