楊天涵，張曉燕，徐建青

(復旦大學附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508)

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2，severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)引起的全球廣泛流行的急性呼吸道傳染病。截至2021年2月25日，SARS-CoV-2已感染全球超過112 200 000人，導致249萬以上的人死亡[1]。部分COVID-19康復者可出現(xiàn)長期疲倦，嗅覺或味覺喪失等后遺癥[2]。

SARS-CoV-2是單股正鏈RNA病毒，屬冠狀病毒科，通過兩種途徑侵染細胞。病毒表面分布著棘突蛋白(Spike，S)，在病毒與宿主細胞靠近時，S蛋白受體結(jié)合區(qū)(receptor binding domains，RBD)與其受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(human angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)結(jié)合，并受到輔助受體NRP1、B族I型清道夫受體SR-B1、硫酸乙酰肝素和酪氨酸蛋白激酶受體AXL等的幫助[3-4]。之后細胞對病毒內(nèi)吞形成囊泡，囊泡內(nèi)部不同的環(huán)境(如較低的pH)和組織蛋白酶cathepsin L的切割促使S蛋白發(fā)生構(gòu)像變化，S蛋白內(nèi)部HR1區(qū)插入宿主細胞膜，S蛋白隨之發(fā)生折疊，HR1與HR2結(jié)構(gòu)域在折疊后互相錨定，促使病毒囊膜與內(nèi)吞泡膜發(fā)生融合，從而將病毒遺傳物質(zhì)釋放至細胞胞質(zhì)中。另外一條入侵機制是S蛋白可以被宿主表達于膜表面的跨膜絲氨酸蛋白酶2(transmembrane protease serine 2，TMPRSS2)切割，直接誘導病毒與宿主細胞膜的融合，釋放病毒遺傳物質(zhì)進入胞質(zhì)[5]。S蛋白作為SARS-CoV-2表面最重要的膜蛋白，成為了疫苗和藥物設(shè)計的核心靶點。

在COVID-19疫情暴發(fā)后，全球多家疫苗生產(chǎn)商加入到新型冠狀病毒疫苗(簡稱新冠疫苗)的研發(fā)中。目前，全球已有102種候選疫苗進入臨床試驗，其中18款已進入III期臨床試驗[6]。新冠疫苗技術(shù)路線包括滅活疫苗、重組亞單位疫苗、病毒載體疫苗和核酸疫苗。其中重組亞單位疫苗包括單純重組蛋白或納米顆粒等不同形式，病毒載體疫苗有腺病毒載體、痘病毒載體、流感病毒載體等，核酸疫苗有DNA疫苗、非復制型mRNA疫苗和復制型mRNA疫苗等。

1 新冠疫苗技術(shù)路線

1.1 滅活疫苗 新冠滅活疫苗是通過對病原體進行培養(yǎng)，收獲，濃縮，滅活，純化等一系列工藝制成的疫苗。具有研發(fā)、生產(chǎn)工藝成熟的優(yōu)勢，且僅需保存于4℃環(huán)境下，對冷鏈運輸要求較低，易于快速并大量分配至不發(fā)達地區(qū)。但其主要工藝中，病毒培養(yǎng)需要分離野毒株，篩選出滴度較高，遺傳性狀穩(wěn)定的毒株，同時需要摸索合適的培養(yǎng)條件，如適應大規(guī)模生產(chǎn)的細胞株、溫度、pH和培養(yǎng)基等，使得滅活疫苗的研發(fā)流程相對復雜。同時篩選，培養(yǎng)滅活疫苗所需病毒需要P3實驗室和相同生物安全等級的生產(chǎn)車間，因此大多數(shù)國家都沒有生產(chǎn)條件。北京科興中維公司、國藥集團中國生物技術(shù)股份有限公司下屬的武漢生物制品研究所和北京生物制品研究所等分別研發(fā)了新冠滅活疫苗。新冠滅活疫苗為SARS-CoV-2全病毒滅活鋁佐劑疫苗，在III期臨床試驗中，兩劑次間隔21 d接種，接種人群為18周歲以上成人。國藥集團北京生物制品研究所研發(fā)的新冠滅活疫苗進展較快，于2020年底獲得國家藥監(jiān)局批準附條件上市。滅活疫苗在II期和III期臨床試驗中都表現(xiàn)出良好的安全性，在III期臨床試驗中表現(xiàn)出了較高的疫苗保護效力，武漢生物制品研究所研發(fā)的新冠滅活疫苗中和抗體陽轉(zhuǎn)率達99.1%，對COVID-19的保護效力為72.5%，于2021年獲批上市[7]。國藥集團生產(chǎn)的新冠滅活疫苗大規(guī)模接種后，總體不良反應發(fā)生率為1.06%，全身不良反應發(fā)生率為0.69%，局部不良反應發(fā)生率為0.37%，顯示出較高的安全性[8]

