李淑芳，史天潔，左紹遠

前列腺癌是男性最常見的非皮膚性腫瘤，每年約有160萬新發(fā)病例和36.6萬人因病死亡，是導致老年男性癌癥相關(guān)死亡和發(fā)病率的主要原因之一，也是男性最常見的惡性腫瘤［1，2］。有研究表明，長期雄激素消融治療導致前列腺癌細胞對PI3K/Akt途徑抑制的抵抗力增強，從而增加了腫瘤細胞對凋亡的抵抗力，因而尋找新型的前列腺癌治療藥物和輔助藥，通過作用于PI3K/Akt途徑發(fā)揮抗腫瘤作用成為當前研究熱點［3］。紅花屬菊科植物，是一種常用的傳統(tǒng)中藥，具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛等功效。蜂花粉是一種傳統(tǒng)天然營養(yǎng)食品，系蜜蜂從紅花花蕊中收集的雄性生殖細胞與自身的分泌物混合成的不規(guī)則粉狀物［4］，含有多種生物活性物質(zhì)，其中多糖是其主要活性成分之一。前期研究結(jié)果表明，采用水提法提取的紅花蜂花粉多糖（PBPC）具有明顯的體內(nèi)、體外抗腫瘤作用［5，6］。由于水溶液和堿溶液提取的多糖在結(jié)構(gòu)、活性等方面有較大的差異，而目前有關(guān)堿提紅花蜂花粉多糖的研究鮮見報道。筆者采用CCK-8、RT-PCR與Western blot方法，觀察了稀堿提取分離、純化出的紅花蜂花粉多糖APBPC-3組分對人前列腺癌細胞DU145的抑制作用及其作用機制，以期為進一步探索APBPC-3的抗腫瘤作用提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器堿提紅花蜂花粉多糖APBPC-3，由課題組制備提供；人前列腺癌DU145細胞株（中科院上海細胞生物研究所）；MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（HyClone，美國）；CCK-8試劑盒（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；ChamQTMIUniversal SYBR qPCR Master Mix試劑盒（南京維諾贊生物科技有限公司）；RIPA裂解液、0.25%胰酶細胞消化液、青霉素-鏈霉溶液（100X）、5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、SDS-電泳液、TBST洗脫液、SDS-PAGE凝膠試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；β-actin抗體，二抗（Proteintech）；Bcl-2、Bax、P53、Caspase-3、PTEN、Akt-1、PI3k抗體（Abcam）；7500 Fast實時熒光定量PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞培養(yǎng)DU145細胞在培養(yǎng)基添加10%的胎牛血清（1%100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素），在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細胞生長至80%左右，0.25%胰酶消化傳代，選擇處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3 CCk-8法檢測對前列腺癌細胞的增殖影響取對數(shù)生長期的細胞，6×103個/孔的濃度接種于96孔板，待細胞完全貼壁后，APBPC-3進行處理，實驗組為不同濃度APBPC-3處理 （50，100，200，300，600μg/ml），其中以加入細胞懸液和培養(yǎng)基為對照組，只加細胞培養(yǎng)基為空白組，各劑量設(shè)置3個復孔。置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24 h和48 h后每孔加入20μl的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，酶標儀測定450 nm波長的吸收度。由以下公式計算APBPC-3對DU145細胞增殖影響，并計算出IC50值。

