趙芷潔若，劉云鶴，劉阿慶，夏 穎，張 冠，楊艷杰，于建春

肺癌是全世界發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一。2018年全球腫瘤統(tǒng)計(jì)分析報(bào)告顯示，全球新增肺癌患者209.4萬例，死亡176.1萬例，分別占全部癌癥發(fā)病和死亡的11.6%和18.4%［1］。肺癌在我國男性腫瘤發(fā)病率中居首位，2018年我國的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全國77.4萬的新增肺癌病例，約有69萬人死于肺癌［2］。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌病例的85%，其5年生存率僅為15%［3］。造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）是血液系統(tǒng)中的成體干細(xì)胞，是一個(gè)異質(zhì)性的群體，具有長期自我更新的能力和分化成各類成熟血細(xì)胞的潛能［4］。在骨髓中，具有自我更新能力的HSC產(chǎn)生多能祖細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生各種不同譜系的祖細(xì)胞，如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞，共同（普通）淋巴祖細(xì)胞等［5］。研究表明［6］，HSC數(shù)量的減少可導(dǎo)致T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫的長期損傷，與白血病的復(fù)發(fā)及預(yù)后密切相關(guān)。因此，造血干細(xì)胞移植越來越廣泛地應(yīng)用于各種血液病、惡性腫瘤等疾病的治療［7，8］。同時(shí)，造血干細(xì)胞功能的正常與否，決定著與機(jī)體免疫細(xì)胞數(shù)量的多少及功能是否正常［9］。因此，檢測腫瘤患者外周血HSC的相對計(jì)數(shù)和絕對計(jì)數(shù)具有重要的意義。CD34是一種單鏈跨膜蛋白，是造血干細(xì)胞標(biāo)志物，未成熟的造血前體細(xì)胞以及骨髓和血液中的造血集落細(xì)胞（包括單能和多能祖細(xì)胞）上都存在CD34抗原［10］。研究發(fā)現(xiàn)［11］，CD34還在血管源性腫瘤、胃腸道間質(zhì)瘤、孤立性纖維性腫瘤等軟組織腫瘤中均有不同程度的表達(dá)。但有關(guān)CD34+HSC在NSCLC患者外周血中的含量及與患者預(yù)后相關(guān)性研究較少。筆者對NSCLC患者外周血中CD34的相對計(jì)數(shù)及絕對計(jì)數(shù)進(jìn)行檢測，探討其與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2018年9月—2019年9月筆者醫(yī)院收治的100例非小細(xì)胞肺癌患者。其中男77例，女23例；年齡45～80歲，平均（63.58±9.20）歲；其中有吸煙史61例，無吸煙史39例；鱗癌35例，腺癌65例；病理分型低分化37例，中-高分化63例；臨床分期Ⅰ+Ⅱ期50例，Ⅲ+Ⅳ期50例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例；有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移51例，無遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移49例。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)影像學(xué)與病理學(xué)檢查確診，臨床分期依據(jù)第8版TNM分期［12］；年齡18～80歲；預(yù)計(jì)生存期≥3個(gè)月；Karnofsy狀態(tài)量表（KPS）得分≥60分；無合并急性感染或其他部位腫瘤，無傳染病、自身免疫性疾病及血液系統(tǒng)疾病等。排除標(biāo)準(zhǔn)：病理診斷不能確診為非小細(xì)胞肺癌或無病理診斷；合并急性感染或其他惡性腫瘤；合并嚴(yán)重心腦血管疾病，糖尿病，免疫系統(tǒng)疾病或精神障礙等疾病。該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會討論研究后通過，所有患者及其家屬知情后簽署知情同意書。

另外選取52例同期在醫(yī)院體檢且年齡相匹配的健康人作為正常對照組（normal controls，NCs），所有入組正常人無惡性腫瘤、急性感染、嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病或血液系統(tǒng)疾病，且血常規(guī)、肝功能、腎功能、血糖、血脂等實(shí)驗(yàn)室檢查及心電圖、胸片等輔助檢查均正常。

