袁江 程申 李嵐

浙江省中醫(yī)院 浙江 杭州 310006

支氣管哮喘可由機(jī)體內(nèi)源性、外源性免疫系統(tǒng)共同作用引起，內(nèi)毒素、感染、塵螨均可引起氣道炎癥[1]。調(diào)查顯示，我國(guó)哮喘患者已達(dá)3000萬(wàn)以上，而小于3歲發(fā)病的患兒占50%，發(fā)病率、死亡率呈逐年遞增的趨勢(shì)[2]。目前，哮喘在臨床上以藥物對(duì)癥治療為主，無(wú)法避免免疫系統(tǒng)失衡及激素依賴等問題[3]。中草藥復(fù)方在防治哮喘方面具有較大的優(yōu)勢(shì)，臨床研究表明，給予補(bǔ)腎平喘方及其加減方可有效增強(qiáng)哮喘患兒機(jī)體免疫力，改善肺功能，具有標(biāo)本兼治之效[4]。該方對(duì)小兒哮喘的改善作用及機(jī)制，目前研究仍然有限。因此，本研究探討補(bǔ)腎平喘方對(duì)OVA致過敏性哮喘小鼠氣道炎癥的改善效果，為補(bǔ)腎平喘方的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：5周齡BALB/c小鼠，于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)買，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2018-0006。飼養(yǎng)于杭州鷹旸生物科技有限公司動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(浙)2020-0024。自由飲食攝水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要材料：補(bǔ)腎平喘方(組成：熟地20g，淫羊藿15g，附子、麻黃、桂枝、蘇子、紫菀各10g，甘草5g。浸泡0.5h，經(jīng)煎煮、過濾取藥液，煎煮3次，合并濃縮至5g/ml，置于冰箱保存?zhèn)溆?；卵清蛋白(OVA)、地塞米松(貨號(hào)：A8040-10、D8040，solarbio)；乙酰甲膽堿(Mch)(貨號(hào)：USP-1396364，USP)；IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、TNF-α 試劑盒(貨號(hào)：MM-0165M1、MM-0164M1、MM-0173M1、MM-0182M1、MM-0132M1，酶免)；IgE試劑盒(貨號(hào)：CK-E30441，sino best)；NF-κB p65、IκBα、TLR4、Foxp3、GAPDH抗體(貨號(hào)：ab207297、ab32518、ab95562、ab215206、ab8245，Abcam)；p-NF-κB p65、p-IκBα抗體(貨號(hào)：AF2006、AF2002，Affinity)。

1.3 慢性哮喘模型建立及分組：適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，第1、7、14d，僅空白組腹腔注射200μl生理鹽水，模型組、補(bǔ)腎平喘方低、高劑量組、地塞米松組小鼠腹腔注射致敏混懸液［10μg OVA+1mg Al(OH)3］，致敏第16d起，空白組霧化吸入10ml生理鹽水，其余小鼠霧化吸入含0.1g OVA(30min)，攻擊3次，連續(xù)8周[5]。期間，補(bǔ)腎平喘方低、高劑量組于攻擊前1h分別予15、30g·kg-1·d-1補(bǔ)腎平喘方灌胃，地塞米松組予1mg·kg-1·d-1地塞米松，空白組、模型組予等體積生理鹽水，每組各6只。

1.4 氣道高反應(yīng)性測(cè)定：末次OVA攻擊后24h，小鼠呼吸穩(wěn)定后依次吸入50μl的生理鹽水，6.5、12.5、25、50、100mg/ml Mch，EMKA動(dòng)物肺功能檢測(cè)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)氣道阻力。

1.5 炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)：麻醉處死小鼠，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)、血標(biāo)本及肺組織。BALF離心，沉淀行瑞士-吉姆薩染色分類計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)量。