細胞抑制率（%）=［OD對照組-OD實驗組］/［OD對照組-OD空白組］×100%。

1.4 RT-PCR檢測DU145細胞中PI3K/Akt信號通路相關(guān)基因的表達

1.4.1 引物設(shè)計 采用primer 6.0設(shè)計，Oligo 7.0驗證，由上海生工有限公司合成。β-actin，NCBI編號為NM_001101.3，上游引物為5-CGTGGACATCC GCAAAG-3下游引物為5-GGACTCGTCAATACT CCTGCTT-3；PI3K，NCBI編號為NM_001256045.2，上游引物為5-TGCGACAGATGAGTGATG-3，下游引物為5-TATCCTCCGATTACCAAGTG-3；Akt-1，NCBI編號為NM_001382433.1，上游引物為5-ACG CTACTTCCTCCTCAA-3，下游引物為5-GACACC TCCATCTCTTCAG-3；PTEN，NCBI編 號 為NM_000314.8，上游引物為5-GCTGGAAAGGGAC GAAC-3，下游引物5-CGCCTCTGACTGGGAAT-3；P53，NCBI編號為NM_001126112.2，上游引物為5-CCTCCTCAGCATCTTATCCG-3，下游引物為5-CACAAACACGCACCTCAAA-3；Caspase-3，NCBI編號為NM_001127428.1，上游引物為5-GGCTGGZC ATTGGACTTC-3，下游引物為5-TTATAGACCAC ATCT-3；Bcl-2，NCBI編號為NM_000633.2，上游引物為5-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3，上游引物為5-GAGACAGCCAGGAGAAATCA-3；Bax，NCBI編號為NM_138761.3，上游引物為5-GGATGCGT CCACCAAGAA-3，下游引物為：5-GCTGCCACTCG GAAAAAG-3。

1.4.2 RT-PCR實驗 由CCK-8實驗結(jié)果，選擇篩選出APBPC-3的IC50值濃度處理DU145細胞48h，對照組不加APBPC-3，收集待檢測細胞，按RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明提取RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行RT-PCR實驗，以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算DU145細胞中相關(guān)基因表達量。

1.5 Western blot檢測DU145細胞中PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的表達同“1.4.2”項實驗處理DU145細胞，向待檢測細胞加入150μl RIPA裂解液（含PMSF），然后于冰上裂解10 min，離心12000 rpm 30 min 4℃。采用BCA試劑法定量蛋白，加入1×蛋白上樣緩沖液沸水浴加熱5 min，使蛋白充分變性。參照試劑盒說明書配制SDS-PAGE凝膠后，放入電泳槽內(nèi)取各組中蛋白20μg上樣電泳，以50 V電壓電泳45 min后調(diào)整電壓至120 V 1.5 h至電泳結(jié)束，濕轉(zhuǎn)膜，1×TBST洗膜3次，每次間隔5 min，取出PVDF膜浸入含5%脫脂奶粉的封閉液中搖床封閉1.5 h。以1∶1000的一抗工作液4℃孵育24 h后，1∶2000的二抗工作液室溫孵育1 h，1×TBST洗膜3次，每次間隔5 min，滴加發(fā)光劑顯影、曝光，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.6 統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩多重比較采用LSD檢驗，以α=0.05為檢驗水準，所有實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 APBPC-3對DU145細胞增殖的影響不同濃度（50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml和600μg/ml）的APBPC-3作用于細胞24 h和48 h后，對DU145細胞的抑制作用呈時間和劑量依賴性（P＜0.05），見圖1。在50～600μg/ml濃度范圍內(nèi)均具有抑制作用，48 h IC50值為304.039μg/ml。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)（圖2）結(jié)果表明，對照組細胞貼壁良好，呈橢圓形，細胞密度大。而用APBPC-3（50～600μg/ml）處理的細胞形態(tài)發(fā)生改變，不能貼附在壁上，并在培養(yǎng)基中漂浮。與對照組相比，經(jīng)APBPC-3處理的細胞數(shù)量減少。DU145細胞形態(tài)學改變與CCK-8法檢測結(jié)果一致。實驗結(jié)果表明，APBPC-3對DU145細胞的增殖有明顯的抑制作用，且呈時間和劑量依賴關(guān)系。

圖1 APBPC-3對DU145細胞增殖的影響

圖2 見封三。

圖2 不同濃度APBPC-3作用DU145細胞48 h后的形態(tài)學變化（10×倍鏡）

2.2 APBPC-3對DU145細胞PI3K/Akt信號通路mRNA表達水平的影響以IC50濃度的APBPC-3劑量作用于DU145細胞48 h后，使DU145細胞Bcl-2、Akt-1和PI3K基因mRNA表達量降低，與對照組相比，Bcl-2和Akt-1基因mRNA下調(diào)差異顯著（P＜0.01），但對PI3K基因mRNA表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。同時Bax基因、PTEN基因、P53基因和Caspase-3基因mRNA表達量明顯增加，與對照組相比，差異顯著（P＜0.05）。見圖3。

圖3 APBPC-3對DU145細胞QPCR結(jié)果

2.3 APBPC-3對DU145細胞PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達的影響與對照組相比，APBPC-3處理組細胞的Bcl-2、PI3K和Akt-1蛋白表達水平明顯降低（P<0.05），而PTEN、P53和Caspase-3蛋白表達水平顯著提高（P<0.05）。結(jié)果與RT-PCR一致，表明APBPC-3可通過PI3K/Akt信號通路抑制DU145細胞的增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用。見圖4。

