孫 翟，張秋菊，張箴波

(1.上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 201620；2.上海市寶山區(qū)吳淞中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 201900)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer,EC)是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一種上皮性惡性腫瘤,是世界上尤其是發(fā)達國家最常見的女性生殖道腫瘤[1-2]。近年來隨著生活方式的改變，我國EC的發(fā)病率逐漸升高且呈年輕化趨勢，保留生育功能的保守治療日益得到重視，尤其對于年輕的I型EC或增生性病變患者，大劑量孕激素保守治療已成為主要治療方法之一[3]。但臨床研究顯示，大劑量孕激素治療對早期EC或癌前病變患者的有效率僅為70%左右[4]，仍有相當一部分分化良好的早期EC患者產(chǎn)生孕激素抵抗，保守治療失敗。因此，判斷EC患者對孕激素治療的敏感性并探索有效緩解孕激素抵抗或增敏孕激素治療的方法，對于EC和癌前病變患者有著重要意義。

類器官(Organoid)是利用3D培養(yǎng)技術(shù)，將來源于人類或動物組織的具有干細胞潛能的細胞包被于人工基質(zhì)膠中進行培養(yǎng)，形成與來源器官組織結(jié)構(gòu)相似的培養(yǎng)物。類器官具有相對穩(wěn)定的表型及遺傳學特征。對于癌癥研究來說，與傳統(tǒng)的細胞系和人源異種移植瘤模型(patient-derived xenografts，PDX)相比，腫瘤類器官因與來源組織差異小,能在體外更好地模擬體內(nèi)疾病過程，可作為臨床前疾病研究模型而引起廣泛關注，成為近年來的研究熱點。此外，類器官可從患者來源的健康或腫瘤組織中培養(yǎng)獲得并高效生長，從而有可能實現(xiàn)針對患者個體的藥物敏感性檢測和個性化治療方案研發(fā)[5]。本研究旨在建立正常子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜癌類器官的培養(yǎng)體系，并利用子宮內(nèi)膜癌類器官模型初步探究增強內(nèi)膜癌對孕激素治療敏感性的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人正常子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜癌組織 選取2020年4～9月于上海市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科行宮腔鏡檢查或內(nèi)膜癌根治手術(shù)患者的新鮮正常子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜癌腫瘤組織樣本共7例,其中正常子宮內(nèi)膜標本4例，內(nèi)膜癌標本3例。用于后續(xù)成功建立子宮內(nèi)膜癌類器官培養(yǎng)體系的患者樣本，經(jīng)臨床病理診斷確診為子宮內(nèi)膜腺癌。本研究已獲得上海市第一人民醫(yī)院倫理委員會審批。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12谷氨酰胺培養(yǎng)基、IV型膠原酶、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素溶液(美國Thermo公司)，B27添加劑、N2添加劑(美國Life Technologies公司)、Primocin(美國Invivogen公司)、N-乙酰-L-半胱氨酸、A83-01、煙酰胺、重組人EGF、重組人Noggin、重組人FGF-10、重組人HGF、重組人Rspondin-1等細胞因子(美國Peprotech公司)，Matrigel基質(zhì)膠、細胞回收溶液(美國Corning公司)。醋酸甲羥孕酮(MPA)和鴉膽子苦醇(Brusatol)購自Sigma-Aldrich公司，AKR1C1抗體(美國Abcam公司)，HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(美國Cell Signaling Technology公司)，DAB免疫組化顯色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 儀器及設備 恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，CKX-41型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，正置熒光顯微鏡(德國萊卡公司)，組織脫水儀,石蠟包埋機,切片機(德國萊卡公司),不銹鋼染色架,玻璃染色缸,免疫組化濕盒等。

1.2 方法

1.2.1 正常子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜癌類器官培養(yǎng)基配制 根據(jù)Margherita等[6]的相關研究，類器官培養(yǎng)基配方如下:DMEM/F12谷氨酰胺培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，分別加B27添加劑(1×)、N2添加劑(1×)、Primocin 100μg/mL、N-乙酰-L-半胱氨酸1.25mmol/L、A83-01 500nmol/L、煙酰胺10nmol/L、重組人EGF 50ng/mL、重組人Noggin 100ng/mL、重組人FGF-10 100ng/mL、重組人HGF 50ng/mL、重組人Rspondin-1500ng/mL，再加入雙抗。