1.2 病毒載體疫苗 軍事醫(yī)學研究院和康希諾研發(fā)了基于腺病毒血清5型(Ad5)載體的新冠疫苗Ad5-nCoV。利用基因改造過的非復制型Ad5作為載體，插入SARS-CoV-2的S蛋白基因制成的腺病毒載體疫苗。Ad26.COV2.S疫苗采用腺病毒血清26型(Ad26)載體，單劑接種14 d后對中度至重度COVID-19保護率為66.9%，對重癥COVID-19保護率為76.7%，接種28 d后對COVID-19引起的死亡保護率為85.4%[9]。在前期臨床試驗中，發(fā)現(xiàn)單劑次疫苗接種即可激起較強的免疫反應并提供較好的保護，故此疫苗和Ad5-nCoV都僅需接種單劑次。單劑次疫苗較多劑次疫苗優(yōu)勢在于一方面產(chǎn)能相似時可以滿足更多人群的接種需求，同時人群較快產(chǎn)生足夠的免疫力，沒有多劑次之間免疫保護較弱的時期，利于更快地在人群中建立免疫屏障，另一方面減少劑次提高了接種者的順應性，避免多劑次可能的脫落。 此外，一種基于流感載體的新冠疫苗在2020年9月進行了I期臨床試驗注冊。這種流感載體疫苗的構(gòu)建方式曾用于中東呼吸綜合征(MERS)，通過對流感NS1基因的改造減毒，同時插入新冠RBD片段，通過鼻噴的方式進行接種，期待能夠同時誘導人體對SARS-CoV-2和流感病毒的免疫[10]。

AZD1222疫苗采用黑猩猩腺病毒載體，其中一個優(yōu)勢為此血清型在人群中陽性率較低，相應抗載體反應也較低。此疫苗中期分析數(shù)據(jù)顯示，首劑一半劑量，第二劑完整劑量的接種方式疫苗有效率達90%，但兩劑次完整劑量保護率僅62.1%，若將完全劑量的兩劑接種間隔從小于6周延長至12周以上，則保護率從55.1%升高至81.3%。單劑標準劑量疫苗接種后90 d內(nèi)對有癥狀感染保護率為76%，但對無癥狀感染沒有保護[11-12]。無癥狀感染者較有癥狀者傳播能力較低，但仍是病毒傳播鏈中重要部分，顯示單劑AZD1222疫苗不足以抑制SARS-CoV-2在人群中傳播[13]。俄羅斯衛(wèi)星V疫苗同樣采用腺病毒載體，包含編碼全長S蛋白的基因，但首劑使用Ad26載體，第二劑使用Ad5載體，減少首劑接種后抗載體免疫反應對第二劑的影響。以上的腺病毒載體疫苗均已在多個國家上市。