1.6 ELISA檢測(cè)：ELISA測(cè)定BALF中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α水平和血清中IgE含量。

1.7 HE、AB-PAS染色：取肺組織切片，分別行HE、ABPAS染色以觀察氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況、黏液分泌及杯狀細(xì)胞增生情況。

1.8 Western blot檢測(cè)：取適量肺組織，裂解，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。Western blot檢測(cè)肺組織中 p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκBα、IκBα、TLR4、Foxp3蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間用t檢驗(yàn)比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組氣道高反應(yīng)性情況：由表1可知，隨吸入Mch濃度的升高，OVA誘導(dǎo)的各組氣道阻力顯著升高。而與模型組相比，補(bǔ)腎平喘方高劑量組可顯著下調(diào)氣道阻力(P＜0.05或P＜0.01)，低劑量組僅在Mch濃度為50、100mg/ml時(shí)顯著下調(diào)氣道阻力(P＜0.05)。

表1 各組氣道阻力結(jié)果比較 [±s,cmH2O/（ml·s）]

表1 各組氣道阻力結(jié)果比較 [±s,cmH2O/（ml·s）]

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

Mch(mg/ml)0 6.25 12.5 25 50 100地塞米松組97.90±7.38 99.55±12.03 113.79±13.37*124.34±11.43**167.40±19.62**177.66±10.56**空白組100±6.38 104.10±7.02 100±5.36**120.00±14.11**113.33±3.21**132.00±19.17**模型組99.55±4.36 116.53±15.31 150.38±14.86 189.20±14.72 260.44±17.49 371.42±17.90補(bǔ)腎平喘方低劑量組101.48±3.62 111.71±9.47 125.05±7.92 173.78±9.80 215.72±20.02*308.23±26.59*補(bǔ)腎平喘方高劑量組97.15±3.21 105.50±11.94 121.53±7.74*161.10±5.95*188.04±21.01*254.27±25.56**

2.2 各組炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)情況：見表2。與空白組相比，模型組BALF中總細(xì)胞個(gè)數(shù)及各炎癥細(xì)胞數(shù)量均顯著升高(P＜0.01)。與模型組相比，各給藥組均可顯著降低炎癥細(xì)胞數(shù)量(P＜0.05或P＜0.01)。

表2 各組炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)(±s，105/ml)

表2 各組炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)(±s，105/ml)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

細(xì)胞類別總細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞淋巴細(xì)胞中性粒細(xì)胞空白組3.80±0.360**0.60±0.153**0.71±0.146**0.33±0.106**0.38±0.072**模型組23.62±2.343 6.49±1.592 4.10±0.422 1.99±0.674 1.71±0.261補(bǔ)腎平喘方低劑量組18.51±1.668*4.27±0.305*2.91±0.333**1.14±0.241*1.18±0.164*補(bǔ)腎平喘方高劑量組14.03±2.874**2.92±0.579*2.55±0.407**0.63±0.196*0.72±0.244**地塞米松組10.17±1.823**1.49±0.525**1.43±0.424**0.54±0.178**0.33±0.319**

2.3 各組氣道炎癥因子變化情況：由表3可知，與空白組相比，模型組炎癥因子水平顯著升高(P＜0.01)。與模型組相比，給藥組IFN-γ、IL-5、IL-13水平呈不同水平的降低(P＜0.05或P＜0.01)。

表3 各組氣道炎癥因子及血清IgE檢測(cè)結(jié)果比較 (±s)

表3 各組氣道炎癥因子及血清IgE檢測(cè)結(jié)果比較 (±s)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

指標(biāo)IFN-γ(ng/ml)IL-4(pg/ml)IL-5(pg/ml)IL-13(pg/ml)TNF-α(ng/ml)IgE(ng/ml)地塞米松組0.724±0.164**60.358±5.656**61.505±4.027**38.795±4.687**0.897±0.076**136.522±18.707**空白組0.795±0.163**54.483±7.774**41.548±5.491**22.023±4.950**1.253±0.164**88.044±12.242**模型組1.329±0.138 75.545±8.845 90.495±11.951 57.573±11.024 1.825±0.183 262.610±35.462補(bǔ)腎平喘方低劑量組1.134±0.120*67.098±7.307 76.630±6.792*44.428±3.392*1.600±0.164*210.455±27.935*補(bǔ)腎平喘方高劑量組1.032±0.118**63.940±6.959*70.775±8.241**45.753±1.441*1.464±0.148 181.81±21.213**

