亮 亮，咱呷拉姆，曲 擁，何國(guó)琳,徐立彥

(1.甘孜藏族自治州人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，康定 626000；2.甘孜藏族自治州石渠縣人民醫(yī)院，石渠 627350；3.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院產(chǎn)科，成都 610041)

妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorders complicating pregnancy，HDCP)是孕產(chǎn)婦常見(jiàn)疾病，在我國(guó)的患病率約為7.6%，并呈現(xiàn)北方高于南方[1]，高海拔地區(qū)高于低海拔地區(qū)等地域分布特點(diǎn)[2]。HDCP易引發(fā)早產(chǎn)、胎盤(pán)早剝、產(chǎn)后出血、新生兒窒息等多種不良妊娠結(jié)局和溶血、肝腎功能不全等危急重癥[3]，是孕產(chǎn)婦和胎兒死亡的重要原因之一[4]。HDCP中妊娠期高血壓及子癇前期-子癇是妊娠期特發(fā)的產(chǎn)科并發(fā)癥。該病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前大部分研究認(rèn)為涉及胎盤(pán)缺血缺氧、子宮螺旋小動(dòng)脈重鑄不足、炎癥免疫過(guò)度激活和氧化應(yīng)激反應(yīng)、血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、遺傳因素，營(yíng)養(yǎng)缺乏等多種因素和多種機(jī)制[2,5]，難以實(shí)施精準(zhǔn)化防治。

microRNAs(miRNAs)是由長(zhǎng)度約18～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA組成，廣泛參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖、凋亡等生理和病理生理過(guò)程[6]。目前研究發(fā)現(xiàn),miR-301b-3p可促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化及侵襲，與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[7-11]。HDCP尤其是PE發(fā)生的病理基礎(chǔ)是滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲不足，導(dǎo)致胎盤(pán)淺著床，出現(xiàn)相應(yīng)的臨床表型。先前多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)miRNA，包括miR-15/16及miR-424等在胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞著床過(guò)程中發(fā)揮重要作用。還有研究發(fā)現(xiàn)，miR-301b-3p與血管收縮、高血壓相關(guān)[12]，推測(cè)miR-301b-3p可能與HDCP有關(guān)。甘孜州海拔平均3500米，大部分孕婦處于高凝狀態(tài)及輕度缺氧，發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于平原地區(qū)孕婦。本研究通過(guò)檢測(cè)miR-301b-3p在高原地區(qū)正常孕婦及HDCP患者間的表達(dá)，探討miR-301b-3p是否與HDCP發(fā)生有關(guān)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年1月至12月在甘孜藏族自治州人民醫(yī)院住院治療的單胎妊娠且尚未分娩發(fā)動(dòng)的25例妊娠期高血壓(pregnancy induced hypertension，PIH)患者、40例PE患者，并以同期住院?jiǎn)翁ト焉锴疑形捶置浒l(fā)動(dòng)的40例藏族正常晚期妊娠孕婦為正常對(duì)照。HDCP各亞型診斷標(biāo)準(zhǔn)參考妊娠期高血壓疾病診治指南(2020)[4]。排除標(biāo)準(zhǔn)：多胎妊娠，合并存在糖尿病、自身免疫性疾病、慢性腎臟病、感染或傳染性疾病、甲狀腺疾病、腫瘤、血液系統(tǒng)疾病，前置胎盤(pán)、胎盤(pán)早剝等產(chǎn)科并發(fā)癥。記錄研究對(duì)象的年齡、居住地區(qū)、體重、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、孕齡、月經(jīng)史、孕產(chǎn)史、家族史、血常規(guī)、尿蛋白、腎功能、血脂分析等臨床信息。研究對(duì)象均為甘孜籍藏族人群，常年居住于甘孜地區(qū)。

1.2 標(biāo)本采集 抽取空腹肘靜脈血10mL，于EDTA-K2抗凝管中靜置30min，4℃、3000r/min離心10min，提取上清至EP管，4℃、16000g/min離心10min，將上清提取至EP管并保存于-80℃待檢。

1.3 血漿總RNA提取 采用TaqMan miRNA ABC分離純化試劑盒(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))提取血漿miRNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度(absorbance，A)260nm和A280nm的比值，將A260nm/A280nm在1.8～2.1的樣本用于miR-301b-3p檢測(cè)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-301b-3p及內(nèi)參U6表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)試劑盒(GeneCopoeia公司，廣州)檢測(cè)miR-301b-3p表達(dá)，具體操作參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。以U6為內(nèi)參，采用2-△△CT方法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 PE組、PIH組和正常妊娠組的基本臨床資料比較 3組間年齡、孕周、白細(xì)胞、血紅蛋白比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3組間SBP、DBP、24h尿蛋白、D-二聚體、纖維蛋白原(Fib)、Scr等相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SBP、24h尿蛋白、D-二聚體水平從正常妊娠組、PIH組至PE組呈現(xiàn)依次升高趨勢(shì)(P<0.05)；PE組和PIH組的DBP、SCr、Fib等水平高于正常妊娠組(P<0.05)，PE組PLT水平低于正常妊娠組。見(jiàn)表1。