1.3 亞單位疫苗 NVX-CoV2373是由SARS-CoV-2重組三聚體全長S蛋白輔以Matrix-M1佐劑制成，S蛋白由昆蟲細胞表達。ZF2001是一種使用CHO細胞進行生產(chǎn)的重組亞單位新冠疫苗，于2020年11月下旬注冊III期臨床試驗，這種重組亞單位疫苗的有效成分主要是RBD區(qū)形成的二聚體蛋白，于2021年2月在中國上市。另一款新冠疫苗同樣使用RBD重組蛋白作為疫苗主要成分，但采用SF9昆蟲細胞生產(chǎn)，在糖基化水平和種類方面與CHO細胞來源蛋白有較大不同，最終可能導致免疫原性或疫苗保護效果的不同。重組S蛋白三聚體SCB-2019以無佐劑組、CpG/鋁佐劑組和AS03組進行的I期臨床試驗顯示其不良反應發(fā)生率和血清抗體滴度均依次上升，CpG/鋁佐劑組和AS03組都誘導了明顯的Th1偏向T細胞免疫反應[14]。重組蛋白疫苗對運輸，儲藏要求較低，可以在2～8℃條件下保持較長時間。

1.4 核酸疫苗 針對SARS-CoV-2設(shè)計的兩種mRNA疫苗：編碼分泌型三聚體RBD的BNT162b1、編碼全長S的BNT162b2。I期臨床試驗顯示，在不同年齡組中兩種疫苗誘導了相似滴度的中和抗體，但BNT162b2組有更低的不良反應發(fā)生率和全身性不良反應強度，最終采用BNT162b2進行II和III期臨床試驗[15]。此mRNA疫苗已在英國等獲得緊急使用授權(quán)，但這種疫苗需保存在-70℃的環(huán)境下。而mRNA-1273疫苗可以在-20℃的環(huán)境下保存6個月。mRNA-1273更易保存，在疫苗運輸、分配和接種時具有更大的優(yōu)勢。BNT162b2在以色列大規(guī)模接種后表現(xiàn)出很高的保護效果，在兩劑次接種7 d后，對總體感染保護率為95.3%，對無癥狀感染保護率達91.5%，有癥狀感染則達97%[16]。BNT162b2和mRNA-1273均已在北美，歐盟的多個國家上市。 云南沃森、蘇州艾博和軍事醫(yī)學研究院合作的mRNA疫苗于2020年10月剛進入Ib期臨床試驗，進展較慢。目前BioNTech的新冠mRNA疫苗(BNT162b2)在美國已批準緊急使用，合作方復星醫(yī)藥也于2020年11月在國內(nèi)注冊II期臨床試驗。

在上述四條技術(shù)路線中，滅活疫苗工藝路線最為成熟，亞單位形式的疫苗出現(xiàn)也較早，但具體組成在不斷發(fā)展，從蛋白質(zhì)單體到多種納米顆粒形式，并且發(fā)展出了較多佐劑。這兩種疫苗形式通常可以在2～8℃條件下保存數(shù)月，現(xiàn)有疫苗運輸、儲存條件可以滿足其要求，且以液體劑型運輸，減少了配制過程，可以降低污染風險。滅活疫苗可以誘導良好體液免疫，但無法誘導較強的細胞免疫，且免疫反應偏向Th2型，含有特定佐劑的重組亞單位疫苗可以誘導Th1/Th2平衡的免疫反應[17]。滅活疫苗采用的鋁佐劑已有將近百年的應用歷史，具有很高的安全性，可以有效增強體液免疫，刺激白細胞介素4(IL-4)產(chǎn)生，促使免疫反應偏向Th2型[18]。ZF2001在鋁佐劑基礎(chǔ)上增加了CpG佐劑，CpG是一種Toll樣受體9(TLR9)配體，可以有效提高細胞免疫強度并誘導免疫反應偏向Th1型[19]。ISCOMATRIX佐劑之前在流感疫苗臨床試驗中表現(xiàn)出較好效果，其由皂角苷，膽固醇及磷脂組成，通過多種方式促進抗原呈遞，同時可以招募免疫細胞，誘導較強的體液免疫和細胞免疫[20]。腺病毒載體疫苗可在體內(nèi)高效表達外源基因。由于受體廣泛表達于多種細胞，腺病毒可以感染大多數(shù)類型的細胞，同時由于抗載體免疫反應，腺病毒難以持續(xù)存在于人體，提高了安全性[21]。核酸疫苗是一種新型疫苗形式，mRNA疫苗僅在細胞內(nèi)短暫表達目標抗原后即被降解，沒有整合風險，可以誘導更為均衡的體液免疫和細胞免疫，近年來得到了快速的發(fā)展[22]。新冠疫苗首次將mRNA疫苗技術(shù)應用于人體，免疫持續(xù)時間和長期安全性尚待進一步觀察。