1.2.2 子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜癌組織的取樣、消化和類器官培養(yǎng) 手術(shù)取下的正常子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜癌組織立即置于無菌冰PBS溶液，盡快進行后續(xù)處理。超凈臺內(nèi)將組織用PBS洗滌數(shù)次，用眼科剪將組織剪碎成約0.5mm3小塊，加預先配制好的消化液(IV型膠原酶+無血清培養(yǎng)基，膠原酶濃度為2mg/mL)，置37℃培養(yǎng)箱消化1～2h，期間晃動數(shù)次。消化至組織經(jīng)槍頭吹打后呈黏稠絮狀，加大量培養(yǎng)基終止消化。1000r/min離心3min,棄上清，加3～5倍組織體積的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解5min，離心后棄紅色上清，得到白色組織沉淀。取出預先配制好的類器官培養(yǎng)基及Matrigel基質(zhì)膠，在冰上將兩者按2∶1的體積比混勻，根據(jù)所得沉淀量，加適量培養(yǎng)基Matrigel混懸液，充分吹打混勻，以50μL/滴接種于24孔板孔中央，每孔1滴。將24孔板置于37℃培養(yǎng)箱30min，待液滴充分凝固，每孔加500μL類器官培養(yǎng)基覆蓋液滴，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔2～3d換液，間隔1～2周視類器官生長情況傳代。顯微鏡下觀察和拍照記錄類器官生長情況和形態(tài)。

1.2.3 子宮內(nèi)膜癌類器官的傳代、凍存及復蘇 傳代：在不去除舊培養(yǎng)基的情況下，使用移液槍對孔板每個孔進行吹打，使含有類器官的膠滴分散懸浮在培養(yǎng)基中，收集培養(yǎng)基于離心管。1500r/min離心5min，棄上清，加約200μL培養(yǎng)基，用小口徑移液槍反復吹打300次，以分解類器官和基質(zhì)膠，加1mL培養(yǎng)基1500r/min離心5min，去除上清液及基質(zhì)膠。將離心管置于冰上，加新配置的培養(yǎng)基Matrigel混懸液，吹打使類器官沉淀充分混勻，按上述步驟鋪入新的24孔板，37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。凍存：從孔中吸出原培養(yǎng)基，替換為250μL細胞回收溶液(Cell Recovery Solution)，并將板置于冰上60min。將類器官吹打并吸入離心管，1500r/min離心5min沉淀類器官，棄上清，加200μL培養(yǎng)基，用小口徑移液槍反復吹打100次，再加1mL培養(yǎng)基，1500r/min離心5min，棄上清及基質(zhì)膠。加商品化無血清細胞凍存液，輕輕吹打混合，轉(zhuǎn)移到凍存管，進行標記，-80℃過夜，轉(zhuǎn)移至液氮中長期保存。復蘇：從液氮中取出凍存管，迅速放入37℃水浴鍋使其融化，轉(zhuǎn)移至離心管，加適量類器官培養(yǎng)基，1500r/min離心5min，棄上清，置于冰上，加新配置的培養(yǎng)基Matrigel混懸液，吹打混勻，按上述步驟鋪入新的24孔板，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.4 子宮內(nèi)膜癌類器官的藥物處理 藥物工作濃度：醋酸甲羥孕酮(MPA)20μmol/L、Brusatol 10nmol/L,藥物均用二甲基亞砜(DMSO)進行溶解，對照組加同等體積DMSO。類器官加藥處理3d后，收樣進行后續(xù)檢測。

1.2.5 子宮內(nèi)膜癌類器官石蠟切片的制備 吸出孔板中原培養(yǎng)液，加1mL 4%多聚甲醛固定液，使用1mL槍頭輕柔地重懸類器官和基質(zhì)膠，將混合物轉(zhuǎn)移至EP管中輕輕混合，放在冰上孵育至少1h。4℃，1500r/min，離心5min，吸出固定液和基質(zhì)膠(如殘留機制膠過多，也可加Cell recovery medium，冰上孵育15～30min)。使用冷的4%多聚甲醛固定液重懸類器官，4℃孵育過夜。準備模具：準備1條8-strip PCR管，剪掉管的下半部分，得到一個圓環(huán)作為模具。將模具放到培養(yǎng)皿中，使其與底部平齊，然后放在冰上。使用無菌PBS配制3%低融點的瓊脂糖，微波爐加熱至完全融化。將過夜固定的類器官離心，吸盡上清液體，趁瓊脂糖溶液還保持溫熱的液體狀態(tài)時，使用200μL槍頭，剪掉槍頭尾部，吸取75μL的瓊脂糖液體輕柔地重懸類器官，立即將重懸后的類器官和瓊脂糖液體轉(zhuǎn)移入冰上放置的PCR管模具中，瓊脂糖會立即固化。整個過程盡量快速，避免瓊脂糖在槍頭中固化，避免引入氣泡。在倒置顯微鏡檢查確認瓊脂糖包埋的類器官的數(shù)量、質(zhì)量和位置。4℃放置1h以上，確保瓊脂糖固化完成。從模具中取出，轉(zhuǎn)移到組織包埋盒，將經(jīng)瓊脂包埋的類器官樣本進行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，進行后續(xù)HE染色及顯微鏡下觀察。

