馬立霜，李 萌

骨肉瘤是兒童群體中最常見的成骨性惡性腫瘤，原發(fā)于骨組織，惡性程度高，侵襲性強，預后較差［1］。骨肉瘤可在短時間內發(fā)生肺部轉移，發(fā)生肺部轉移的患者5年生存率不到20%，致殘率、致死率非常之高。目前臨床需要影像學對骨肉瘤進行輔助診斷，但多數仍需手術切除病變骨組織進行病理證實，早期診斷手段非常局限［2］。細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）［3］是白細胞的亞群，為一種特異T細胞，專門分泌各種細胞因子參與免疫作用，對某些病毒、腫瘤細胞等抗原物質具有殺傷作用，與自然殺傷細胞構成機體抗病毒、抗腫瘤免疫的重要防線。程序性死亡受體1（programmed death receptor 1，PD-1）是CTL細胞表達的一種免疫抑制性受體，腫瘤細胞能夠表達PD-1的配體程序性死亡受體配體1（programmed death receptor ligand1，PD-L1），PD-1與PD-L1結合可激活CTL胞內抑制性信號，引發(fā)免疫抑制反應，導致腫瘤細胞免疫逃逸［4］?，F如今關于骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過程及生物學規(guī)律還未探明，免疫系統(tǒng)的失調可能參與骨肉瘤的發(fā)病機制。大量的研究表明［5-7］，多種腫瘤組織中的PD-1和PD-L1表達與腫瘤患者分期和預后相關。筆者采用免疫組織化學（IHC）方法檢測兒童骨肉瘤組織PD-1和PD-L1的表達，以判斷PD-1和PD-L1與患者臨床特征的關系，探討其與骨肉瘤預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年1月—2020年1月在筆者醫(yī)院接受手術治療的24例兒童骨肉瘤患者作為研究對象，均經病理活檢證實患骨肉瘤，手術切除的24例骨肉瘤制作成組織標本。14例男性患者，10例女性患者，年齡5~16歲，平均（10.5±4.3）歲。收集臨床資料并進行出院后電話隨訪。個人基本資料包括年齡、性別、首發(fā)癥狀、腫瘤部位、腫瘤直徑、病理類型、TNM分期。隨訪截止日期為2019年1月。納入標準：年齡≤16歲；行骨肉瘤根治術；需經組織病理學確診為骨肉瘤；未合并其他腫瘤；術前未進行任何放化療及靶向治療。排除標準：合并嚴重心腦血管疾病或其他系統(tǒng)疾病患者；合并其他嚴重腫瘤患者。該研究已獲得醫(yī)院倫理委員會批準，并取得所有患者及其家屬的知情同意。

1.2 樣本收集及測定兔抗人PD-1和PD-L1單克隆抗體（abl74838）購自英國Abcam公司，免疫組化方法涉及的其他試劑均購自福州邁新公司。骨肉瘤組織標本，常規(guī)石蠟包埋組織標本，切片、脫蠟、染色等免疫組化實驗步驟需嚴格按照試劑盒說明書進行：（1）骨肉瘤組織蠟塊4μm厚切片；（2）二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；（3）3%過氧化氫室溫孵育10 min，消除內源性過氧化物酶（peroxidase）的活性；（4）先進行蒸餾水沖洗，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）浸泡5 min，并進行2次；（5）pH8.0的乙二胺四乙酸（EDTA）0.5 mol/L進行微波抗原修復10 min；（6）使用5%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min，傾去血清，勿洗，滴加一抗工作液，37℃孵育1 h；（7）PBS沖洗，5 min，并進行3次；（8）滴加適量生物素標記二抗工作液，37℃孵育30 min；（9）PBS沖洗，5 min，并進行3次；（10）滴加適量堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素（SABC）工作液，37℃孵育30 min；（11）PBS沖 洗，5 min，并進行3次；（12）免疫組化染色DAB室溫顯色3 min；（13）使用蒸餾水充分沖洗，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

PD-L1、PD-1陽性物為棕黃色顆粒，均定位于細胞膜和細胞質。在光鏡下（×400）10個視野計數，每個視野計數100個細胞。根據腫瘤細胞中陽性細胞所占百分比（A）和染色強度（B）兩個方面進行分析：（1）陽性細胞所占百分比（A）：0分為無陽性細胞，1分為陽性細胞百分比≤25%，2分為陽性細胞百分比26%~50%，3分為陽性細胞百分比51%~75%，4分為陽性細胞百分比≥76%；（2）染色強度（B）：0分為無染色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。AB相乘結果≥1表示結果為陽性。