2.4 各組血液中IgE水平：見表3。與空白組相比，模型組血液中IgE水平顯著升高(P＜0.01)。與模型組相比，各給藥組IgE水平顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。

2.5 HE、AB-PAS染色：見圖1。由圖1a可知，空白組肺組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；而模型組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。中、高劑量補(bǔ)腎平喘方處理后，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組顯著減少。由圖1b可知，空白組支氣管、肺組織結(jié)構(gòu)清晰；而模型組黏液分泌明顯增多，支氣管杯狀細(xì)胞增生。中、高劑量補(bǔ)腎平喘方處理后，黏液分泌、杯狀細(xì)胞增生受到抑制。

圖1 a：HE染色(×200,400)；b：AB-PAS染色(×200,400)。

2.6 Western blot檢測(cè)：見圖2。與空白組相比，模型組p-NF-κBp65/NF-κBp65、p-IκBα/IκBα與 TLR4表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01)，F(xiàn)oxp3表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)。與模型組相比，給藥處理可降低p-NF-κBp65/NF-κBp65、p-IκBα/IκBα與TLR4表達(dá)，提高Foxp3表達(dá)。

圖2 肺組織中相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

哮喘在中醫(yī)學(xué)中屬“哮癥”“喘癥”等范疇，病性本虛標(biāo)實(shí)，與脾、肺、腎三臟虧虛有關(guān)，肺腎氣虛，宿痰伏于肺為其主要病機(jī)，治宜補(bǔ)肺益腎、平喘化痰為要[6]。補(bǔ)腎平喘方為臨床經(jīng)驗(yàn)方，可有效抑制哮喘患兒機(jī)體炎癥反應(yīng)，改善肺功能[4]。是方中，淫羊藿為補(bǔ)命門、益精氣、補(bǔ)腎壯陽(yáng)之要藥；附子回陽(yáng)救逆，補(bǔ)火助陽(yáng)，散寒止痛，為君藥；配以麻黃、桂枝發(fā)汗解表、宣肺平喘、通陽(yáng)降逆，蘇子、紫菀降氣消痰、止咳平喘，可達(dá)祛邪之效，為臣藥；熟地補(bǔ)腎滋陰、益精填髓，為佐藥；甘草為使藥，調(diào)和藥性。方劑配伍切合哮喘病機(jī)，恰為對(duì)癥之良方。且現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，淫羊藿苷可上調(diào)肺組織Nrf2、HO-1表達(dá)，同時(shí)可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，起到平喘的作用[7]；附子可增強(qiáng)免疫力、抗炎鎮(zhèn)痛[8]。

氣道慢性炎癥是哮喘的病理基礎(chǔ)。Th1/Th2失衡在誘導(dǎo)氣道炎癥進(jìn)展中具有至關(guān)重要的作用。IFN-γ由Th1細(xì)胞產(chǎn)生，可激活巨噬細(xì)胞；IL-4、IL-5、IL-13由Th2細(xì)胞分泌，可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生和募集，且能促進(jìn)IgE生成，在哮喘中起著重要作用[9]。此外，研究證實(shí)，在哮喘中，TLR4可調(diào)控TNF-α等炎性因子水平表達(dá)，NF-κB作為TLR4的下游靶點(diǎn)，其活化也可起到加重炎癥反應(yīng)的作用[10]。本研究中，補(bǔ)腎平喘方除了可以顯著降低氣道阻力，減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)外，還可顯著降低IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α及IgE水平，下調(diào)哮喘小鼠肺組織中p-NF-κBp65、p-Iκ-Bα與TLR4蛋白表達(dá)，上調(diào)Foxp3蛋白表達(dá)。說(shuō)明補(bǔ)腎平喘方可調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡并介導(dǎo)TLR4/NF-κB信號(hào)，減輕氣道炎癥反應(yīng)，發(fā)揮防治哮喘的作用。

綜上所述，補(bǔ)腎平喘方可有效改善過敏性哮喘小鼠氣道炎癥，發(fā)揮平喘作用。