湯亞蘭，唐方祥，陸茜林，張若蘭，劉 康，岳秋菊，徐 凡，胡輝權(quán)，李 均

[川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院(南充市中心醫(yī)院) a.婦產(chǎn)科;b.組織工程與干細(xì)胞研究所，南充 637000]

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均較高[1]。近年來，卵巢癌的規(guī)范化治療和全程管理逐漸被重視，其治療取得了巨大進(jìn)步。然而，早期癥狀隱匿、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是卵巢癌臨床治療失敗的主要原因，也是導(dǎo)致患者死亡的關(guān)鍵因素[2]。因此，尋找卵巢癌生物學(xué)功能相關(guān)基因，探討卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制，以提高卵巢癌診斷率、降低患者死亡率，顯得尤為重要。長基因間非編碼RNA 1088(LINC01088)是長鏈非編碼RNA的1種，位于染色體4q21.21，全長1.0kb。近期研究表明[3]，LINC01088能促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖，但LINC01088在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制仍不明確。本研究擬探討LINC01088對卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影響，以明確LINC01088在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮的作用，為卵巢癌發(fā)病提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、CAOV3和人正常卵巢細(xì)胞ISEO80均購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。LINC01088引物及U6內(nèi)參引物由成都擎科生物科技有限公司合成。LINC01088引物：正向5'-CCTGGCTATCCTGGAGTTTTC-3'，反向：5'-TCATATCAGGGACAGGGCTTA-3';U6內(nèi)參：正向5'-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3'，反向5'-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3'。LINC01088過表達(dá)質(zhì)粒及空載質(zhì)粒構(gòu)建、慢病毒載體(GV367載體、AgeI/NheI酶切)包裝、濃縮、純化、滴度檢測及重組病毒上清液的收集均由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成。E-cadherin抗體、Vimentin抗體、Akt抗體、PI3K抗體、p-Akt 473抗體、p-PI3K抗體及GAPDH內(nèi)參均購自杭州華安生物技術(shù)有限公司。TRIzol Reagent購自美國Ambion公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及2×SYBR Green qPCR Mix試劑盒均購自美國Thermo公司。CCK-8試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時定量PCR法檢測LINC01088 mRNA表達(dá)水平 收集對數(shù)生長期SKOV3、CAOV3、ISEO80細(xì)胞，參照Trizol說明書提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，檢測3株細(xì)胞中LINC01088 mRNA的表達(dá)量。所有反應(yīng)均設(shè)有3個復(fù)孔，采用SYBR Green嵌合熒光方法在熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)上擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因。用2-ΔΔCt法計(jì)算LINC01088 mRNA相對表達(dá)量。