1.2 方法（1）臨床資料收集。收集入組患者的臨床病理特征以及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或死亡的相關(guān)信息，分析HSC相對計(jì)數(shù)和絕對計(jì)數(shù)與NSCLC患者的臨床病理特征以及預(yù)后的相關(guān)性。同時(shí)比較HSC絕對計(jì)數(shù)與CD3、CD4、CD8、B、NK細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)的相關(guān)性。無進(jìn)展生存期（Progression free survival，PFS）定義為從入組之日起，到疾病復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、或任何原因?qū)е禄颊咚劳觯?3］。隨訪截止時(shí)間為2020-09-30。（2）外周血造血干細(xì)胞（CD34+HSC）檢測。抽取NSCLC患者及正常人（NCs）外周血各2 ml于EDTA抗凝管中，每份樣本取1支BD Trucount管；采用BDTMStem Cell Enumeration試劑盒（貨號：344563），檢測外周血造血干細(xì)胞（CD34+細(xì)胞）。主要步驟：往管底加入20μl的BD Stem Cell試劑；往管中加入20μl 7-AAD試劑；往管中加入100μl充分混勻的抗凝全血，輕微渦旋混勻，室溫避光孵育20 min；每管中加入2 ml 1×氯化銨裂解液，輕微渦旋混勻；室溫避光孵育10 min；立即將制備好的樣本置于濕冰上，用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。（3）外周血淋巴細(xì)胞檢測。采用BD Multitest IMK kit（貨號：340503）試劑盒，檢測CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T細(xì)胞，CD19+（B細(xì)胞），CD3-CD16+CD56+（NK細(xì)胞）。主要步驟：每個(gè)樣本取有兩支BD Trucount試管，分別標(biāo)記為A、B，以示區(qū)別；取20μl BD Multitest CD3/CD4/CD8/CD45試劑，加入到A管的底部；取20μl BD Multitest CD3/CD16+CD56/CD45/CD19試劑，加入到B管底部；取50μl充分混勻的抗凝全血，加到各管底部，充分渦旋混勻，室溫避光孵育20 min；每管中加入460μl 1×BD MultitestIMK kit溶血素，輕微渦旋混勻，室溫避光孵育15 min；隨后于BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，2組計(jì)量資料服從正態(tài)分布，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，用（±s）表示，不服從正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，用中位數(shù)（下四分位數(shù)～上四分位數(shù)）表示；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；HSC相對計(jì)數(shù)、絕對計(jì)數(shù)對PFS的影響采用Kaplan-Meier生存分析法，應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者與正常人組（NCs）CD34+HSC相對計(jì)數(shù)和絕對計(jì)數(shù)比較經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)顯示，100例NSCLC患者CD34+HSC相對計(jì)數(shù)中位數(shù)為0.8%（0.40%～1.80%），52例正常人CD34+HSC相對計(jì)數(shù)中位數(shù)為2.36%（1.73%～3.67%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。NSCLC患者CD34+HSC絕對計(jì)數(shù)中位數(shù)為0.66（0.31～1.42）cells/μl，正常人組CD34+HSC絕對計(jì)數(shù)中位數(shù)為1.66（0.95～2.36）cells/μl，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖1。

圖1 NSCLC患者與正常人CD34+HSC相對計(jì)數(shù)和絕對計(jì)數(shù)比較（＊＊＊P＜0.001）

2.2 不同臨床分期NSCLC患者CD34+HSC相對計(jì)數(shù)和絕對計(jì)數(shù)比較經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)顯示，50例Ⅰ+Ⅱ期NSCLC患者CD34+HSC相對計(jì)數(shù)中位數(shù)為2.13%（1.20%～4.76%），50例Ⅲ+Ⅳ期NSCLC患者CD34+HSC相對計(jì)數(shù)中位數(shù)為0.5%（0.20%～1.18%），2組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003）。Ⅰ+Ⅱ期NSCLC患者CD34+HSC絕對計(jì)數(shù)中位數(shù)為1.02（0.433～2.15）cells/μl，Ⅲ+Ⅳ期NSCLC患者CD34+HSC絕對計(jì)數(shù)中位數(shù)為0.535（0.188～1.205）cells/μl，2組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），見圖2。

圖2 不同臨床分期NSCLC患者HSC相對計(jì)數(shù)和絕對計(jì)數(shù)比較（＊＊P＜0.01）

2.3 CD34+HSC絕對計(jì)數(shù)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系以100例NSCLC患者的CD34+HSC絕對計(jì)數(shù)中位數(shù)0.66 cells/μl為界值分為CD34+HSC＜0.66 cells/μl組和CD34+HSC≥0.66 cells/μl組，每組各50例。經(jīng)單因素分析顯示，不同臨床分期、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否出現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移以及CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)在CD34+HSC＜0.66 cells/μl組和HSC≥0.66 cells/μl組具有顯著差異 （P＜0.05）。而不同年齡、性別、是否吸煙、病理類型、腫瘤大小、分化程度、CD3+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK絕對計(jì)數(shù)在CD34+HSC＜0.66 cells/μl組和CD34+HSC≥0.66 cells/μl組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 CD34+HSC絕對計(jì)數(shù)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 HSC相對計(jì)數(shù)和絕對計(jì)數(shù)對NSCLC患者無進(jìn)展生存期（PFS）的影響Kaplan-Meier預(yù)后分析顯示，與CD34+HSC相對計(jì)數(shù)＜0.80%患者的PFS相比，CD34+HSC相對計(jì)數(shù)≥0.80%患者的PFS顯著延長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)（P=0.043）。與CD34+HSC絕對計(jì)數(shù)＜0.66 cells/μl患者的PFS相比，CD34+HSC≥0.66 cells/μl患者的PFS顯著延長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)（P=0.026），見圖3。