2.2 PE組、PIH組和正常妊娠組的血漿miR-301b-3p表達(dá)差異 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示,PE組患者血漿miR-301b-3p表達(dá)顯著低于正常妊娠組和PIH組(P<0.01)，妊娠期高血壓組與正常對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ROC曲線結(jié)果表明，miR-301b-3p對(duì)于排除PE具有較好的診斷價(jià)值(P<0.001)，AUC=0.860，約登指數(shù)最大為0.578，敏感度和特異度分別為95.0%和70.8%,見(jiàn)圖1。

圖1 子癇前期組、PIH組和正常妊娠組血漿miR-301b-3p表達(dá)和ROC曲線

2.3 發(fā)作與未發(fā)作PE患者血漿miR-301b-3p表達(dá) 40例PE患者中，9例患者子癇發(fā)作(eclamptic seizures，ES)。發(fā)作子癇患者的miR-301-3p表達(dá)明顯低于未發(fā)作者(non eclamptic seizures，Non-ES)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖2)。

圖2 子癇發(fā)作與未發(fā)作的PE患者血漿miR-301b-3p的表達(dá)變化

2.4 miR-301-3p表達(dá)與臨床指標(biāo)相關(guān)性 miR-301-3p表達(dá)與SBP、DBP、24h尿蛋白評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.721,r=-0.672,r=-0.871,P<0.001)，與D-二聚體水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.308,P=0.018)。

3 討 論

隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步和居民健康意識(shí)的提高，HDCP的發(fā)病率在平原地區(qū)得到了顯著改善，但在高原地區(qū)仍居高不下[2]。由于高海拔地區(qū)氧氣稀薄、氣候寒冷、膳食結(jié)構(gòu)以高動(dòng)物脂肪和高熱量的食物為主，導(dǎo)致了高原人血液具有“濃、黏、聚、凝”的特點(diǎn)。高原地區(qū)孕婦血液黏度明顯增高，心腦血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)大為增加。甘孜州孕婦有多產(chǎn)習(xí)俗，且經(jīng)濟(jì)衛(wèi)生條件落后，文化程度低，健康意識(shí)薄弱等[2,13-14]，導(dǎo)致嚴(yán)重妊娠并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)大大增加。本研究納入的是居住在海拔4000米以上的藏區(qū)孕婦，其HDCP發(fā)生率明顯高于平原地區(qū)，且病情更為嚴(yán)重，因此找到可預(yù)測(cè)疾病發(fā)生或嚴(yán)重程度的標(biāo)記物意義重大。

最近研究通過(guò)miRNA芯片技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miRNA-301b是PE患者血漿中顯著下調(diào)表達(dá)的miRNA之一[15]，但是其對(duì)PE的具體影響尚無(wú)研究。本研究發(fā)現(xiàn)，高原藏族PE患者血漿中miR-301b-3p表達(dá)顯著低于正常妊娠組和PIH組，與上述研究結(jié)果一致，表明血漿miR-301b-3p的分布不受人群民族、高原地域的影響；HDCP組與正常組相比，血漿miR-301b-3p分布呈下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與HDCP組樣本量較少有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，發(fā)生ES的PE患者血漿miR-301b-3p水平顯著低于Non-ES的PE患者，提示血漿miR-301b-3p表達(dá)水平與PE患者是否發(fā)生ES密切相關(guān)。表明血漿中低miR-301b-3p水平與PE的發(fā)生有關(guān)。本研究相關(guān)性分析顯示，PE患者血漿miR-301-3p表達(dá)與SBP、DBP、24h尿蛋白評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.001)，與D-二聚體呈負(fù)相關(guān)(P=0.018)。提示血漿miR-301-3p表達(dá)可作為PE患者嚴(yán)重程度的潛在標(biāo)志。

本研究中ROC曲線結(jié)果提示，miR-301b-3p在PE的診斷和預(yù)測(cè)價(jià)值中的敏感度和特異性分別為95.0%和70.8%。推測(cè)miR-301b-3p可能是PE的一個(gè)預(yù)測(cè)因子。這有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量做隊(duì)列研究，驗(yàn)證PE患者發(fā)病之前是否已出現(xiàn)miR-301b-3p表達(dá)異常降低。

研究發(fā)現(xiàn)，缺氧相關(guān)miR-301b可能通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)在細(xì)胞增長(zhǎng)、減少凋亡、調(diào)節(jié)血管生成、促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤(rùn)重塑螺旋小動(dòng)脈的過(guò)程與腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲過(guò)程非常相似，因此缺氧反應(yīng)性miR-301b可能參與了HDCP的發(fā)生發(fā)展。另有研究提出，細(xì)菌感染時(shí)miR-301b作為炎癥平衡因子參與炎癥應(yīng)答，或miR-301b可能通過(guò)介導(dǎo)炎癥介質(zhì)異常分泌導(dǎo)致HDCP的發(fā)生[16]。

綜上所述，血漿miR-301-3p表達(dá)與PE的發(fā)生及病情進(jìn)展有關(guān)。但本研究還存在局限，如樣本量相對(duì)少，仍需擴(kuò)大樣本量對(duì)本研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證；現(xiàn)有關(guān)于miR-301b-3p的研究主要集中于腫瘤領(lǐng)域，對(duì)miR-301b-3p參與調(diào)控PE的機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步探討。