1.2.2 細(xì)胞感染及感染效率的檢測 將對數(shù)生長期SKOV3細(xì)胞按3×105細(xì)胞/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24h，待細(xì)胞融合至50%左右時，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，MOI=10分別加入病毒上清液，感染細(xì)胞8h后換液，48h后熒光顯微鏡觀察感染效率，待感染效率達(dá)80%時，用嘌呤霉素篩選感染成功的SKOV3細(xì)胞并獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株用于后續(xù)試驗(yàn)。通過qRT-PCR法鑒定慢病毒過表達(dá)效果。穩(wěn)定感染LV-LINC01088的SKOV3細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組(LV-LINC01088組)，感染攜帶無意義序列空載慢病毒的SKOV3細(xì)胞作為陰性對照組(LV-NC組)，同時將未感染的SKOV3細(xì)胞設(shè)為空白對照組(Control組)。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力 取上述3組SKOV3細(xì)胞，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104細(xì)胞/ml，按100μL/孔接種于96孔板，每組均設(shè)置5個復(fù)孔，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)1、2、3、4、5d時加CCK-8法檢測試劑,10μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)1h，設(shè)置酶標(biāo)儀于波長450nm處檢測各孔OD值，并繪制細(xì)胞生長曲線，OD值越大表示活細(xì)胞數(shù)越多，細(xì)胞增殖越快。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 在6孔板底部外側(cè)均勻劃標(biāo)記線(寬0.5mm)，取上述3組SKOV3細(xì)胞，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105細(xì)胞/mL，按2mL/孔接種于6孔板，接種24h后用無菌的200μL移液槍槍頭垂直在6孔板底部劃線，劃痕與標(biāo)記線垂直，盡量保證每個劃痕寬度一致。無菌PBS洗去懸浮細(xì)胞，顯微鏡觀察并拍照。吸去PBS并加含2%胎牛血清的MyCoy's 5A培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，顯微鏡觀察細(xì)胞遷移情況并拍照，測量遷移距離，計(jì)算遷移率，遷移率(%)=遷移距離/劃痕距離×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn) 取Transwell小室置于24孔板，將上述3組SKOV3細(xì)胞，胰蛋白酶消化，PBS洗2遍，用無血清的MyCoy's 5A培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105細(xì)胞/mL。遷移試驗(yàn)：取上述重懸細(xì)胞，上室加200μL細(xì)胞懸液，下室加500μL含15%胎牛血清的MyCoy's 5A培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h，取出小室，棉簽擦拭上室細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20min，0.4%結(jié)晶紫染色15min，顯微鏡下隨機(jī)取5個視野計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)目并取平均值。侵襲試驗(yàn)：將基質(zhì)膠(matrigel)與無血清MyCoy's 5A培養(yǎng)基按1∶8稀釋后，均勻鋪在Transwell小室底部膜的上室面(70μL)，室溫干燥后待用。上室加上述細(xì)胞懸液100μL，下室內(nèi)加700μL含15%胎牛血清的MyCoy's 5A培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)48h，棄小室內(nèi)液體，后續(xù)操作同遷移試驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平 分別提取3組細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白濃度測試盒測定并將樣品調(diào)定至統(tǒng)一濃度，加蛋白上樣緩沖液，沸水煮5min使蛋白變性，分裝-80℃保存。取12μg總蛋白通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1h，分別加入用快速抗體稀釋液稀釋的特異性一抗:E-Cadherin、Vimentin，Akt、PI3K、p-Akt 473、p-PI3K、GAPDH，4℃過夜。次日，用PBST洗滌4次，2.5%脫脂奶粉封閉1h孵育，用PBST再次洗滌4次，電化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，經(jīng)曝光、顯影、定影后照相，以GAPDH為內(nèi)參，觀察各組EMT相關(guān)蛋白及PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 LINC01088在卵巢癌SKOV3細(xì)胞中表達(dá)下調(diào) qRT-PCR結(jié)果顯示，卵巢癌細(xì)胞SKOV3和CAOV3中LINC01088 mRNA表達(dá)量分別是1.02±0.48和1.82±0.12，正常卵巢細(xì)胞ISEO80中LINC01088 mRNA表達(dá)量是4.66±1.97。相比正常卵巢細(xì)胞，SKOV3細(xì)胞中LINC01088 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.234，P<0.001)，故選擇SKOV3細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 慢病毒過表達(dá)LINC01088對SKOV3細(xì)胞的感染效率 空白對照組和陰性對照組SKOV3細(xì)胞中LINC01088 mRNA相對表達(dá)量分別為1.00±0.12和1.01±0.19，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組SKOV3細(xì)胞中LINC01088 mRNA相對表達(dá)量26.64±2.89，明顯高于陰性對照組(1.01±0.19)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=22.27，P<0.05)，提示攜帶LINC01088序列的重組慢病毒感染SKOV3細(xì)胞成功。

2.3 LINC01088對SKOV3細(xì)胞增殖的影響 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，3組細(xì)胞的OD值均逐漸升高，與空白對照組和陰性對照組相比，實(shí)驗(yàn)組2～5天OD值均較低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示過表達(dá)LINC01088能抑制SKOV3細(xì)胞的增殖，見圖1。

圖1 過表達(dá)LINC01088對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的影響

2.4 LINC01088對SKOV3細(xì)胞遷移的影響 體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測顯示，劃痕后培養(yǎng)24h，LV-LINC01088組的細(xì)胞遷移率明顯低于LV-NC組和Control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見表1。表明LINC01088能抑制SKOV3細(xì)胞的遷移。

2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)LINC01088對SKOV3細(xì)胞遷移和侵襲的影響 體外Transwell實(shí)驗(yàn)表明,過表達(dá)LINC01088抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的遷移和侵襲，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表1。

表1 過表達(dá)LINC01088對SKOV3細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2.6 LINC01088對SKOV3細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot法結(jié)果顯示，相比LV-NC組和Control組，LV-LINC01088組的E-cadherin表達(dá)升高，Vimentin表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。過表達(dá)LINC01088可抑制SKOV3細(xì)胞的EMT過程。

圖2 過表達(dá)LINC01088對SKOV3細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)的影響

2.7 LINC01088對SKOV3細(xì)胞PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 3組細(xì)胞PI3K和Akt蛋白的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，LV-LINC01088組p-PI3K和p-Akt 473蛋白的表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SKOV3細(xì)胞中，過表達(dá)LINC01088可抑制PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化。見圖3。