1.2.6 免疫組化 按免疫組化試劑盒說明書嚴格操作，AKR1C1單克隆抗體工作濃度為1∶250，每批染色均設立陰性對照(5%BSA抗體稀釋液代替一抗)。所有切片采用盲法由2人進行獨立判定。鏡下觀察，在顯微鏡下隨機選擇3個低倍視野(×100)，根據(jù)細胞染色棕黃色由深至淺分為強陽性、陽性、弱陽性、陰性對應分值為3、2、1、0分，根據(jù)染色細胞比例分為75%～100%、50%～75%、25%～50%、0～25%，對應分值為4、3、2、1分。兩者分值相乘即為切片的免疫組化評分。

2 結(jié) 果

2.1 子宮內(nèi)膜癌類器官模型的建立 臨床收取的新鮮子宮內(nèi)膜癌腫瘤組織以Matrigel基質(zhì)膠作為生長支架，在含有多種添加劑和細胞因子的類器官培養(yǎng)基作用下，能持續(xù)生長且進行傳代、凍存和復蘇，長期培養(yǎng)時間可超過45天。原始患者組織培養(yǎng)1～2周后，鏡下可見較小的類圓形球狀細胞團，隨著培養(yǎng)時間延長，類器官大量生長、融合，呈現(xiàn)大小不一、不規(guī)則、實心致密的三維細胞團塊，透光性變差，少數(shù)類器官有類腔管狀結(jié)構(gòu)(圖1)。

圖1 子宮內(nèi)膜癌類器官生長情況(光鏡下50×)

2.2 正常子宮內(nèi)膜類器官和子宮內(nèi)膜癌類器官的形態(tài)對比 為了進一步驗證該類器官培養(yǎng)體系的有效性，選取人正常子宮內(nèi)膜組織按照相同方法進行類器官培養(yǎng)。在基質(zhì)膠中生長的正常子宮內(nèi)膜類器官光鏡下呈現(xiàn)規(guī)則光滑的中空圓環(huán)或橢圓環(huán)狀，可見明顯的腺腔結(jié)構(gòu)，腔體大且規(guī)則(圖2A、B)，形態(tài)與光鏡下的子宮內(nèi)膜癌類器官形成鮮明對比(圖2E、F)。對兩種類器官組織進行HE染色，發(fā)現(xiàn)正常子宮內(nèi)膜類器官組織學結(jié)構(gòu)呈單層柱狀上皮，腺體結(jié)構(gòu)簡單，腺腔清晰飽滿，細胞核均一(圖2C、D)。而子宮內(nèi)膜癌類器官呈團塊狀，細胞排列紊亂，腺體結(jié)構(gòu)復雜，腺腔結(jié)構(gòu)基本消失，部分呈篩狀或相互融合，細胞核有異型性，與子宮內(nèi)膜癌病理學特征一致(圖2G、H)?；趯σ陨蟽煞N類器官的形態(tài)學和組織結(jié)構(gòu)分析，可認為我們已經(jīng)建立起正常子宮內(nèi)膜及內(nèi)膜癌類器官的培養(yǎng)體系，并利用該模型進行后續(xù)相關研究。