圖4 APBPC-3對DU145細胞Western blot結(jié)果

3 討論

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)的一種高發(fā)的前列腺上皮惡性腫瘤［7］。有研究報道，PI3K/AKT通路的異常激活與細胞轉(zhuǎn)化、腫瘤發(fā)生、癌癥進展和耐藥性的發(fā)生有關(guān)，因而臨床上有許多藥物單獨或聯(lián)合通過該靶向通路用于實體瘤和血液惡性腫瘤的治療［8］。目前，前列腺癌治療基于患者的癌癥分期和特征進行各種選擇，如放射治療、手術(shù)和化療等，然而由于放化療的不良反應及耐藥性的發(fā)生，越來越多的研究集中在從天然植物中尋找用于治療癌癥的新醫(yī)藥產(chǎn)品［9］。有研究發(fā)現(xiàn)，五味子乙素可呈劑量依賴性的抑制P-Akt、p-mTOR和MMP-9的表達，從而抑制惡性膠質(zhì)瘤細胞U251和U87的遷移和侵襲［10］。該研究也表明APBPC-3可通過降低PI3K/Akt信號通路相關(guān)基因、蛋白表達而抑制前列腺癌DU145細胞增殖。PI3K家族是一類針對底物絲氨酸/蘇氨酸殘基或磷脂信使的激酶，機體內(nèi)多種生長因子均能通過PI3K誘發(fā)PIP3的生成，進一步活化含有PH結(jié)構(gòu)域的蘇氨酸激酶Akt，激活的Akt轉(zhuǎn)位到細胞質(zhì)和細胞核，激活下游靶分子，參與生存、增殖、細胞周期進程、生長、遷移和血管生成［11，12］，該通路在癌癥中通常由于激酶本身的突變和（或）PTEN的丟失而過度激活。腫瘤抑制因子PTEN可使PIP3去磷酸化而抑制Akt活性，阻止下游激酶的激活來調(diào)節(jié)該通路，是PI3K的負向調(diào)節(jié)因子。細胞凋亡受多種基因調(diào)控，其中P53被認為是細胞分裂、DNA修復、細胞衰老和凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，大量研究表明，P53可以直接激活促凋亡蛋白Bax、APAF-1和PIG3，也可使抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl及Survin失活［13，14］。PI3K/Akt通路可以通過對MDM2的調(diào)控實現(xiàn)對P53正負向水平調(diào)節(jié)，Akt可使MDM2上的Ser166和Ser186磷酸化，導致MDM2移位到細胞核，促進了P53的泛素化［15，16］。眾所周知，細胞凋亡是一個需要激活多個信號級聯(lián)的生物學過程，其中線粒體是細胞凋亡途徑之一，Bcl-2家族和Caspase酶是調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵因素［17］。Bcl-2家族蛋白的激活是線粒體介導的細胞凋亡的第一個調(diào)控步驟，Bcl-2家族蛋白包括Bad、Bax、Bcl-xl和Bcl-2等，Bcl-2蛋白家族之間的相互作用可以通過釋放細胞色素C（Cyto C）到細胞質(zhì)來調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性［18，19］。Bax和Bcl-2是功能相對立的2種調(diào)控蛋白，Bax作為促凋亡蛋白，可以促進Cyto C從線粒體釋放到細胞質(zhì)，而Bcl-2作為抗凋亡蛋白，可保護線粒體的完整性，阻止Cyto C的釋放［20，21］。Caspases家族蛋白Caspase-3（C-3）、Caspase-8和Caspase-9（C-9）在線粒體途徑介導腫瘤細胞凋亡中起重要作用，C-3蛋白是線粒體凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，其中C-9是一系列caspase級聯(lián)反應中的起始caspase，可被細胞質(zhì)CytoC激活，進一步激活C-3，進而導致一系列激活細胞凋亡蛋白酶的反應［22］。

堿提紅花蜂花粉多糖APBPC-3對人前列腺癌DU145細胞具有顯著的抗增殖作用，其機制可能是通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路從而誘導線粒體介導的細胞凋亡，提示APBPC-3可能是一種潛在的治療前列腺癌的藥物。