3 討 論

據(jù)全球癌癥數(shù)據(jù)顯示[4]，2018年全球新增29.5萬例卵巢癌病例，18.5萬例婦女死于卵巢癌。手術(shù)聯(lián)合化療仍是目前卵巢癌主要的治療方式，盡管靶向和生物藥物治療給卵巢癌患者帶來了新的希望，但目前尚無證據(jù)表明卵巢癌是可以被治愈的。卵巢癌的發(fā)生發(fā)展與基因表達(dá)和腫瘤相關(guān)信號通路的異常密切相關(guān)。因此，人們嘗試從以上兩方面探索卵巢癌的病因，并尋找其治療的新靶點(diǎn)。

RNA是“中心法則”最重要的中間體[5]，在人龐大的基因組中，大多數(shù)RNA被轉(zhuǎn)錄并呈現(xiàn)出一種發(fā)育樣式的調(diào)節(jié)。新近研究發(fā)現(xiàn)[6]，人類轉(zhuǎn)錄組中存在大量反義、重疊的非編碼RNA，其執(zhí)行的功能遠(yuǎn)比蛋白編碼基因及它們的剪切變體復(fù)雜，可能在細(xì)胞的發(fā)育和代謝中發(fā)揮重要作用[7]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是非編碼RNA的一種，其長度大于200nt，不參與編碼蛋白[8]，既往認(rèn)為其是轉(zhuǎn)錄的“噪音”，然而隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)lncRNA具有基因組印記、轉(zhuǎn)錄組調(diào)控等一系列生物學(xué)功能，這些功能的破壞或失調(diào)在腫瘤的發(fā)生中起到了關(guān)鍵的作用。Ai等[9]研究發(fā)現(xiàn)，LINC01088在卵巢癌組織中表達(dá)下調(diào)，其高表達(dá)患者的預(yù)后較好，是卵巢癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，LINC01088在良性卵巢腫瘤中表達(dá)下調(diào)，可能通過LINC01088/miR-24-1-5p/PAK4軸抑制卵巢上皮細(xì)胞腫瘤的發(fā)生。由此推測LINC01088在卵巢癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用，通過qRT-PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)LINC01088在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)LINC01088后，SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲明顯受到抑制，這與既往研究結(jié)果一致。然而，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的具體作用機(jī)制仍不清楚，需進(jìn)一步探索。

EMT是指上皮來源細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下向間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的一種現(xiàn)象，EMT現(xiàn)象與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在眾多腫瘤(包括卵巢癌)的原位浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[11]。EMT整個過程包括細(xì)胞形態(tài)和基因型兩方面的改變，表現(xiàn)為細(xì)胞黏附分子(如E-cadherin)表達(dá)減少，失去細(xì)胞間相互作用；上皮細(xì)胞外形演變?yōu)樗笮伍g質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞角蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；獲得了某些間質(zhì)細(xì)胞特性，如Vimentin等間質(zhì)特性蛋白表達(dá)上調(diào)[12]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)LINC01088后SKOV3細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高，而Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明SKOV3細(xì)胞EMT過程受到抑制，這可能是導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移和侵襲受到抑制的原因。

PI3K/Akt是調(diào)控EMT的關(guān)鍵信號通路之一，活化的Akt具有多種生物學(xué)活性，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、增殖、轉(zhuǎn)移及誘導(dǎo)EMT[13]。過表達(dá)LINC01088后，SKOV3細(xì)胞的EMT過程受到抑制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白p-Akt473、p-PI3K表達(dá)降低，可見PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受到抑制，其可能是LINC01088抑制SKOV3細(xì)胞EMT過程的關(guān)鍵因素。LINC01088可能通過使PIP3脫磷酸化為PIP2而成為PI3K/Akt信號通路的主要負(fù)性調(diào)節(jié)因子之一。現(xiàn)已證實(shí)，過表達(dá)LINC01088抑制PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化，從而抑制SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT?？梢奓INC01088/PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的失調(diào)與卵巢癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及EMT過程密切相關(guān)。但是LINC01088/PI3K/Akt通路的機(jī)制是復(fù)雜的，需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究從體外實(shí)驗(yàn)角度，提示過表達(dá)LINC01088通過阻斷PI3K/Akt信號通路下調(diào)了EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，能抑制SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，相關(guān)研究可進(jìn)一步在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)荷瘤裸鼠模型和人樣本組織病理學(xué)驗(yàn)證，LINC01088有望成為卵巢癌治療的新靶點(diǎn)。