圖2 正常子宮內(nèi)膜類器官及子宮內(nèi)膜癌類器官形態(tài)學觀察

2.3 在類器官模型中Brusatol增強子宮內(nèi)膜癌對孕激素的敏感性 同批子宮內(nèi)膜癌類器官根據(jù)不同的藥物處理分為對照組、MPA組、Brusatol組和MPA+Brusatol組，加藥處理4d后，相較于對照組，MPA組內(nèi)膜癌類器官生長數(shù)量和大小無明顯差異(圖3A、B)，即該內(nèi)膜癌類器官對孕激素不敏感，而Brusatol組及MPA+Brusatol組類器官較對照組生長體積明顯減小且數(shù)量減少。相較Brusatol組，MPA+Brusatol聯(lián)合用藥對內(nèi)膜癌類器官的生長抑制作用更為顯著(圖3C、D)，提示Brusatol增強了孕激素對子宮內(nèi)膜癌類器官的抑制作用。取鏡下多個視野，統(tǒng)計長徑大于200μm的類器官數(shù)，發(fā)現(xiàn)相較對照組，MPA組類器官數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義，Brusatol組及MPA+Brusatol組類器官數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MPA+Brusatol組與Brusatol組相比，內(nèi)膜癌類器官數(shù)減少且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3E)。表明Brusatol能抑制子宮內(nèi)膜癌類器官生長，且能增強子宮內(nèi)膜癌類器官對孕激素的敏感性。

圖3 子宮內(nèi)膜癌類器官MPA及Brusatol處理后生長情況

2.4 藥物處理后子宮內(nèi)膜癌類器官形態(tài)學特征分析 MPA組相較于對照組，類器官無明顯組織結(jié)構(gòu)差異(圖4A、B)，兩者均呈現(xiàn)雜亂、實心細胞團塊，與原始內(nèi)膜癌類器官組織結(jié)構(gòu)相似。Brusatol組和MPA+Brusatol組細胞排列相對更規(guī)則有序，部分類器官出現(xiàn)了類似正常子宮內(nèi)膜類器官中的較大腺腔樣結(jié)構(gòu)(圖4C、D)。表明經(jīng)MPA和Brusatol聯(lián)合處理后，子宮內(nèi)膜癌類器官不僅生長受到抑制，部分內(nèi)膜癌組織形態(tài)上有向正常子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化的趨勢。

圖4 子宮內(nèi)膜癌類器官MPA及Brusatol處理后形態(tài)學觀察

2.5 藥物處理后子宮內(nèi)膜癌類器官AKR1C1表達的檢測 對照組及MPA組AKR1C1染色呈強陽性，經(jīng)Brusatol及MPA+Brusatol聯(lián)合用藥處理后，內(nèi)膜癌類器官AKR1C1染色陽性強度依次遞減，MPA+Brusatol聯(lián)合用藥組部分細胞呈AKR1C1染色陰性(圖5A-D)。經(jīng)免疫組化評分和統(tǒng)計學分析顯示，相較對照組，Brusatol組和MPA+Brusatol組內(nèi)膜癌類器官AKR1C1蛋白水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義。MPA+Brusatol組AKR1C1蛋白水平低于Brusatol組，差異有統(tǒng)計學意義。表明在對孕激素不敏感的內(nèi)膜癌類器官中，AKR1C1蛋白水平較高，Brusatol通過降低內(nèi)膜癌類器官的AKR1C1水平，增強內(nèi)膜癌對孕激素的敏感性，提升孕激素對內(nèi)膜癌的治療效果。

圖5 子宮內(nèi)膜癌類器官MPA及Brusatol處理后AKR1C1水平

3 討 論

臨床治療子宮內(nèi)膜癌的方式通常為手術(shù)及術(shù)后輔助治療，然而近年來內(nèi)膜癌患者呈現(xiàn)年輕化趨勢，年輕患者有強烈保留生育能力的意愿。目前最佳的子宮內(nèi)膜癌保守治療策略是大劑量的孕激素治療，而對孕激素的敏感性及是否產(chǎn)生耐藥是影響最終治療效果的關鍵因素。目前，子宮內(nèi)膜癌對孕激素敏感性的相關研究多以細胞系或腫瘤異種移植瘤(PDX)為模型。兩者均存在一定局限性，細胞系通常不能有效還原原始個體腫瘤的遺傳異質(zhì)性和體內(nèi)腫瘤生長的生物學特性，PDX植入效率有限，實驗研究耗時耗能且可能出現(xiàn)小鼠特異性腫瘤進化，因而許多在癌癥模型中表現(xiàn)良好的藥物最終止步于臨床試驗[5]。類器官最大的優(yōu)勢是重現(xiàn)患者原發(fā)腫瘤的生理學和遺傳異質(zhì)性特征，同時可實現(xiàn)高效率藥篩，有效預測藥物療效并尋求個體化療法。子宮內(nèi)膜癌類器官的研究近幾年才起步，有研究報道使用子宮內(nèi)膜癌患者衍生的類器官培養(yǎng)物進行藥敏試驗是可行的[7]?；诒菊n題組前期對內(nèi)膜孕激素耐藥相關機制的研究，本研究建立了子宮內(nèi)膜癌類器官培養(yǎng)體系和包括孕激素在內(nèi)的多種藥物篩選模型，可在判斷孕激素抵抗和尋找孕激素增敏劑方面給患者制定個性化的精準治療策略。由于本研究中用于類器官培養(yǎng)的內(nèi)膜癌組織樣本均為手術(shù)中采集，患者未行大劑量孕激素治療，因此類器官對藥物反應與患者實際臨床藥物療效間的一致性仍有待驗證。此外，未來若進行大規(guī)模藥篩，類器官培養(yǎng)方法和效率仍需進一步改善和優(yōu)化，以提高其用于藥物篩選的效率和可行性[8]。本研究中使用的子宮內(nèi)膜癌類器官仍然不具備體內(nèi)腫瘤的血管系統(tǒng)和免疫環(huán)境，因此，采用類器官模型篩選免疫治療藥物仍存在一定的局限性。