分析PD-1和PD-L1與患者性別、首發(fā)癥狀、腫瘤部位、腫瘤直徑、病理類型、TNM分期數的相關性。TNM分期參照美國癌癥聯合委員會（AJCC）TNM分期系統(tǒng)。

通過電話、復查方式得到患者無疾病生存期（disease-free survival，DFS）即從確診骨肉瘤至腫瘤復發(fā)或轉移或最后一次隨訪的時間。隨訪截止時間為2020年1月。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數據處理，計量資料采用（±s）表示，組間比較采用t檢驗；PD-1和PD-L1與患者年齡、性別、首發(fā)癥狀、腫瘤部位、腫瘤直徑、病理類型、TNM分期的相關性分析采用χ2檢驗；使用Kaplan-Meier方法對骨肉瘤患者無疾病生存期進行生存分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PD-1和PD-L1表達與骨肉瘤患者臨床特征的相關性表1顯示：PD-1和PD-L1陽性表達與陰性表達與患者年齡、性別、首發(fā)癥狀、腫瘤部位、腫瘤直徑、病理類型、TNM分期無明顯相關性（P＞0.05）。PD-1在細胞膜和細胞質上低表達，PD-L1在細胞膜和細胞質上高表達；見圖1，圖2。

圖1 、2見封三。

圖1 PD-1免疫組化圖片（×400）

圖2 PD-L1免疫組化圖片（×400）

表1 PD-1和PD-L1表達與骨肉瘤患者臨床特征的相關性［例（%）］

2.2 骨肉瘤組織中PD-1/PD-L1與患者無疾病生存期的關系通過Kaplan-Meier方法進行生存分析24個月無疾病生存期，PD-1陽性表達與陰性表達的無疾病生存期比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.618）；PD-L1陽性表達與陰性表達的無疾病生存期比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001）。見圖3、圖4。

圖3 、4見封三。

圖3 兒童骨肉瘤患者PD-1陽/陰性表達的24個月生存曲線

圖4 兒童骨肉瘤患者PD-L1陽/陰性表達的24個月生存曲線

3 討論

骨肉瘤是一種侵襲性強、患者預后差的原發(fā)性惡性腫瘤［8］，可發(fā)病于各個年齡段，但最常見于兒童，是威脅我國兒童健康的主要惡性腫瘤之一。骨肉瘤與其他惡性腫瘤一樣，在初期具有隱匿性，典型的臨床癥狀和體征（壓痛疼痛、關節(jié)腫脹、有腫塊、活動受限等）在疾病早期發(fā)現比較困難，患者就診時大多已到中晚期。骨肉瘤外科手術治療預后差，并且對患者的生活質量造成較大的影響。新輔助化療方案即術前化療+外科手術+術后化療［9］，這種方案使得骨肉瘤患者預后得到較大改善。該研究探討骨肉瘤分子水平發(fā)病機制，對骨肉瘤的早期診斷和治療具有重要意義。

該研究提示，PD-1和PD-L1陽性表達與患者性別、首發(fā)癥狀、腫瘤部位、腫瘤直徑、病理類型、TNM分期無明顯相關性（P＞0.05），與藍瑞隆等［9］的研究結果一致。但在骨外骨肉瘤、鼻咽癌［4］、結直腸癌［10］組織的PD-1和PD-L1的表達研究中，發(fā)現PD-L1的陽性表達與臨床分期有關。而該研究結果可能與所納入的樣本量有較大的關系，需要進一步加大樣本量進行試驗來證實。PD-L1陽性表達與患者的無疾病生存期（DFS）有關，PD-1陽性表達與患者的DFS無明顯相關性，可能是因為骨肉瘤細胞在多種細胞因子的作用下高表達PD-L1，PD-L1的高表達可誘導骨肉瘤患者體內T淋巴細胞的凋亡并增強癌細胞的轉移能力而導致病死率上升［11］，形成惡性循環(huán)，改變骨肉瘤細胞的微環(huán)境，由此推測PD-L1可以作為患者預后的標志。

綜上所述，PD-L1的陽性表達與兒童骨肉瘤患者的DFS有關，可作為判斷患者預后的標志。另外對PD-1/PD-L1通路的研究，可為骨肉瘤病理診斷和臨床治療提供參考，為靶腫瘤精準化治療提供有力保障［12］。通過個體化應用PD-1/PD-L1免疫抑制劑，并且調整免疫抑制劑劑量，修飾并矯正宿主免疫反應，直接靶向腫瘤細胞對于骨肉瘤患者治療更為高效。