2 疫苗有效性

2.1 突變毒株對疫苗的影響 在COVID-19大流行中，2020年2月即出現(xiàn)突變株D614G，此突變株在感染、復制上具有更高的效率，且保持了與原始毒株相似的致病力，很快成為主要流行毒株。之后SARS-CoV-2在多個地區(qū)發(fā)生了多種適應性突變，如首次在英國發(fā)現(xiàn)的B.1.1.7突變株，在南非發(fā)現(xiàn)的B.1.351突變株和在巴西發(fā)現(xiàn)的P.1突變株[23]。這三種突變株都在S蛋白RBD區(qū)域產(chǎn)生了突變，其中，N501Y突變存在于三種毒株上。RBD區(qū)域的突變提高了SARS-CoV-2對ACE2的親和力，同時這些突變降低了針對突變位點的中和抗體結(jié)合能力，可能對疫苗的預防效果和單克隆抗體的治療效果產(chǎn)生不利影響[24]。B.1.1.7突變株在S蛋白上有9個氨基酸突變，其傳染性較英國第一波疫情毒株升高了30%～60%，給公共衛(wèi)生防治措施帶來了更大挑戰(zhàn)。突變株的致病性也可能產(chǎn)生變化，有研究表明B.1.1.7突變株可能導致更嚴重的癥狀和更高的致死率[25]?；謴驼哐鍖.1.1.7突變株和B.1.351突變株的中和能力均出現(xiàn)下降，對B.1.351突變株的中和滴度降低更明顯，且出現(xiàn)癥狀后8個月患者血清中和效果明顯低于出現(xiàn)癥狀早期(5～33 d)患者血清中和滴度，8個月后對B.1.1.7突變株和B.1.351突變株分別有40%或90%患者血清中和滴度低于閾值[26]。 新冠疫苗對幾種主要流行突變株的效力見表1。

表1 新冠疫苗有效性數(shù)據(jù)

Muik等[41]通過假病毒中和實驗，檢測BNT162b2 加強免疫21 d后受試者血清對B.1.1.7突變株的中和滴度為原始毒株的79%，沒有明顯降低。Shen等[34]對比恢復者血清、mRNA-1273免疫血清、NVX-CoV2373免疫血清、多種靶向RBD的單克隆抗體對B.1.1.7突變株和早期突變株D614G的中和能力，發(fā)現(xiàn)雖然疫苗免疫后血清仍然可以中和B.1.1.7突變株和D614G，但中和能力下降。與D614G株相比，疫苗接種者血清對于B.1.1.7突變株半數(shù)抑制稀釋度ID50平均降低了50%以上。具體來說，對于D614G株與B.1.1.7突變株ID50比值，mRNA-1273免疫后血清比值范圍為0.36～8.62，NVX-CoV2373免疫血清ID50比值范圍從0.85至20以上，大部分血清樣本對B.1.1.7突變株ID50均出現(xiàn)不同程度下降。而不同的單克隆抗體受到的影響不同，其半數(shù)抑制濃度IC50從基本不變到升高10倍以上，提示突變株對部分單克隆抗體有更顯著的逃逸。Tada 等[42]發(fā)現(xiàn)BNT162b2免疫后血清對在英國，南非，美國，歐洲分離的SARS-CoV-2突變株都具有中和能力。血清對B.1.1.7突變株的中和滴度與早期毒株D614G相似，對B.1.351突變株中和滴度降低至33%，但仍然高于恢復者血清平均滴度。檢測SARS-CoV-2自然感染或疫苗接種后血清對B.1.1.7突變株的有效性，發(fā)現(xiàn)其更難被中和，進一步研究發(fā)現(xiàn)，N501Y突變影響了抗體輕鏈與S蛋白的結(jié)合[43]。通過向S蛋白NTD區(qū)域引入缺失或?qū)BD區(qū)域替換為突變株對應區(qū)域，再測試抗體與其結(jié)合能力，研究發(fā)現(xiàn)RBD區(qū)域發(fā)生的突變對血清抗體中和能力的影響大于NTD區(qū)域的突變[30]。