子宮內(nèi)膜增生和子宮內(nèi)膜癌治療中孕激素抵抗與轉(zhuǎn)錄因子Nrf2密切相關，Nrf2高表達促進孕激素耐藥的發(fā)生，而下調(diào)Nrf2可增加子宮內(nèi)膜癌對孕激素的反應性[9]。鑒于Nrf2是子宮內(nèi)膜增生及子宮內(nèi)膜癌中孕激素治療抵抗的關鍵因素，靶向Nrf2是緩解孕激素抵抗、增加孕激素治療敏感性的有效治療策略。

Brusatol作為特異性的Nrf2抑制劑，可通過下調(diào)Nrf2表達逆轉(zhuǎn)內(nèi)膜癌孕激素抵抗和化療耐藥[9-10]。本研究在類器官水平中驗證了這一作用，Brusatol可抑制子宮內(nèi)膜癌類器官的增殖和生長，且對于單獨使用MPA耐藥的內(nèi)膜癌類器官，Busatol與MPA聯(lián)合用藥后，子宮內(nèi)膜癌類器官生長和增殖相較單用Brusatol的抑制效果更為明顯，這提示Brusatol能增加子宮內(nèi)膜癌對孕激素治療的敏感性，緩解耐藥。

AKR1C1由于在其啟動子區(qū)域中存在多個抗氧化反應元件(ARE)而被認為是Nrf2的靶基因[11]。此外，在功能上AKR1C1催化孕酮代謝為無活性的20α-羥孕酮(20-α-hydoxy progesterone，20-α-OHP)[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，AKR1C1表達增加與子宮內(nèi)膜癌的病理進展有關，由于AKR1C1使孕酮失活，因此其在患病子宮內(nèi)膜中的高表達導致孕酮的保護作用減弱，進而促進內(nèi)膜癌進展[14-15]。因此推測，AKR1C1高表達可能與子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥密切相關，而Brusatol可能通過調(diào)控AKR1C1水平緩解子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥。本研究在類器官水平也證實了這一點，在對MPA治療耐藥的內(nèi)膜類器官切片中，AKR1C1呈現(xiàn)高表達，Brusatol與MPA聯(lián)合用藥后，內(nèi)膜癌類器官生長受到抑制且AKR1C1表達水平降低。并且在聯(lián)合用藥后形態(tài)上向正常內(nèi)膜轉(zhuǎn)化的部分類器官組織中，AKR1C1表達呈現(xiàn)陰性。此外，由于類器官培養(yǎng)數(shù)量和技術(shù)條件的限制，對于探究Brusatol增強內(nèi)膜癌對孕激素敏感性的分子機制，包括Nrf2在Brusatol降低AKR1C1蛋白水平中的具體作用，均有待于后續(xù)利用內(nèi)膜癌細胞系進行更深入的研究。

綜上所述，子宮內(nèi)膜癌類器官相比其他體外模型，有助于準確和高效地個體化判別子宮內(nèi)膜增生或子宮內(nèi)膜癌對孕激素治療的敏感性，并篩選出有效的靶向藥物。本研究建立了正常子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜癌類器官模型，彌補了細胞系和PDX在腫瘤研究中的部分不足之處。并利用內(nèi)膜癌患者來源的類器官模型驗證了Brusatol通過調(diào)節(jié)AKR1C1蛋白水平，進而增強子宮內(nèi)膜癌對孕激素治療的敏感性、緩解孕激素抵抗，為子宮內(nèi)膜增生和內(nèi)膜癌的基礎研究和臨床個體化治療提供了初步支持。