圖3 NSCLC患者HSC相對計(jì)數(shù)和絕對計(jì)數(shù)與PFS相關(guān)性分析（＊＊P＜0.01）

3 討論

肺癌的發(fā)生率呈逐年上升趨勢，且多數(shù)患者在就診時(shí)已屬晚期，治愈率極低［14］。以往肺癌的治療方法主要包括手術(shù)、放療、化療、小分子靶向治療等，雖然在一定程度上能夠改善患者的預(yù)后，但最終晚期腫瘤還是容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，病死率極高［15］。因此，近年來腫瘤免疫治療越來越受到研究者的重視，腫瘤免疫治療也被稱為最有望能攻克腫瘤的治療方法之一［16］。造血是機(jī)體血液中的細(xì)胞成分不斷得到補(bǔ)充的過程，造血系統(tǒng)由各種高度分化的細(xì)胞群組成，其中HSC在造血系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。骨髓中的HSC具有自我更新和產(chǎn)生各種祖細(xì)胞的能力，包括淋巴樣干細(xì)胞和髓樣干細(xì)胞，淋巴樣干細(xì)胞進(jìn)一步分化為祖T細(xì)胞、祖B細(xì)胞和NK前體細(xì)胞［17］。研究發(fā)現(xiàn)［18］，T細(xì)胞減少，增加造血干細(xì)胞移植的排斥風(fēng)險(xiǎn)，且易出現(xiàn)惡性血液病復(fù)發(fā)。因此，造血干細(xì)胞對于免疫細(xì)胞的數(shù)量及其功能具有重要的影響，對于抗腫瘤免疫防御具有重要意義。

在腫瘤免疫治療中，T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞均發(fā)揮重要作用。其中，CD3+細(xì)胞為總T細(xì)胞，根據(jù)功能又可將其分為CD4+T和CD8+T細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞亞群參與了適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的發(fā)展和維持，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮雙重作用。CD4+T細(xì)胞亞群可以分化為不同的亞群，具有不同的功能和特性，可刺激Th1和CD4+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的細(xì)胞毒性反應(yīng)，起到免疫監(jiān)視的作用，同時(shí)，在免疫反應(yīng)的初級和次級階段可以增強(qiáng)和維持細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)［19］。CD8+T細(xì)胞，作為細(xì)胞毒性細(xì)胞，在主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子存在的情況下識別抗原，并分泌細(xì)胞溶解顆粒和趨化因子來破壞癌細(xì)胞。自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）在先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮核心作用［20］。B細(xì)胞是體液免疫的主要參與者，在抗原存在的情況下可激活T細(xì)胞，同時(shí)活化的B細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用殺傷腫瘤細(xì)胞［21］。

該研究中，NSCLC患者CD34+HSC相對計(jì)數(shù)（0.8%）和絕對計(jì)數(shù)（0.66 cells/μl）明顯低于正常人，CD34相對計(jì)數(shù)（2.36%）和絕對計(jì)數(shù)（1.66 cells/μl），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ⅲ+Ⅳ期NSCLC患者CD34+HSC相對計(jì)數(shù)（0.50%）和絕對計(jì)數(shù)（0.535 cells/μl）明顯低于Ⅰ+Ⅱ期NSCLC患者CD34相對計(jì)數(shù)（2.13%）和絕對計(jì)數(shù)（1.02 cells/μl），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單因素分析顯示，CD34+HSC絕對計(jì)數(shù)水平與不同臨床分期、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否出現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移以及CD4+T淋巴細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，CD34+HSC相對計(jì)數(shù)和絕對計(jì)數(shù)具有判斷NSCLC患者預(yù)后的價(jià)值。Kaplan-Meier生存分析顯示，CD34+HSC相對計(jì)數(shù)≥0.80%、HSC≥0.66 cells/μl患者的PFS顯著延長，且具有顯著性差異，提示CD34+HSC含量高的NSCLC患者預(yù)后較好，這與國外一項(xiàng)研究結(jié)果一致［6］。

綜上所述，外周血CD34+HSC水平與非小細(xì)胞肺癌密切相關(guān)，可以作為非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的一個(gè)重要的指標(biāo)。