B.1.351突變株S蛋白有10個氨基酸突變，集中分布于NTD和RBD區(qū)域，其中E484K突變被證明可降低抗體對病毒的中和能力，SARS-CoV-2感染恢復者血清對B.1.351突變株中和能力也顯著降低[44]。比較感染早期毒株或B.1.1.7突變株恢復者血清、AZD1222免疫血清、BNT162b2免疫血清和多種單克隆抗體對B.1.351突變株和早期毒株Victoria株的中和能力：中和滴度與Victoria株相比，早期恢復者血清平均下降93%，B.1.1.7突變株恢復者血清下降近70%，AZD1222免疫血清近下降90%，而BNT162b2免疫血清下降87%，20種單抗中的14種中和滴度降低90%以上[45]。另一項研究中，BNT162b2免疫血清和mRNA-1273免疫血清對B.1.1.7突變株的中和活性分別降低了90%和92%[46]。在南非進行的臨床試驗中，由于南非的主要流行毒株為B.1.351突變株，NVX-CoV2373疫苗的有效性低至49.9%，在排除了HIV陽性受試者后，有效性為60%，而在流行毒株為B.1.1.7的英國進行臨床試驗時，NVX-CoV2373有效性為89.3%[35]。

一項研究測試了新冠滅活疫苗BBIBP-CorV 加強免疫28 d后受試者血清和重組疫苗ZF2001接種第3劑14 d后受試者血清對B.1.351突變株的中和滴度，與原始毒株相比，中和滴度僅降低了33%～38%[47]。由于全病毒滅活疫苗采用SARS-CoV-2活病毒滅活純化后制成，除病毒主要抗原S蛋白外還含有核蛋白N、膜蛋白M和包膜蛋白E等病毒多種結(jié)構(gòu)蛋白，這些結(jié)構(gòu)蛋白的加入可能有利于誘導機體產(chǎn)生針對新冠病毒多種蛋白的抗體，從而減輕病毒突變對疫苗保護效果的影響。

2.2 疫苗在高風險人群中的使用 SARS-CoV-2感染的高風險人群包括從事醫(yī)療、物流、檢疫工作，以及在機場、港口等人員流動大，物資運輸頻繁區(qū)域工作的人員，以上人群有更高概率接觸并感染SARS-CoV-2。對高危人群的優(yōu)先接種可以在感染高風險場所建立第一道免疫屏障。

孕婦同樣是高風險人群，嚴重的SARS-CoV-2感染可導致孕婦妊娠期高血壓、產(chǎn)后出血和早產(chǎn)等風險因素升高，孕婦感染后有更高的重癥和機械通氣率[48]。盡管孕婦面臨更高的風險，在早先大部分臨床試驗中卻并未包括該人群，對此人群的臨床試驗正待開展。一項針對接種BNT162b2或mRNA-1273疫苗孕婦的早期安全性研究中由于缺乏合適的對照，使得研究數(shù)據(jù)無法說明疫苗的安全性，需要更長時間的追蹤和更大的樣本量[49]。

另外，60歲以上老年人、患基礎(chǔ)疾病人群和免疫抑制人群同樣屬于高風險人群，此高危人群由于免疫力下降，更易感染SARS-CoV-2，且感染后更容易發(fā)展成為重癥病例，需優(yōu)先考慮對該人群的保護。老年人由于代謝能力下降，持續(xù)提供刺激的免疫因子發(fā)生改變等而產(chǎn)生免疫衰退，固有免疫和適應性免疫反應均下降，且在SARS-CoV-2感染后產(chǎn)生更多炎癥因子。受到固有免疫刺激時，老年人的單核細胞更少產(chǎn)生IFN-α、IFN-γ和IL-1β等細胞因子，但會高表達TNF和CXCL8等炎癥基因，進而激活NF-κB、炎癥小體和MAPK信號通路[50]?；A(chǔ)疾病如心腦血管疾病、糖尿病、高血壓等會顯著干擾人體免疫功能。糖尿病患者在感染SARS-CoV-2后，住院和死亡風險更高，在重癥和死亡病例中，男性和低收入者比例較高[51]。一項包括230項美國新冠臨床試驗的橫斷面調(diào)查[52]顯示，臨床試驗尤其是III期臨床試驗常存在受試者老年人群比例過低，不能有效反映真實人口學數(shù)據(jù)。而現(xiàn)有新冠疫苗III期臨床試驗數(shù)據(jù)也存在部分人群樣本量不足，導致統(tǒng)計效能不足，數(shù)據(jù)變異增大(見表1)。BNT162b2在16～55歲人群中保護率達95.6%，>55歲人群保護率93.7%，≥65歲人群保護率94.7%，但隨著人群年齡段升高，亞組人數(shù)明顯減少，統(tǒng)計學效力下降[29]。BNT162b2在以色列進行大規(guī)模接種后的研究納入了更多受試者，70～79歲人群疫苗接種組和對照組均超過5萬人，80歲以上人群各組也超過2萬人，且研究包含較多高風險人群，如心臟病，肥胖，2型糖尿病等，而結(jié)果顯示接種兩劑疫苗7 d后在各人群中均表現(xiàn)出較好保護效果[31]。 免疫抑制人群，如HIV感染者，由于免疫系統(tǒng)受到不同程度的損害，在感染SARS-CoV-2后可能出現(xiàn)較其他人群更為嚴重的臨床癥狀。但有研究發(fā)現(xiàn)疾病得到較好控制的HIV感染者出現(xiàn)嚴重癥狀的可能性并不高于其他人群[53]。在多個疫苗的臨床試驗中都包含部分高危人群，但總量較少，難以達到具有統(tǒng)計學意義的受試人數(shù)。這一人群對部分疫苗的不良反應發(fā)生率較其他人群高，在疫苗上市使用時，這些人群可能不符合疫苗接種條件而無法獲得直接保護。針對這一問題，一方面可以通過盡量提高符合疫苗接種條件人群的接種率來提高整體人群的接種率，起到間接保護的效果；另一方面應及時開展疫苗在老年人、患基礎(chǔ)疾病人群、孕婦和免疫抑制人群中的臨床試驗，獲得疫苗在這一人群中的免疫原性和安全性數(shù)據(jù)，通過增加此類人群的樣本量，獲得現(xiàn)有疫苗更為有效的數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)可以指導疫苗在該人群中的科學使用，幫助確定適合此類人群的疫苗類型、劑量和免疫程序等。

研究指出，感染SARS-CoV-2恢復后感染者體內(nèi)靶向S蛋白的IgG抗體水平可以穩(wěn)定6個月以上，6個月時S蛋白特異的記憶B細胞數(shù)量多于感染后1個月，特異性CD4+和CD8+T細胞半衰期約3～5個月[54]。在一項探索延長AZD1222兩劑接種間隔時間的研究中，間隔6周內(nèi)疫苗保護率為55.1%，9～11周為72.2%，12周以上為80.0%，首劑標準劑量疫苗接種后22～90 d保護率為76.0%，但尚無首劑接種3個月后的數(shù)據(jù)[55]。

3 結(jié)語

目前，已有多個疫苗III期臨床試驗數(shù)據(jù)發(fā)表，同時在多個國家與地區(qū)投入使用。但這些臨床試驗入組人群通常不包括孕婦，包含較少的老年人群，進行亞組分析時由于樣本量較少使得統(tǒng)計效能下降，無法準確評估疫苗在真實世界中的保護效果。SARS-CoV-2的廣泛傳播也使得病毒突變更為常見，對疫苗的有效性提出了挑戰(zhàn)[56-57]。此外，疫苗保護效果的持續(xù)時間，病毒不同位點突變對疫苗效果的影響等問題都缺乏相應數(shù)據(jù)和研究。進一步探究突變位點與抗體中和、免疫識別和疫苗實際保護效果間的關(guān)系，持續(xù)監(jiān)測突變毒株對疫苗效力的影響，闡釋臨床指標與疫苗效力的聯(lián)系可以更好地應對持續(xù)的大流行。